MYC诱导的谷氨酰胺分解代谢重编程支持最佳病毒复制

腺病毒感染改变宿主细胞谷氨酰胺的利用

为了表征MYC在腺病毒感染期间引起的谷氨酰胺代谢变化，NHBE细胞被U标记-¹³C类₅-谷氨酰胺和模拟物感染或感染AD WT或AD ORF1 D68A的多重感染（MOI）为1。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）提取并分析了20次标记后和感染后的代谢物。AD WT感染，而不是AD ORF1 D68A感染（MYC激活缺陷），相对于模拟感染的细胞，增加了细胞内M5异拓扑标记的（五碳标记的）谷氨酸的百分比，这与腺病毒感染期间GLS催化的谷氨酰胺转化为谷氨酸的MYC激活依赖性增加一致(补充图1b、c). AD WT感染，而不是AD ORF1 D68A感染，也会增加M5标记的α-酮戊二酸的百分比(补充图1b、c). 通常，氧化柠檬酸循环的活性导致标记有U的细胞中M4标记的TCA循环中间产物水平升高-¹³C类₅-谷氨酰胺(补充图1b). 然而，NHBE细胞的AD WT感染导致M4标记的富马酸、苹果酸、天冬氨酸和柠檬酸的减少(补充图1c、d). 相反，AD WT感染，而不是AD ORF1 D68A感染，会增加M5标记的柠檬酸盐、M3标记的富马酸盐、M2标记的苹果酸盐和M3标记为天冬氨酸的水平(图2a、b,补充图1d). 来自U的TCA循环中间产物的这种标记模式-¹³C类₅-谷氨酰胺代谢表明腺病毒感染后MYC依赖性的还原羧基化增加12.

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图2

腺病毒感染以MYC激活依赖的方式改变宿主细胞谷氨酰胺的利用。

NHBE细胞用U标记-¹³C类₅-谷氨酰胺和模拟物在MOI为1时感染或感染AD WT或AD ORF1 D68A。感染后24小时，提取细胞内代谢物并用LC-MS/MS进行分析(一)追踪命运的示意图¹³U中的C原子-¹³C类₅-谷氨酰胺还原羧基化。(b条)百分比¹³还原羧基化中间体的C标记同位素。(c（c）)百分比¹³C-标记的氨基酸等位异构体。(d日)非必需氨基酸和必需氨基酸的相对水平。(e（电子）)百分比¹³己糖生物合成途径中中间体的C-标记M2同位素。(（f）)己糖生物合成途径中间体的相对水平。对于(b条–（f）)，误差条表示标准差(n个=3), *P（P）<0.05; **P（P）<0.01. 学生的t吨-测试。

为了确定腺病毒感染后参与还原羧基化的酶的转录是否增加，我们对几种已被证明能介导还原性谷氨酰胺代谢的酶进行了实时定量PCR12,13,14我们检测到异柠檬酸脱氢酶1和2的转录水平增加(印尼盾1和IDH2公司)，烟酰胺核苷酸转氢酶(NNT公司)，丙酮酸脱氢酶激酶同工酶1(PDK1系列)和谷氨酸-草酰乙酸转氨酶2(获得2)在感染AD WT后8小时的宿主细胞中，但在感染AD ORF1 D68A的细胞中没有(补充图1e). 这些数据支持一个模型，即腺病毒诱导的MYC活化通过感染期间参与还原羧基化的酶的转录上调增加宿主细胞还原性谷氨酰胺代谢(补充图2).

由于细胞利用谷氨酰胺生成非必需氨基酸并输入必需和非必需氨基酸，我们评估了腺病毒感染对U标记NHBE细胞内氨基酸库丰度和标记模式的影响-¹³C类₅-谷氨酰胺并感染AD WT或AD ORF1 D68A。除了前面描述的细胞内M5标记的谷氨酸百分比增加外(图2c和补充图1c)，AD WT感染，但不是AD ORF1 D68A感染，也会导致M5标记的脯氨酸、M3标记的天门冬酰胺和M3标记天门冬氨酸升高(图2c). 值得注意的是，与AD ORF1 D68A感染相比，AD WT感染还导致NHBE细胞内必需和非必需氨基酸水平的增加，天冬酰胺除外(图2d). AD ORF1 D68A感染细胞中天冬酰胺水平的升高可能反映了与腺病毒感染细胞中其他氨基酸相比天冬酰胺的不同调节或使用。与大多数氨基酸细胞内水平的增加一致，我们发现ASCT2型和拉丁美洲T1以及利用谷氨酰胺作为氨基酸吸收交换因子的转运体ASCT2的蛋白质水平三在AD WT感染细胞中显著升高，但在AD ORF1 D68A感染细胞中不升高(图1d和补充图1a)表明MYC依赖于谷氨酰胺交换对氨基酸摄取的调节。

由于谷氨酰胺可以通过提供氮原子将果糖-6-磷酸转化为葡糖胺-6-磷酸，以及通过提供碳原子从柠檬酸生产乙酰-CoA将葡糖胺-6-磷酸转换为GlcNAc-6-磷酸，从而促进己糖胺的生物合成途径，我们检测了用U标记的NHBE细胞中己糖途径中间产物的水平和标记模式-¹³C类₅-谷氨酰胺和使用LC-MS/MS感染AD WT或AD ORF1 D68A。AD WT感染，但不是AD ORF1 D 68A感染，导致M2标记的GlcNAc-6P/GlcNAc-1P和M2标记UDP-GlcNAc水平升高(图2e). AD WT感染还导致己糖途径中间产物的细胞内池大小增加(图2f)以及己糖胺生物合成途径酶（包括己糖激酶2（HK2））转录水平的增加6，谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶1（GFAT1），由GFPT1型基因和N个-乙酰葡糖胺激酶（NAGK）显著高于AD ORF1 D68A感染(补充图3a). 这些发现表明，在腺病毒感染期间，己糖胺生物合成发生了依赖MYC的变化。

GLS活性促进腺病毒最佳复制

因为我们观察到腺病毒感染期间谷氨酰胺的利用增加，所以我们假设谷氨酰胺的摄入可能对腺病毒的最佳复制至关重要。为了验证这一假设，我们评估了外源性谷氨酰胺剥夺对原代NHBE细胞中腺病毒复制的影响。如所示图3a，与存在2.5 mM谷氨酰胺的复制相比，不含谷氨酰胺的AD WT复制减少了60倍。由于我们观察到AD WT感染细胞中GLS活性增加，这是通过增加转化率来判断的¹³C类₅-谷氨酰胺¹³C类₅-谷氨酸盐(图2c)，我们假设GLS活性可能对腺病毒复制很重要。为了验证这一假设，我们首先通过shRNA介导的GLS敲除降低腺病毒感染的原代NHBE细胞中GLS的活性(图3b;补充图5c). GLS敲除降低模拟感染细胞和AD WT感染细胞的谷氨酰胺消耗率(图3b;补充图5c)在表达干扰shRNA控制的细胞中，与AD WT复制相比，AD WT的复制减少了25倍(图3c). 这些数据表明，谷氨酰胺的消耗和谷氨酰胺通过GLS活性转化为谷氨酸有助于腺病毒在原代NHBE细胞中的最佳复制。

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图3

谷氨酰胺消耗和GLS活性对优化腺病毒复制至关重要。

(一)NHBE细胞在存在（+Q）或不存在（−Q）2.5 mM谷氨酰胺的情况下，以1的MOI感染AD WT。在感染后24小时，采集子代病毒，并使用TCID测定感染病毒滴度₅₀终点稀释斑块分析。(b条)（底部）模拟感染或AD WT感染24小时后稳定表达干扰shRNA（shCTR，蓝条）或GLS shRNA（shGLS，红条）的NHBE细胞的谷氨酰胺消耗率（底部）。（上图）免疫印迹法显示稳定表达干扰shRNA（shCTR）或GLS shRNA（sh GLS）的NHBE细胞中GLS剪接亚型KGA和GAC的水平。(c（c）)用AD WT感染24小时后，从稳定表达shCTRL或shGLS的NHBE细胞中收集子代病毒，并按以下方法测定腺病毒滴度：(一). (d日)用1.0μM CB-839或DMSO处理NHBE细胞，模拟感染或感染AD WT。在处理和感染后24 h测量谷氨酰胺消耗率。(e（电子）)用二甲基亚砜或1.0μM CB-839处理的NHBE细胞，在AD WT感染24小时后，从中获取子代病毒，并按照(一). 对于(一–e（电子）)，误差条表示标准差(n个=3), **P（P）<0.01. 学生的t吨-测试。

由于GLS敲除降低了腺病毒的复制，我们假设GLS的药物抑制也可能限制子代病毒的生成。以前对痘苗病毒（vaccinia virus，VACV）的研究表明，用小分子GLS抑制剂双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,3,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚（BPTES）治疗VACV感染的细胞，与缺乏谷氨酰胺的细胞相似，可降低病毒产量15然而，BPTES的临床应用受到限制，因为其效力适中，代谢稳定性差，溶解度低16另一种小分子GLS抑制剂CB-839目前正在接受一期评估，用于治疗实体肿瘤和血液恶性肿瘤患者，与BPTES不同的是，它是口服生物利用的，对GLS的两种剪接亚型具有低纳米级效力。CB-839先前已被证明能降低三阴性乳腺癌细胞系和异种移植模型的增殖，与其他乳腺癌细胞株相比，这些细胞对细胞外谷氨酰胺的依赖性更强16因此，我们测试了CB-839对NHBE细胞中谷氨酰胺消耗率和腺病毒复制的影响。如所示图3d用1.0μM CB839处理NHBE细胞可显著降低细胞谷氨酰胺消耗率，并阻止腺病毒感染引起的谷氨酰胺消耗速率增加。重要的是，与二甲基亚砜（DMSO）处理细胞中AD WT复制相比，CB-839处理显著减少了80倍AD WT的复制(图3e). 这些数据表明，CB-839有效地减少了原代NHBE细胞中腺病毒的复制。

病毒

H5wt300（AD5 WT）由Frank McCormick博士的实验室提供。AD D68A是通过将E4区域亚克隆到pBluescript（SpeI-BamHI片段）中，然后执行定点突变，然后重新插入pAd5而获得的。突变病毒在W162细胞系上繁殖，该细胞系含有并表达E4区。图中显示了37°C时宿主细胞的感染时间，每个细胞有10个PFU。

谷氨酰胺消耗率的测量

使用Nova Biomedical Bioprofile基本分析仪测量细胞谷氨酰胺消耗率。简单地说，细胞以70%的合流率接种在10 cm的平板中，以确保在细胞处于亚合流状态时进行测量。种子接种后24小时，所有细胞的培养基均被刷新，并将培养基添加到10cm平板中，无细胞作为空白对照。培养24小时后，从每个样品和空白对照中取出1 ml培养基，并在Nova Bioprofile分析仪中分析培养基样品。使用Coulter粒子分析仪测定细胞数。

代谢物提取和代谢组学分析

细胞在含有2.5 mM U的培养基中培养-¹³C类₅-谷氨酰胺24小时。第二天，用冷的150 mM醋酸铵（NH4AcO）冲洗NHBE细胞。在800μl 50%冰镇甲醇中小心刮去细胞。将10 nmol去甲缬氨酸的内标物加入细胞悬浮液中，然后加入400μl冷氯仿。将水层转移到玻璃瓶中，并在真空下干燥代谢物。将代谢物重新悬浮在50μl 70%ACN和5μl该溶液中，用于质谱分析。分析是在与UltiMate 3000RSLC（Thermo Scientific）UHPLC系统耦合的Q Exactive（Thermo-Scientic）上进行的。流动相A为5 mM NH4AcO，pH 9.9，B）为ACN，分离在Luna 3u NH2 100A（150×2.0 mM）（Phenomenex）柱上实现。流量保持在200μl min⁻¹梯度在18分钟内从15%A到95%A，然后等速步长9分钟，再平衡7分钟。我们使用TraceFinder 3.1（Thermo Scientific）软件根据保留时间和准确质量（≤3 p.p.m.）检测并量化代谢物为曲线下面积（AUC）。

计算不同条件下代谢物的相对量以及标记百分比，并用条形图表示。

定量实时PCR

用Qiagen RNeasy试剂盒纯化RNA。按照制造商的说明，使用1μg总RNA，使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）合成cDNA。使用SYBR Green I Master Mix（Roche）和0.5μmol l⁻¹引物。相对表达值归一化为控制基因（RPL32或RPLP0），并以线性相对mRNA值表示。使用以下引物序列：5′-AGAATGTACTTGCAGG-3′和5′CACCATGGTTCTCT-3′Asct2公司，5′-GGCCTCATCGCAGTACT-3′和5′ACGCTGTAGCAGTTCACGG-3′用于纬度1，5′-CTTTGGGTTCCCGTCACTTG-3′和5′GTCGTCATGCTTATGGGAT-3′用于同上1，5′-TGAACTGCCCAGATATACGG-3′和5′CTGACAGCCCCACCCTC-3′用于同上2，5′-CACATTAAGCTGCTGACCAGGCA-3′和5′AGCTCAACCCATGCTGCTG-3′用于编号，5′-GGGGTTCAACACGAGGTC-3′和5′CGCTGGGTAATGAGGATTTG-3′用于预测值k1，和5′-AAGGGAGGGTGGAATACAT-3′，5′AATGTTTGCCTCTCGCCAATC-3′用于得到2，5′-TCGCTCGTTCGAGGAACAT-3′和5′CACCGAAGCTGTGTG-3′用于Gfpt1和5′-AGGGGTGGATCTCTGGTA-3′和5′GGCATCGGTGGTGAATTAAGT-3′用于纳克。

腺病毒检测

在谷氨酰胺提取样品中，在腺病毒感染前24小时，NHBE细胞在亚融合状态下被培养，培养基被切换到含有或不含谷氨酰胺/丙酮酸的DMEM/F12培养基。在药物治疗样品中，细胞在腺病毒感染前用1.0μM CB-839（从Calithera Biosciences，Inc.获得）或DMSO预处理3小时。细胞以1的MOI感染腺病毒72小时。通过上下移液管从整个培养皿中收集细胞，收集在锥形管中，并在3000转/分下旋转10分钟。用100μl 10 mM Tris pH 7.4重新悬浮颗粒。细胞通过冷冻、解冻和剧烈旋转进行溶解。上清液保存为病毒库存，用于病毒滴定分析。使用50%组织培养感染剂量（TCID50）测量感染病毒滴度。该终点稀释分析量化了50%接种的组织培养细胞中产生细胞病变效应所需的病毒量。在96孔板中，HeLa细胞以每孔2500个细胞的速度进行培养，然后感染10倍稀释的病毒。将稀释的病毒储备添加到10个重复的细胞中，并在感染后5天手动观察和记录每次病毒稀释的细胞病变效果。结果用于数学计算TCID₅₀结果。

单纯疱疹1分析

HSV-1菌株17+株系通过感染Vero细胞产生，MOI为0.05 PFU/细胞。人包皮成纤维细胞和Vero细胞在含有10%胎牛血清、补充青霉素和链霉素的Eagle培养基（DMEM）的完全Dulbecco改良液中培养。将HFF细胞用1.25μM CB-839预处理3 h，然后以0.01的MOI感染HSV-1病毒，无论是否存在1.25μM CB839，或者在谷氨酰胺停药的情况下，在DMEM培养基中不存在L（左）-谷氨酰胺和不含丙酮酸。感染后72小时采集含有病毒的上清液，并通过菌斑试验进行滴定。在覆盖有1%甲基纤维素的Vero细胞单层中进行菌斑分析。

甲型流感化验

NHBE细胞在亚融合状态下培养。用1.0μM CB-839或DMSO对照预处理细胞3小时，然后以1的MOI感染流感病毒（H1N1/WSN/33），无论是否存在1.0μM的CB-839。感染后24小时收集含有病毒的上清液，并用A549细胞检测TCID50。

微RNA分析

使用qScript microRNA cDNA合成试剂盒（Quanta Biosciences）定量microRNA。简言之，使用Qiagen-miRNeasy Mini Kit（Qiagen）在指定时间从100 mm板模拟感染或感染Ad WT或Ad D68A的亚流NHBE细胞制备富集miRNA。miRNAs首先在poly（a）聚合酶反应中进行聚腺苷化，然后使用寡核苷酸适配器引物使用第一链cDNA合成反应混合物反转录成cDNA。使用200 nM的每个PerfeCTA microRNA分析引物（hsa-miR23a-3p和hsamiR23b-3p）和PerfeCTA-Universal primer进行实时SYBR Green qRT-PCR。在Roche LightCycler 480上进行定量PCR。相对值根据小核仁RNA SNORD43进行标准化，并与模拟感染样本进行比较。

我们感谢Calithera Biosciences，Inc.的Susan Demo和Frank Parlati对手稿的有益讨论和评论。我们感谢Carolina Espindola提供的技术援助。我们感谢Milica Momcilovic和David B.Shackelford在解决评审员关注的问题方面提供的技术援助和反馈。S.K.T.是加州大学洛杉矶分校肿瘤免疫学培训基金（USHHS Ruth L.Kirschstein Institutional National Research Service Award#T32 CA009056）资助的博士前研究员，由NIH NIGMS培训基金GM08042和医学科学家培训计划资助。H.R.C.由NIH董事新创新者奖（DP2 OD008454-01）资助。