病因学。作者手稿；PMC 2016年11月1日提供。
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组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶设置数据库1是牛胚泡发育所必需的
德克萨斯农工大学兽医医学和生物医学学院兽医生理学和药理学系，德克萨斯州大学城，77843-4466
摘要
来自转座因子选择分支的转录物是最早出现在早期小鼠和人类胚胎中的转录物之一，表明转座因子及其活性调节机制是建立哺乳动物谱系的基础。然而，这些寄生序列参与指导发育程序的机制尚不明确。转座元件通过表观遗传方式进行调控，其中DNA甲基化和组蛋白3赖氨酸9三甲基化（3K9me3）的组合模式抑制其转录。在啮齿动物的研究中，SET域分叉1（SETDB1）已成为核心甲基转移酶，负责标记H3K9me3转座元件，并暂时调节其转录活性。在小鼠中进行的SetDB1功能丧失研究表明，虽然胚胎外组织不需要这种甲基转移酶，但如果没有甲基转移酶的话，胚胎本身的建立就会失败。由于牛胚胎在植入前阶段的早期启动表观遗传编程过程，我们试图确定是否抑制设置数据库1会阻止内部细胞团的形成设置数据库1转录物存在于植入前的整个发育过程中，基于RNAi的缺失会阻碍桑椹胚发育阶段的胚胎生长。虽然我们没有观察到整体组蛋白甲基化或转座元件转录的改变，但我们确实观察到H3K27乙酰化的整体水平增加；与活性增强子相关的表观遗传标记。我们的观察表明设置数据库1可能与控制增强子功能的表观遗传学机制相互作用，这种甲基转移酶的抑制可能会破坏牛的发育程序。
关键词：SETDB1，转座元件，植入前发育，增强剂，谱系规范，内细胞质量，表观遗传，发育程序
1.0简介
植入前发育是表观遗传程序设计过程中的一个关键窗口，因为在最初的几次分裂期间，染色质结构发生了重大重组，从而建立了指导哺乳动物胚胎生长和分化所必需的基因表达模式。这个编程阶段是胚胎和胚外细胞谱系形成的关键事件之一[1,2]. 胚胎正确建立表观遗传程序的能力缺陷会导致发育失败或因基因表达模式不当而发病[三–5].
在过去的25年中，DNA甲基化的植入前动力学一直是深入研究的主题，而翻译后组蛋白甲基化的动力学仍不明确[6,7]. 组蛋白甲基化机制和过程假设将基因组划分为常染色质区域以及组成性和兼性异染色质区域，这一点尤其正确。在这一领域中，组蛋白3的赖氨酸九（H3K9）是多种表观遗传修饰物的核心靶点，涉及控制基因转录和超核染色质结构。例如，乙酰化赖氨酸9已在转录活性基因的5′区被鉴定，而该特定残基的甲基化与转录沉默和着丝粒周围异染色质的核化有关[8–11]. 有趣的是，H3K9的三甲基化（me3）在各种转座因子家族的调节区域和体内富集[12,13]这些寄生核酸序列的调控直接影响灵长类和啮齿动物的干细胞多能性[14–17]. 因此，了解建立和维持H3K9表观遗传翻译后标记的机制对于更好地定义发育规划和植入前谱系规范的过程至关重要。
已鉴定出6种具有H3K9催化活性的哺乳动物组蛋白甲基转移酶，包括EHMT1（Glp）、EHMT2（G9a）、SUV39H1、SUV39 H2、SETDB1、（Eset）和SETDB2[18]. SUV39H1和SUV39H2负责中心周围异染色质形成的动力学[8]而EHMT1、EHMT2和SETDB1似乎同时调节蛋白质编码基因和转座元件[19–21]. SETDB2的特征尚不明确，可能与免疫功能有关[10]. 有趣的是，虽然EHMT2似乎对维持转座元件的DNA甲基化是必要的，但SETDB1似乎是负责用H3K9me3标记这些序列并暂时调节其转录活性的核心甲基转移酶[20,21]. 考虑到转座元件序列在调节多能性转录程序中的重要性[14–17]，更好地理解植入前发育过程中SETDB1的动力学可能对解释指导胚胎谱系规范的过程至关重要。
在鼠标中，设置DB1转录物（可能还有母体SETDB1蛋白）存在于成熟卵母细胞中。SetDB1的合子转录始于胚泡期，对小鼠内细胞团（ICM）的存活至关重要。相反，胚胎外组织似乎不需要这种甲基转移酶，因为在妊娠第6.5天，无效胚胎显示出完全发育的滋养层和胎盘外锥，而胚胎本身显示出完全缺乏发育[22]. 鉴于ES细胞多能性和转座因子之间已建立的联系，我们试图确定抑制母体SetDB1转录物是否会通过阻断ICM的形成而破坏胚泡的形成。在小鼠中，从合子到胚泡的转变需要3.5天，合子转录在晚期1细胞到2细胞阶段启动[23]. 虽然基于RNA干扰（RNAi）的方法可以用来耗尽SetDB1 mRNA，但母体SetDB1的储存被假设存在，并且取决于蛋白质的半衰期，可能允许ICM的形成不受干扰地进行[22]. 相反，在牛胚胎发生过程中，从合子到胚泡的转变需要7到8天的时间，合子转录开始于8细胞期[24]. 妊娠时间越长，就有机会询问设置数据库1ICM规范和胚泡形成的功能丧失。我们在此报告基于RNAi的设置数据库1转录物在桑椹胚阶段阻止牛植入前发育，并增加全球H3K27乙酰化水平，这是与活性增强子相关的表观遗传标记。我们的结果又添加了一条数据，表明SetDB1对于谱系规范中最早的事件至关重要。
2.0材料和方法
2.1胚胎生产和siRNA注射
在商业屠宰场（美国田纳西州西摩市DeSoto Bioscience）收集牛卵母细胞，并在38.5°C的温度下在MOFA金属珠培养箱（美国威斯康星州维罗纳市MOFA Global）中运输至含有5%CO的密封无菌瓶中过夜2在空气平衡培养基199中，加入伯爵盐（Invitrogen，Life Technologies Inc.，Carlsbad，CA，USA），补充10%胎牛血清（Hyclone，Logan，UT，USA以及5.0μg/ml的促卵泡素（Vetoquinol，Pullman，WA，USA）。卵母细胞在该培养基中成熟22至24小时。成熟的卵母细胞在补充有50μg/μL庆大霉素（Invitrogen）的温热乳酸酪氨酸（TL）Hepes（Vetoquiol）中洗涤两次，同时在38.5°C的保温器（Minitube）上处理。在38.5°C、5%CO2的增湿空气培养箱中，使用添加250μM丙酮酸钠、1%P/S、6 mg·mL-1 BSA无脂肪酸（Sigma）、20μM青霉素、10μM牛磺酸和10μg/mL肝素（Sigma）的预平衡改良酪氨酸乳酸培养基进行体外受精。冷冻精液在35°C下解冻1分钟，然后在密度梯度介质（Isolate®，Irvine Scientific，Santa Ana，CA，USA）中以200×g离心分离20分钟，上限为50%，下限为90%。取下上清液，将精子颗粒重新悬浮在2 mL改良Tyrodes培养基中，以200×g离心10分钟进行清洗。在Nunclon®4孔多头鱼（VWR）中进行大量受精之前，将精子粒取出并放置在温暖的0.65 mL微管中（美国宾夕法尼亚州匹兹堡VWR Scientific）每孔含50个成熟卵母细胞，浓度为1.0×106精子/mL。授精后16至18小时，卵母细胞在45μL TL Hepes中的0.65 mL微管（VWR）中用2分钟涡流清洗卵丘细胞，在TL Hepe中清洗，然后随机分配到三个不同的治疗组：非注射对照组（CNTL）、非靶向siRNA注射对照组，并注射siRNA靶向设置数据库1（si设置数据库1).
三个短干扰RNA（siRNA）序列被设计用于牛SETDB1:SETDB1siRNA 545（5′CCGUGAGCUAUGGCUGCCUUAAGA设置数据库13′）、siRNA 2799（5′CCUGAGACCGAAACAGGAUGUCAA 3′）和设置数据库1siRNA 3225（5′GACGACAGCUCAUGACAACUUCU 3′）。所示序列对应于感觉链，数字表示牛体内的目标位置设置数据库1({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_001191388.2”，“term_id”：“359751482”，“term_text”：“NM_00119138.8.2”}}NM_001191388.2号)成绩单。对照siRNA（Invitrogen，Cat#AM 4621）用荧光Cy3标签标记。三个人中设置数据库1siRNAs 545和3225是最有效的，并且在所有后续实验中都使用了每种siRNA的50%/50%混合物。控制和设置数据库1将siRNA与绿色荧光右旋糖酐在1xTris-EDTA中混合，并在细胞质中注射约100pL。注射后，分离荧光胚胎并在添加4 mg·mL的牛进化培养基（Zenith Biotech，ZEBV-100）中培养−1BSA（Probumin，Millipore，810014），并培养至胚泡阶段。在第2天记录分裂率，并从不能存活的胚胎中分离出存活胚胎。每天监测胚胎的形态进展和IVF后第8天记录的囊胚率。
2.2 RNA分离和逆转录
使用RNeasy Mini Kit（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN，Cat#74104）分离RNA，并进行以下修改。将10个牛MII卵母细胞或胚胎（2、4–8、16细胞、桑椹胚和囊胚期）池在DPBS中清洗两次，并在10ul RLT裂解缓冲液中快速冷冻。样品在冰上解冻，并通过添加额外的溶解缓冲液使其达到100ul的体积。添加100ul 80%乙醇，通过移液管混合样品，将总200μl体积转移到RNeasy旋转柱中，并在8000g下离心30秒。用350μl缓冲液RW1清洗色谱柱，然后再次用500μl 80%乙醇清洗，离心后，在室温下风干5分钟。将20μl不含RNase的水加入柱中，使其在室温下静置1分钟，然后在8000g下离心1分钟，从而洗脱RNA。将1μl DNA和2μl缓冲液添加到20μl体积的分离RNA中，用扩增级DNaseI（Sigma，St.Louis，MO.Cat#AMPD1）处理分离RNA。将样品置于室温下15分钟，然后放在冰上。使用SuperScriptII试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA.Cat#18064-071）通过结合1μl随机六聚体寡核苷酸（Invit罗gen，Callsbad；CA.Cat#48190011）、1μl 10 mM dNTP（Invitro，Carlsba，CA.Cat#18427-013）和23μl DNAse处理的RNA进行反转录反应。将该混合物置于70°C下5分钟，然后冷却至室温。然后添加总共5μl SuperScriptII反应缓冲液、3μl二硫苏糖醇和1μl Super ScriptII，并将反应混合物置于42°C下50分钟、45°C下20分钟、50°C下15分钟，然后70°C下5分钟。样品在使用前保存在−80°C。
2.3实时PCR扩增
未从以前的出版物中获得的引物序列是使用NetPrimer软件工具设计的(www.premierbios.com/netprimer). 按照制造商的说明，使用DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Mastermix（Fisher Scientific，Pittsburgh PA.Cat#F-415L）对mRNA水平进行实时PCR分析。反应在StepOnePlus实时PCR系统上进行（Applied Biosystems，Foster City CA）。定量测量设置数据库1使用引物序列b获得转录水平设置数据库1前（5′GCTGAGACACAACGTCAAAA 3′）和b设置数据库1Rev（5′ACATAGGAAGCATCATCA 3′），然后将这些读数归一化为三个参考基因的几何平均值，如前所述[25]. 选择的三个参考基因是GAPDH公司,YWHAZ公司&SDHA公司基于先前发布的数据[26]. 使用的引物序列为：Gapdh（Fwd 5′-CTGCCGTTCGACAGATAG-3′，Rev 5′-CTCCGACTCATCTTG-3′）Ywhaz（Fwd5′-CTGAACTCCCTGAGAAGC-3′Rev 5’-CCTTCTCAGCTC-3′）Sdha（Fwd-5′-ACCTGATGCTTTGCTCTG-3′Rev 6′-TCGTCAACCCTC-3’）。用于牛转座元件分析的引物序列为LINE1（Fwd 5′CCCAGGTCCAGAGACGTT 3′Rev 5′GGGTGGTGCCTCATAGA 3′）、BOV-B（Fwd5′CAAGTGCCGAGGA 3′Rev5′GCCACCCCTCTCC 3′）bERV g4 LTR，bERV g4 Pol（Fwd 5′CCAGGGTCCAGGAGGT 3′Rev 5′GGCAGGCTGGCGTGAC 3′）[27]，和bERV b3 LTR（Fwd 5′GTTCGCCGTTTCCAAGTCCC 3′Rev 5′CTCTTTGCAGGGCTCGC 3′）[28]. 使用上述ΔΔCT方法计算每个样本的相对基因表达水平，一式三份[29]. 这些计算得出的值被传输到统计分析程序Graph Pad中进行分析。
2.4免疫细胞化学
2.4.1 5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分析
桑椹胚期（受精后148小时）的IVF胚胎从培养物中取出，用1 x PBS洗涤两次，并用99%纯甲醇在−20°C下固定5分钟。胚胎在PBS中洗涤，并在室温下用PBS中的0.2%Triton X-100透化30分钟，并用用0.1%Triton X-100稀释在ddH2O中的3M HCl处理，以使DNA变性，并使第一抗体与甲基化/羟甲基化的DNA结合。一旦带状物溶解（10–15分钟），去除HCl，并添加100 mM盐酸Trizma缓冲液（pH 8.5）30分钟，以中和HCl。胚胎在室温下在含有3.0%BSA（Sigma Cat#9022）和0.1%Triton X-100的PBS封闭缓冲液中孵育4小时。初级抗体列于在封闭缓冲液中稀释1:200，胚胎在37°C下500μl滴液中孵育1小时。然后将胚胎通过封闭缓冲液冲洗三次，每次30分钟。Alexa 488（Invitrogen）和Alexa 594（Invit罗gen）二级抗体在PBS中用0.1%吐温-20稀释1:200，胚胎在此溶液中在37°C无光下孵育1小时（其余步骤在无光下完成）。用含0.1%吐温-20的PBS在37°C下洗涤该二级抗体三次，每次洗涤五分钟。RNase A在PBS中稀释至25μg/ml，并在37°C下培养20分钟。Hoechst（Sigma Cat#33342）在PBS中稀释25μg/ml，添加到胚胎中，并在37°C下孵育15分钟。用含0.1%吐温-20的PBS在37°C下清洗胚胎三次，每次30分钟。盖玻片上装有50/50的防褪色和甘油溶液，并用透明指甲油密封。
表1
| 类型 | 目标 | 抗体 | 来源（类别号） |
|---|
| 主要 | 5分钟 | 5-甲基胞苷小鼠单克隆抗体 | 先正达（33D3） |
| 主要 | 5小时 | 5-羟甲基胞嘧啶兔pAb | 主动主题（39791） |
| 主要 | H3K9米3 | 组蛋白3三甲基Lys9兔pAb | 主动主题（39161） |
| 主要 | H3K27me3型 | 组蛋白3三甲基lys27小鼠单克隆抗体 | Abcam（ab6002） |
| 主要 | H3K4me3型 | 组蛋白3三甲基Lys3兔pAb | Abcam（ab6000） |
| 主要 | H3K9平方米 | 组蛋白3二甲基Lys9兔pAb | 活动主题（39375） |
| 主要 | H3K27ac型 | 组蛋白3乙酰Lys 27兔pAb | Abcam（ab4729） |
| 次要 | 正常兔全血抗体 | Alexa Flour 488山羊抗狂犬病IgG | Invitrogen（A-11008） |
| 次要 | 小鼠免疫球蛋白 | Alexa Flour 594山羊抗鼠IgG | Invitrogen（A-11005） |
2.4.2翻译后组蛋白修饰的分析
桑椹胚通过将胚胎置于冷甲醇中至少1分钟来固定，并在4°C下储存在PBS-0.1%吐温20（PBS-Tw）中，直到再次使用。胚胎在室温下用1%Triton X-100在PBS（PBS-Tr）中透化1小时，并在15分钟的时间间隔内用0.1%吐温-20通过PBS彻底洗涤。在渗透和清洗后，将胚胎隔夜封闭在新鲜的封闭缓冲液中（10 mg/mL BSA、2%v/v山羊血清和11.25 mg/mL甘氨酸，置于1X PBS中），以防止任何非特异性抗体结合。在室温下用适当的一级抗体标记胚胎1小时，再次通过新鲜的封闭缓冲液冲洗，并用相应的二级抗体标记。初级和次级抗体列在并用0.1%吐温-20在PBS中稀释。（与之前使用Hoechst（Sigma Cat#33342）进行DNA染色的方法相同，与5mc和5mc方案相同）。
2.4.3数字显微镜
数字成像显微镜是在位于蔡司种马数字成像工作站的德克萨斯农工大学兽医与生物医学科学学院图像分析实验室进行的。z系列是从单个胚胎中采集的，每个胚胎有5张图像，根据其形状和大小，距离不同。每个部分都包含一张感兴趣的抗体图像（5-甲基胞嘧啶、H3K9 me2、me3等）和一张Hoechst核染色的图像。使用NIS Elements 3.0（美国纽约尼康公司）软件对胚胎图像进行平均强度测量，将不含初级抗体的样本图像设置为基线。抗体染色强度测量值除以Hoechst染色细胞核的强度，得出胚胎中每个图像平面的比率。
2.5统计分析
为了分析基因表达，编译了每个转录物的测量周期阈值（CT）实验值，并将其归一化为上述参考基因的几何平均值。使用前面描述的Delta Delta CT方法计算正常表达水平（Schmittgen和Livak，2008）。这些计算得出的值被转移到统计分析程序GraphPad（GraphPadSoftware，Inc.，La Jolla，CA）中，并进行方差分析（ANOVA），以分析实验处理之间的差异。为了确定胚胎发育率的差异，在三组独立的胚胎之间进行了卡方分析。为了进行图像分析，对每个胚胎的比率进行平均，以获得每个治疗组和染色组合的平均比率。使用这些方法，构建了一个单向方差分析模型，以确定各染色处理组之间的显著差异。对于所有实验，统计显著性设置为α=0.05。为了与p值<0.05进行比较，我们采用了Tukey的HSD分析，并与小写字母进行了显著的统计差异。
3.0结果
3.1植入前胚胎中牛SETDB1的表达和siRNA介导的缺失
牛设置数据库1位于第3染色体上，编码一个1290个氨基酸蛋白，与人类同源物的保守性为96%。我们通过检测设置数据库1在牛植入前发育过程中使用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）。设置数据库1MII卵母细胞中转录物丰富，在早期8细胞期（受精后74-75小时）之前保持高丰度(). 在向晚期8细胞期（94-96小时）过渡期间，这些高水平开始急剧下降，并保持在较低水平，但在囊胚期（172-180小时）始终可以检测到(). 检查设置数据库1在失去牛植入前发育功能的情况下，我们设计并测试了三种对牛的短干扰RNA（siRNAs）设置数据库1，并验证了其消耗能力设置数据库1牛胚胎成纤维细胞瞬时转染法检测转录物(). 这些分析确定了两种siRNAs（545和3225）是最有效的。在之前研究DNMT1抑制的研究中，我们确定了两种siRNAs联合使用时的加性效应[30]. 因此，所有进一步的实验都使用了等摩尔比的siRNA 545和3225。评估设置数据库1在胚胎发生的抑制过程中，siRNA混合物在受精后16-18小时注射到牛受精卵中（si设置数据库1). 为了进行比较，另一组注射了前面描述的非靶向siRNA（siNull）[30]第三组未接受治疗（对照组）。
牛设置数据库1牛植入前胚胎的表达和siRNA介导的缺失。A） 编码牛的转录物的测量设置数据库1在胚胎发生期间。的级别设置数据库1用q-RT-PCR检测牛卵母细胞和植入前发育不同阶段的mRNA。B） siRNAs靶向验证设置数据库1采用瞬时转染牛胎儿成纤维细胞。设置数据库1用q-RT-PCR定量转录水平。C–D）测量设置数据库1使用q-RT-PCR从对照组、siNull和siSETDB1处理组获得的牛8细胞（C）和桑椹胚（D）的转录物。对于A–D，样本归一化为GAPDH、YWHAZ和SDHA的几何平均值，并使用2-ΔΔCT方法[52]. 图表代表了四个独立的实验。误差条代表SEM，***表示p<0.001和****p<0.0001。E–G）si的发育性抑制设置数据库1处理过的胚胎。扩张囊胚期非注射对照组（E）和siNull胚胎（F）的共聚焦图像，以及停滞桑椹胚期设置数据库1注射胚胎（G）。右侧显示注射的绿色荧光右旋糖酐染料的20x图像，左侧显示明亮的视野图像。
由于缺乏牛病毒特异性抗体SETDB1、，我们使用qPCR检测siSETDB1治疗的效果。为了验证注射siRNAs正在消耗靶mRNA，收集了8细胞（70-72小时）和桑椹胚（146-148小时）阶段的胚胎，分离了RNA，并使用qRT-PCR测量了SetDB1转录物的水平。如图所示,设置数据库1与注射siNULL的胚胎相比，受精后16–18小时注射siRNAs在8细胞期产生了几乎完全耗竭，在桑椹胚发育阶段持续存在强烈抑制（p<0.01）。接下来我们研究了si的影响设置数据库1根据胚胎发育到囊胚阶段的情况，对胚胎存活率进行治疗。所有实验组之间的胚胎卵裂率相似，虽然注射过程确实产生了可测量但预期的胚胎存活率下降（siNull为25%，对照组为44%），但在361个注射了靶向siRNAs的胚胎中，有0个胚胎的存活率下降了设置数据库1存活到囊胚期(). 如图所示、对照组和siNull实验处理在第8天产生了活的扩张囊胚，而si设置数据库1处理过的胚胎只能存活到培养发育的第6天（146到148小时），产生退化胚胎和一些质量较差的桑椹胚。
si翻译后组蛋白修饰的分析设置数据库1注射胚胎。用（A）H3K4me3（绿色）/H3K9me2（红色）/Hoechst（蓝色）以及（B）H3K9me3（绿色）/H3K27（红色）/Hoechst（蓝色）共同染色的活桑椹胚期胚胎的代表性共聚焦图像。图像放大20倍。C） 通过将特定靶点（H3K4me3、H3K9me2、H3K9me3和H3K27me3）的强度除以DNA染色强度（Hoechst），计算每个胚胎的平均荧光强度比。然后对每个胚胎的每个翻译后修饰比率进行平均，以获得每个治疗组和染色组合的平均比率。使用这些方法，构建了一个单向方差分析模型，以确定各染色处理组之间的差异。显示不同字母的条形图被认为存在显著差异(第页< 0.05). 误差条代表SEM。
表2
对照、siNull和si的胚胎发育率设置数据库1注射胚胎。计算分裂至2细胞期或发育至囊胚期的胚胎数量，并用其生成单向方差分析模型，以确定治疗组之间的差异。显示不同上标字母的组被认为是不同的(第页< 0.05).
| 治疗 | n个 | 劈开的 | %劈开 | 胚泡 | %囊胚 |
|---|
| 碳纳米管 | 189 | 162 | 85.7 ± 2.2%一 | 85 | 44.9 ± 4.9%一 |
| 无效的 | 283 | 222 | 78.4 ± 6.9%一 | 73 | 25.7 ± 6.0%b条 |
| 硅设置数据库1 | 361 | 308 | 85.3 ± 2.8%一 | 0 | 0%c（c） |
3.2 siSETDB1胚胎DNA和组蛋白3赖氨酸9甲基化分析
虽然来自siSETDB1处理的晚期致密桑椹胚破碎且质量极差，但来自该处理组的早期桑椹胚胎（受精后146至148小时）在形态上表现正常。因此，在随后的调查中，我们将重点放在这一发展时间点上。为了确定观察到的致死原因，我们测量了发育中表观基因组的潜在变化。SETDB1催化二甲基化H3K9转化为三甲基形式[31]. 因此，我们首先测量了全球二甲基化和三甲基化H3K9的水平。为了进行此分析，我们采用免疫细胞化学分析，并将精力集中在桑椹胚发育阶段（受精后146至148小时），这是siSetDb1治疗组最后一个可行的发育点。与小鼠的观察结果一致设置数据库1无胚胎和ES细胞[22]，对K3K9 me2和H3K9 me3的分析未能确定所有治疗组的可测量差异(). 已发表的证据表明H3K9me与组蛋白3赖氨酸4（H3K4）和赖氨酸27（H3K27）的甲基化之间存在相互作用[32,33]. 因此，对胚胎处理进行了检查，以确定设置数据库1抑制改变了这些翻译后组蛋白修饰的整体水平。如图所示，未检测到任何更改。鉴于DNA甲基化和两种组蛋白甲基化酶之间已建立的联系[34]以及H3K9me3标志本身[35]，我们评估了所有胚胎治疗组的整体5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的可测量变化。虽然注射过程使5mC的总体水平显著降低，但在siNull和si之间没有观察到显著差异设置数据库1处理(). 这些结果表明注射程序影响了5mC的水平，但抑制了设置数据库1并没有特别影响这个表观遗传标记。
硅中5-甲基胞苷和5-羟甲基胞苷的全球水平分析设置数据库1注射胚胎。A） 桑椹期胚胎的典型共焦图像与识别5-羟甲基胞苷（绿色）/5-甲基胞苷/DNA染色Hoechst（蓝色）的抗体共同染色。图像放大20倍。B） 通过将特定靶点（5-hMC或5-MC）的强度除以DNA染色强度（Hoechst），计算每个胚胎的平均荧光强度比。然后对每个胚胎的比率进行平均，以获得每个治疗组的平均比率。使用这些方法，建立了一个单向方差分析模型，以检查治疗组之间的差异。显示不同字母的条被认为是不同的(第页< 0.05). 误差条代表SEM。
3.4 siSETDB1胚胎组蛋白3赖氨酸27乙酰化分析
除了作为替代启动子外，人类和啮齿动物的研究表明，在发育过程中，转座因子的基因体具有作为组织特异性增强子的能力[14]. 在这些研究中，转座元件的独立家族显示出通常与增强子功能相关的表观遗传标记的组织特异性模式，并且这些染色质修饰与基因表达的细胞特异性模式相关[39,40]. 利用免疫细胞化学分析，我们检测了胚胎治疗组组蛋白3赖氨酸27乙酰化（H3K27ac）的变化，这是一个与转录活性增强因子相关的标记[41]. 如图所示，抑制设置数据库1与未注射对照组和siNull治疗组相比，牛植入前发育过程中H3K27ac显著增加（p<0.01）。这些结果表明，在牛胚胎发育早期抑制SetDB1改变了一个表征转录活性增强子的关键表观遗传标记的全球丰度。
硅中H3K27乙酰化的全球水平分析设置数据库1注射胚胎。A） 桑椹期胚胎的典型共焦图像与识别H3K27ac（绿色）和Hoechst DNA染色（蓝色）的抗体共同染色。图像放大20倍。B） 通过将H3K27ac的染色强度除以DNA染色强度Hoechst，计算每个胚胎的平均荧光强度比。然后对每个胚胎的比率进行平均，以获得每个治疗组的平均比率。使用这些方法，构建了一个单向方差分析模型，以确定治疗组之间的差异。显示不同字母的条被认为是不同的(第页< 0.05). 使用事后Tukeys测试，siSetDB1组与Control组和siNull组之间的差异为（p<0.001）。误差条代表SEM。
4.0讨论
早期使用电子显微镜对胎盘组织的研究显示，在合胞体滋养层细胞中存在大量内源性C型逆转录病毒颗粒，表明发育中胚胎的组织中存在强大的逆转录病毒活性[42,43]. 自从这些初步观察以来，我们已经认识到由转座因子编码的转录物和蛋白质不仅在发育中的卵子和早期胚胎中丰富，而且对于植入前发育的进行也是必不可少的[40,44,45]. 2012年，Macfarlan及其同事证明，小鼠胚胎基因组激活后立即表达的许多转录物是由内源性逆转录病毒衍生的长末端重复序列启动的嵌合转录物[15]. 具体而言，小鼠转座因子的一个核心家族MuERV-L家族已将自己嵌入分别指导原始内胚层和滋养层规范的关键基因（Gata4和Tead4）的调控区域。重要的是，由这些逆转录病毒元件驱动的转录物在培养的ES细胞的小亚群中随机重新激活，将它们推向一种特权、全能状态，在这种状态下，它们能够对胚胎外和胚胎谱系做出贡献。人类也存在类似的情况，灵长类特异性内源性逆转录病毒HERVH介导对原始多能性至关重要的转录程序[17]. 总之，细胞基因对转座元件的共同选择似乎提供了一种机制，将营养外胚层和胚胎多能性的指定所需的关键因子的表达协调联系起来。因此，了解植入前发育期间转座因子是如何控制的动力学是破译胚胎谱系规范的关键。
调控转座因子转录的机制主要表现为表观遗传，并且主要通过DNA甲基化和H3K9me3的组合模式介导[12,13,46]. 我们实验室以前的工作表明，牛植入前发育过程中维持甲基转移酶DNMT1的失活会导致胚胎发育在8细胞到16细胞的过渡期受阻[30]. 因此，牛转座因子表观遗传控制中的一个核心因子似乎是植入前发育继续进行所必需的。在当前的研究中，我们重点研究了用H3K9me3标记转座元件的组蛋白甲基转移酶失活对发育的影响[20,21]. 先前对啮齿类动物的研究表明，SETDB1基因缺失的胚胎可以通过植入前发育而无明显缺陷。然而，由于小鼠的发育发生在一个相对较短的时间框架内，卵母细胞中存在的母源SetDB1蛋白很有可能足以适当调节转座因子，并使小鼠囊胚内的细胞类型得以明确[22]. 牛胚胎发生需要更长的时间，我们怀疑这将使我们有机会利用RNAi来研究设置数据库1ICM规范和胚泡形成的功能丧失。在我们的实验中，我们观察到非注射对照胚胎和注射siNull对照胚胎的胚泡发育，而相比之下，没有注射siNul对照胚胎的囊胚发育设置数据库1胚胎能够发育到桑椹胚早期阶段。这些结果表明，与小鼠相比，即使对牛的部分抑制设置数据库1使用RNAi会导致发育停滞。
对小鼠ES细胞的研究表明，删除SetDB1相互作用蛋白KAP1后，LINE1转录物略有增加，而含有内源性逆转录病毒元件的LTR的表达增加了15-50倍[21,47]. 因此，在我们的实验中，我们试图确定设置数据库1对转座因子的转录产生了可测量的影响。以前的研究利用卵母细胞和胚胎库中逆转录转座子家族的转录谱，表明迄今为止已鉴定的大多数牛转座因子家族(BtERVF2-I型,ERV2-1-I_BT型,ERV2-2-I_BT型和ERV2-3-I_BT型)表达量极低和/或变异较大，这妨碍了可靠的量化[38]. 因此，我们重点分析了牛基因组中最丰富的转座因子家族（LINE1、BOV-B、bERV-b3和bERV-g4），希望这些可以量化。出乎意料的是，BOV-B、bERV-b3和bERV-g4的水平下降到或低于我们的检测阈值，虽然观察到LINE1活性的波动，但测量的变化没有达到统计显著性（p=0.056）。诚然，在我们的分析中检测到的牛转座因子的数量只是总数的一小部分，重要的是，关键的MuERV-L和HERVH家族在小鼠和人类中都不是最丰富的转座因子[17,22]. 因此，其他转座因子家族可能改变了转录谱，这些变化在某种程度上与桑椹胚期发育阻滞有关。
除了推动嵌合转录物的产生外，最近的几项研究已经开始将含有LTR转座元件的DNA甲基化谱中的组织特异性差异与增强子活性联系起来[14,39,40]. 这些研究表明，转座因子的体和调控区本身能够招募与细胞特异性增强子功能相关的表观遗传标记。事实上，转座元件序列与组蛋白H3赖氨酸4单甲基化（H3K4me1）和H3K27ac的胚胎和胎盘模式之间存在着强烈的相关性，这是染色质修饰定义增强子[39,40]. 类似于对小鼠的研究[22]，我们无法检测到牛血清中H3K9me2或H3K9 me3的整体变化设置数据库1胚胎。我们承认，ICC分析非常粗糙，可能来自中心周围和组成异染色质的信号掩盖了转座元件H3K9me3的任何变化。。此外，在牛胚胎中，其他甲基转移酶可能能够补偿设置数据库1然而，我们能够检测到全球H3K27ac水平的增加。这种表观遗传学标记将活性增强子与单独含有H3K4me1的非活性或平衡增强子元件区分开来，获得该标记是增强子激活过程中的关键步骤[41]. 在猪胚胎中，H3K27ac从最早的原核期减少到8细胞期，然后从桑椹胚期开始再乙酰化[48]. 这种增加的时间与伴随第一个细胞谱系规范的事件相关，这表明H3K27ac沉积可能是胚胎发育程序的一个关键方面。我们对H3K27ac水平升高的观察表明设置数据库1在牛胚胎中可能会影响增强子活性的全球动态。然而，ICC分析提供了H3K27ac的全球测量值，并不意味着这些变化局限于基因组的功能区。我们推测可能设置数据库1要求反对CBP-P300的行动[49]，还有那个设置数据库1抑制可能会使关键基因座过早激活。不适当的增强子活性模式可能同时参与多种分化程序，导致桑椹胚期发育停滞。然而，翻译后组蛋白标记的改变可能是由于活性降低导致染色质断裂的结果[1]. 需要进行更多的研究，以确定基因组的哪些区域因设置数据库1灭活。
5.0结论
在小鼠植入前发育期间，染色质结构发生重大重组，DNA甲基化模式丢失，随后植入后重新建立[50]. 牛基因组也经历了一个重新甲基化的时期，但相比之下，表观遗传编程的过程在植入前阶段（8细胞阶段）更早开始[51]. 因此，牛和小鼠胚胎对设置数据库1功能丧失完全与表观基因组重建的时间有关。来自转座因子选择分支的转录物是最早出现在早期小鼠和人类胚胎中的转录物之一。这些元素似乎还驱动关键的多潜能相关转录因子的表达，表明转座因子和调节其活性的表观遗传机制是建立ICM干细胞鉴定的基础。我们的研究表明设置数据库1可能是启动谱系规范和正确建立牛胚胎表观基因组所需的关键因素。
亮点
牛SETDB1的抑制是胚胎致死性的，在桑椹胚发育阶段，就在谱系规范之前产生一个阻滞。
SETDB1功能丧失与组蛋白3赖氨酸27乙酰化（与增强子功能相关的表观遗传标记）的全球增加有关。
SETDB1缺失不会影响组蛋白3赖氨酸9的DNA甲基化或三甲基化的全球水平。
致谢
该项目得到了NIH NICHD拨款1R21HD055631-01A2和5R01HD058969-02的支持。KJV由NIH NIAAA拨款1R21AA022484支持，MS和JHP由NIH ORIP拨款8R24OD011188-02支持。
脚注
作者贡献
MCG、MEW和CRL设计了实验，监督了实验的完成并撰写了手稿。MS、GLW、MP和JHP进行了以胚胎学为重点的实验，而GLW、KJV和MP进行了基因表达分析。GLW和KJV在MCG和CRL的监督下进行了统计分析。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
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