利用小分子探针促进生物学理解和治疗学发现

针对特性较差的酶

小分子探针可以帮助注释特征不佳的酶的功能，包括那些人类基因研究与疾病有关的酶。然而，如果底物未知，则很难建立一种典型的生化高通量筛选试验来识别酶的调节剂。基于活性的蛋白质分析（ABPP）利用活性小分子配体共价标记大酶家族成员的活性位点，包括那些未经标记的酶(野村证券等。, 2010). 在这种方法中，广泛反应的ABPP探针可用于竞争实验，以识别选择性减少所需酶靶标记的小分子。尽管有潜力，但这种无底物筛选方法尚未得到广泛应用，因为目前竞争性的ABPP方法依赖于SDS-PAGE或质谱分析，最多只能用于评估几百种化合物。

MLP承担了一个项目，开发基于ABPP筛选的高通量荧光偏振技术（fluopol-ABPP）(巴霍夫钦等。, 2009). 溶液中的小荧光团旋转迅速，发出低荧光偏振信号，而与蛋白质结合的荧光团旋转较慢，发出更高的信号。基于这一已知特性，开发了一种ABPP测定法，其中酶靶标的荧光ABPP探针标记产生一个信号，然后当小分子“命中”有效地竞争结合时，该信号被减少。该方法被证明通常适用于多井格式的高通量筛选。例如，通过在384孔板中筛选20000个小分子，发现了多个小分子阻断丝氨酸水解酶视网膜母细胞瘤结合蛋白-9（RBBP9）（一种癌症相关酶）的丝氨酸氟磷酸（FP）-罗丹明标记。小鼠大脑部分和人类细胞裂解物中的二次化学蛋白质组分析随后确定了天然产物催产素（ML081；图3)作为第一个对该丝氨酸水解酶家族成员具有选择性的RBBP9抑制剂(巴霍夫钦等。, 2009).

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图3

渐晕图中突出显示的MLP探针

蛋白磷酸酶甲基酯酶-1的小分子抑制剂PME-1是蛋白磷酸酶2A（PP2A）的调节因子，与癌症和神经退行性变有关，但之前还没有被发现，部分原因是设计一种新的蛋白磷酸酶抑制剂具有挑战性在体外适于监测PP2A羧甲基化状态的生化分析。fluopol-ABPP屏幕产生了最初的点击，从中，在后续分析中显示了四种新型氮杂-β-内酰胺，以选择性抑制人类细胞中的PME-1。最有效的抑制剂ML174（ABL127；图3)，用低纳米摩尔IC抑制PME-1₅₀对50多种其他丝氨酸水解酶没有活性。在小鼠中，ML174选择性地灭活PME-1并增加大脑中PP2A羧甲基化水平(巴霍夫钦等。, 2011). 令人惊讶的是，氮杂-β-内酰胺的命中率是由学术化学实验室进行的多样性合成所产生的创新示例-此类化合物不同于供应商提供的传统筛选化合物。氮杂-β-内酰胺支架后来被证明是开发选择性丝氨酸水解酶抑制剂的通用化学型(祖尔等。, 2012).

MLP还开发了一种改进的ABPP方法，可用于读取蜂窝和体内靶向参与，药物先导临床前开发中经常出错的环节(西蒙等。, 2013). 使用fluopol-ABPP，首次鉴定了丝氨酸水解酶溶血磷脂酶1（LYPLA1）和溶血磷脂蛋白酶2（LYPA2）的选择性抑制剂，发现其作用可逆。对于缺乏内源性底物或产物等已知生物标志物的可逆抑制剂来说，证明靶点参与是具有挑战性的。为了克服这一限制，设计了新的ABPP探针，该探针在可观察的时间窗口内与丝氨酸水解酶反应。在人类细胞和小鼠中，这些适度反应的ABPP探针可用于准确测量LYPA1和LYPA2抑制剂的靶向结合和选择性。例如，给小鼠服用抑制剂可阻断肺、心脏和肾脏组织中90%以上的LYPA1和LYPA2活性，而大脑中的酶活性仅降低约50%，肝脏中未发现明显的酶抑制(阿迪贝基语等。, 2012).

更广泛地说，fluopol-ABPP已被证明对丝氨酸水解酶以外的酶类有用，并已用于筛选谷胱甘肽S-转移酶(坪井等。, 2011)，精氨酸甲基转移酶(狄龙等。, 2012)和蛋白质精氨酸脱氨酶(克努克利等。, 2010).

通过多重生物活性数据研究作用化合物的新机制

识别调节具有挑战性目标的小分子探针通常需要获得新的化学起点。以往解决这一差距的努力通常侧重于从化学结构的角度增加多样性，这是一个已知的可以不完全预测具有新生物活性的化合物的特性的指标。MLP致力于开发高通量和廉价的方法，使多重细胞生物活性测量能够直接指导构建其成员具有新作用机制的化合物集合。

基因表达研究已经证明了无偏见的高维分析数据在定义疾病状态和推断复合作用机制方面的影响(休斯等。, 2000;羔羊等。, 2006;温斯坦等。, 1997). 高含量成像可以为以无偏见、高通量的格式捕获复杂疾病表型提供补充测量。然而，目前的高含量筛选分析要么侧重于特定的细胞过程或有限的细胞读数，通常基于标记蛋白或目标转录物的qPCR，要么吞吐量有限(卢等。, 2007;温斯坦等。, 1997;年轻等。, 2008). 因此，MLP将重点放在“细胞涂布试验”上，该试验能够更公正地描述由疾病状态或小分子扰动剂引起的变化(古斯塔夫斯多蒂尔等。, 2013). 使用五个通道测量的六种染料，可以定量成像824个不同的细胞形态特征。在初步试验中，根据基于图像的图谱之间的相似性，将已知具有类似生物活性的小分子准确地聚集在一起。由于细胞形态受到许多因素的影响，从遗传和表观遗传到代谢和环境，我们预计低成本但高维成像分析将有助于识别与小分子扰动和疾病相关的意外细胞改变。

虽然基因表达谱分析和新的基于图像的谱分析等方法包含了描述小分子生物反应的丰富信息，但很少有方法可以使用这些数据来理解结构-活性关系（SAR）。为了更有效地优化探针和治疗导线的多参数，MLP开发了一种计算方法，可以从高维小分子剖面数据自动生成SAR信息(瓦韦等。，2014年a). \收集了约20000个DOS分子和2000多个生物活性化合物的基因表达谱数据和细胞膜数据。然后使用关联规则挖掘来定义不同强度的“规则”，将化学属性（例如，化合物中的相邻子结构、共享合成历史）与基因表达和成像数据中的生物效应模式联系起来。在该方法的一个应用中，识别与结构无关的微管失稳剂共簇的基于DOS的分子为基于此高含量信息得出的特征的“支架跳跃”提供了机会。

基于这些方法学的进步，问题是多重细胞小分子活性数据是否可以用于创建一个最大生物活性（性能）多样性。人们普遍认为，干扰尽可能多的生物靶点并诱导尽可能多不同的细胞表型的小分子库对基于细胞的筛选最为有效。然而，创建先验的这样的筛选收集在以前是不可用的。因此，到目前为止，收集不同的筛选集合主要集中在化学结构的计算多样性上。在最近一篇著名的论文中，对高通量筛选数据进行了回顾性分析，以生物活性为基础构建了一个库(汽油等。, 2012); 然而，这种基于历史数据分析的方法不能扩展到新的候选库成员。MLP测量了12000多个生物活性化合物和17000多个基于多样性合成（DOS）的分子的基因表达和基于图像的特征，可从多达178个基于细胞的屏幕获得高温超导结果(瓦韦等。，2014年b). 我们询问分析数据是否可以选择具有不同生物活性的化合物，通过比较细胞或靶蛋白的活性模式来判断。在比较历史HTS分析中的性能差异时，基于成像和基因表达分析中的不同活性选择的化合物显著优于随机选择的化合物或基于化学多样性选择的化合物。此外，我们发现了数千种化合物，其中许多形成了基于支架的簇，诱导了12000种生物活性物质中未见的细胞形态和基因表达模式，可能暗示了新的作用机制。这些方法和其他产生复合数据报告补充测量化合物活性的方法为优先合成和测试更有可能调节新治疗靶点的小分子提供了强有力的途径。

通过化学多样性开发新型抗感染药物

许多被忽视的传染病是发展中国家的地方病，这些疾病的社会经济影响是毁灭性的。疟疾和恰加斯病分别证明了耐药性的影响和缺乏有效药物。在疟疾病例中，有几种药物可用于治疗，但耐药寄生虫的迅速出现带来了严重的问题(菲多克，2013). 目前可用于治疗恰加斯病的治疗方案非常有限，仅在疾病的急性期有效，而在慢性期无效。此外，当前抗查加斯药物的严重不良反应导致患者依从性差(伯尔尼，2011). 迫切需要开发用于治疗疟疾、恰加斯病和其他传染病的安全新药。

鉴定具有新化学结构和作用机制的抗疟药和抗胰蛋白酶体药物可能有助于开发有效对抗对现有药物耐药的寄生虫的治疗方法。DOS途径已被证明在快速生成新的立体化学丰富的化合物方面非常有效，包括含有8到14元环的化合物(杰拉德等。, 2011;Lowe公司等。, 2012;马卡雷尔等。, 2010)MLP筛选文库中含有5000多种DOS化合物。这些化合物，再加上使用了100000个DOS化合物的更大集合的某些MLP探针发现项目，使得能够通过新机制识别对这些传染源起作用的小分子探针。

使用8000种DOS化合物进行的基于细胞的疟疾生存能力筛查，确定了四种立体基因元件的高活性命中。在筛选收集物中存在的15种其他可能的分子立体异构体中，只有一种具有可检测的活性。在这些立体化学见解的指导下，随后的优化导致了ML238的识别(图3)对耐氯喹的Dd2菌株（IC₅₀=0.4 nM）和野生型3d7菌株（IC₅₀=0.6 nM）恶性疟原虫(海德布雷赫特等。, 2012;Weiwer公司等。, 2010). 此外，ML238具有良好的水溶性，不溶解红细胞（EC₅₀>40000 nM），这很重要，因为它表明缺乏广泛的细胞毒性。为了确定该化合物的作用机制，MLP产生了耐ML238的寄生虫并进行了全基因组测序。这些研究表明，ML238作用于公元前₁复数（Q₁) (卢肯斯等。, 2014)，其位于细胞膜的与抗疟药物阿托伐醌靶向的醌氧化酶位点相反的一侧。ML238和阿托伐醌缺乏交叉耐药性，两者联合使用具有协同作用，突出了醌还原酶位点作为抗疟治疗靶点，可以克服阿托伐酮耐药性(卢肯斯等。, 2014).

类似地，基于细胞的分子筛选具有选择性杀伤力克氏锥虫查加斯病的病原体，鉴定为ML341(图3)，DOS衍生的小分子探针(卡莫迪等。, 2010;丹达帕尼等。, 2014). ML341对几种T.cruzi公司包括临床嗜心性分离物CA-1株，克隆72（CA-I/72）（IC₅₀=1 nM）。接下来，对ML341进行评估在体外对牛骨骼肌（BESM）细胞中CA-I/72菌株的杀灭活性。类胰蛋白酶体的出现T.cruzi公司每日监测用ML341或苯硝唑（当前一线药物）治疗的感染BESM细胞。在这种严格的测定中，ML341在40nM时具有杀性，而苯硝唑仅在6.6uM时具有杀性。

除此效力外，ML341对小鼠肝微粒体稳定，这将有助于在体内研究。在ML341的8种可能的立体异构体中，只有2种立体异构体对小鼠肝微粒体稳定，这一发现有助于指导进一步的药物化学优化。如这两个例子所示，筛选收集中有一组全面的立体异构体对于快速评估基于立体化学的SAR的效力和辅助药理学至关重要。

鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂

表征真菌代谢产物衍生的丝氨酸棕榈酰基转移酶抑制剂麦草酸衍生物FTY720抗炎特性背后的作用机制(陈等。, 1999)，导致发现FTY720调节1-磷酸鞘氨醇（S1P）受体以调节淋巴细胞追踪(曼德拉等。, 2002). 这一发现随后为FTY720（fingolimod）的临床开发铺平了道路，FTY7201是一种鞘氨醇类似物，可调节人类五种S1P受体中的四种，用于治疗多发性硬化症(罗森等。, 2008). S1P受体主要在免疫细胞、神经细胞、内皮细胞和平滑肌细胞中表达，并被认为发挥调节免疫细胞运输、内皮屏障完整性和血压等作用，这表明调节特定受体亚型治疗多种疾病的潜力(罗森等。, 2013).

为了更好地验证单个S1P受体作为治疗靶点，MLP开始识别选择性地使每个受体痛苦或拮抗的小分子探针。选择性S1P1拮抗剂（ML056，图3)带有体内通过合理的合成开发活性，并用于探索干扰该受体对淋巴细胞运动和功能的影响，提供证据证明FTY720的治疗效果主要通过该受体介导(桑纳等。, 2006). 拮抗剂伴随的淋巴细胞减少导致内皮细胞渗漏和严重的肺水肿，表明激动剂治疗是自身免疫性疾病唯一可耐受的选择(罗森等。, 2013).

疏水性强两性离子导致ML056水溶性差，这两种情况都可以克服在体外和体内通过配方作为可逆碳酸盐加合物。这种衍生化对于维持稳定的S1PR1的完整受体占有率至关重要，这使得第一个成功的脂质敏感GPCR晶体结构成为可能(汉森等。, 2012). 当与生物化学研究相结合时，S1P1结构还为包括第二代S1P1激动剂ML007在内的化合物使用的新的激动剂结合模式提供了见解(图3). 在变构激动剂一级筛选中鉴定的这一系列在二级分析中被确定为受到ML056的非竞争性抑制，ML056是一种正构激动剂，与受体的内源性配体占据相同的位置。这些研究定义了一个不同于S1P的结合囊，该结合囊具有更高的受体选择性，并可能具有更好的药代动力学特征和治疗指数(冈萨雷斯-卡布雷拉等。, 2008).

激活S1P1受体以调节免疫细胞贩运可能为多发性硬化以外的疾病提供治疗方法。流感感染后的临床结果取决于病毒株的固有特性以及宿主免疫反应的差异。特别是，高细胞因子水平和免疫细胞募集与不良结果相关。在感染2009年H1N1大流行性流感病毒分离物CYM-5442（ML007的优化衍生物）的小鼠中体内活性，抑制细胞因子的分泌，减少免疫细胞渗入肺部，提高生存率，同时对病毒滴度没有影响(泰亚罗等。, 2011;沃尔什等。, 2011).

MLP还确定了S1P2的激动剂（ML031；图3) (萨等。, 2013)、S1P3（ML249；图3) (格雷罗等。2010年a;乔等。, 2012;乌尔巴诺等。, 2013)和S1P4（ML248；图3) (格雷罗等。2010年b;格雷罗等。, 2012)受体以及S1P4受体拮抗剂（ML131；图3) (格雷罗等。, 2011;奥尔德斯通等。, 2010;乌尔巴诺等。，2011年a;乌尔巴诺等。，2011年b)提供了多个一流的小分子探针，以进一步阐明这类GPCR的功能。ML249是S1P受体的变构激动剂，用于定义S1P3受体结合囊内的正构、变构和生物空间(Jo等人，2012年).

PPARγ磷酸化拮抗剂

噻唑烷二酮（TZD）类抗糖尿病药物包括PPARγ激动剂，可增加胰岛素敏感性激素脂联素的表达，降低胰岛素抵抗诱导激素的表达，部分有助于其强大的胰岛素敏感性(于等。, 2002). 虽然这类药物是用于治疗2型糖尿病的，但由于少数患者出现严重的副作用，包括液体潴留，它们的临床效用受到了限制(Staels，2005年)、充血性心力衰竭(内斯托等。, 2003)骨密度降低(奥伯特等。, 2010).

长期以来，这些药物的抗糖尿病疗效被认为是由受体激动剂引起的。然而，引人注目的是，随着额外的PPARγ调节剂的开发，药物疗效与配体结合亲和力的关系比与激动剂活性的关系更密切，这促使人们更深入地研究PPARγ配体改善胰岛素敏感性的机制。PPARγ配体是一种有效的胰岛素增敏剂，尽管受体激动剂水平不同，但它在降低小鼠S273肥胖诱导的PPARγ磷酸化方面非常有效。此外，TZD罗格列酮的治疗效果与该药物在个体患者中减少S273 PPARγ磷酸化的有效程度相关。脂肪细胞的表达谱显示，S273处PPARγ的磷酸化导致与肥胖和胰岛素敏感性相关的靶基因子集受到抑制(崔等。, 2010). 最近的研究进一步表明，转录抑制因子Thrap3与PPARγ上的磷酸化S273对接调节糖尿病相关基因的表达(崔等。, 2014). 总之，这些结果表明，通过正常化胰岛素增敏基因的表达，阻断S273处PPARγ的磷酸化，是该类药物的主要治疗机制。然而，尚不清楚是否可以确定小分子能够充分分离TZD的两种活性，如果发现，这些化合物的功效和安全性如何。

从已知的PPARγ的有效部分激动剂开始，MLP合成并测试类似物，以寻找与受体紧密结合并抑制S273磷酸化但缺乏受体激动剂活性的分子。识别阻断受体翻译后修饰的小分子是一个具有挑战性的目标，这得益于MLP开发的一套表征核受体结构功能的方法(马西亚诺等。，2014年a). 这些努力导致了非激动剂（拮抗剂）探针ML244（SR1664；图3) (崔等。, 2011;卡梅内卡等。, 2010). 氢-氘交换（HDX）已被证明对表征配体诱导的核受体构象动力学特别有效(马西亚诺等。，2014年b)，揭示ML244直接结合PPARγ，不稳定已知驱动经典激动剂的受体的Af2表面，但干扰配体结合域的表面以诱导不易被S273磷酸化的构象。重要的是，由于ML244结合PPARγ而不是直接抑制Cdk5（一种介导PPARγS273磷酸化的激酶或任何其他激酶），因此探针不会干扰蛋白质组中其他底物的磷酸化。

在喂食高脂肪饮食的小鼠中，ML244降低了Cdk5介导的S273对PPARγ的磷酸化，使血糖水平正常化，并改善了胰岛素敏感性。在瘦素缺乏症中对象/对象严重肥胖小鼠模型ML244与罗格列酮一样有效地降低S273 PPARγ磷酸化并改善葡萄糖耐量。然而，与罗格列酮不同，ML244不会导致这些小鼠体重增加或液体滞留，也不会减少培养中的骨细胞矿化。目前正在进行的工作重点是增加ML244支架的类药物性质，并测试每天口服一次后产生的化合物对肥胖小鼠的影响。

毒蕈碱受体的变构调节剂

目前市场上大约30%的药物调节GPCR。绝大多数GPCR靶向治疗药物作用于立体定向位点，这些直接作用的配体可能有许多潜在的缺点，包括诱导毒性和受体脱敏或内化。此外，识别选择性正构配体通常很困难(连接等。，2009年a). 毒蕈碱型乙酰胆碱受体（mAChRs）作为多种神经疾病的治疗靶点引起了人们的极大兴趣。在第II期和第III期临床试验中，五种人类mAchR的全脑型激动剂导致认知改善，并对阿尔茨海默病（AD）和精神分裂症具有抗精神病作用。然而，据信由外围M2 mAChR和M3 mACh R激活引起的不良事件阻止了化合物的进一步临床开发。尽管做出了重大努力，但事实证明选择性靶向mAchRs的乙酰胆碱结合位点是不可能的(连接等。2009年b)由于内源性乙酰胆碱配体在不同亚型之间具有高度的进化保守性。

相比之下，变构位点在受体亚型中的进化保守程度较低，并且通过稳定受体的独特活化构象，为实现真正的亚型选择性以及多样的药理学提供了令人兴奋的机会。此外，变构位点通常是亲脂小囊，可被独特的小分子化学类型靶向，这些化学类型在结构上与内源性配体不同(连接等。2009年b;温图尔等。, 2014). 考虑到这一点，MLP进行了筛选工作，以确定mAChR的选择性正变构调节剂（PAM），这些调节剂可用于分析这些受体对pan-mAChR激动剂疗效的个别贡献。这些努力通过使用功能分析得到了帮助，这些功能分析能够在单个动力学钙分析中识别PAM和负变构调节剂（NAM）。虽然HTS提供了命中，但这些化合物不具备体内靶点验证实验所需的物理化学性质和CNS穿透性。实现高质量的小分子探针需要对初始筛选命中进行显著的药物化学优化，从而鉴定出M1选择性PAM（ML169；图3) (桥梁等。, 2010;里德等。, 2011;焦油等。, 2012)M4选择性PAM（ML253；图3) (勒等。, 2013;尼斯温德等。, 2010)和M5选择性PAM（ML326；图3) (绅士等。, 2010;绅士风度等。, 2013). 所有这些探针都具有亚摩尔EC₅₀s、 与其他受体亚型相比，至少有10倍的选择性，而且更重要的是，是脑渗透剂。

在AD小鼠模型中，M1选择性探针ML169增强了纹状体中化学诱导的兴奋，这被认为可以介导抗精神病作用，并有利于可溶性APP的生成，而不是淀粉样APP(焦油等。, 2012). 在精神分裂症小鼠模型中，M4选择性ML253逆转了苯丙胺诱导的过度运动，重现了已知抗精神病药物的作用(勒等。, 2013). 现在，进一步的实验重点是使用这些探针探索这些受体的生物学和潜在治疗相关性，包括研究M5的作用，目前对此知之甚少。

代谢酶的小分子激活剂

肿瘤生长与促进细胞自主营养吸收的代谢适应、有氧糖酵解速率的增加以及向合成代谢转变以支持癌细胞生长和增殖有关。对癌症代谢途径如何调节的新兴机制见解正指向潜在的新治疗靶点；然而，与代谢可塑性允许癌细胞适应和逃避代谢靶向治疗的淋巴结相比，哪些靶点代表真正的癌症依赖性仍然是一个悬而未决的问题。迫切需要小分子探针来研究代谢是如何改变以支持肿瘤生长的，并确定可用于治疗的癌症代谢靶点。

癌细胞通常采用分化程度较低的细胞状态，类似于分化程度较轻的非癌细胞（例如成人干细胞），往往依赖有氧糖酵解。丙酮酸激酶催化糖酵解的最后一步，由两个基因产物衍生而来，每个基因产物具有两个交替剪接亚型。癌细胞通常表达丙酮酸激酶（PKM2）的M2同工酶，促进有氧糖酵解。相反，M1同工酶（PKM1）促进葡萄糖氧化，并在肌肉、心脏和大脑等ATP需求量高的组织中表达。这些同工酶的调节水平差异很大。PKM1具有较高的组成活性，而PKM2可以根据信号输入采用活性构象或非活性构象。PKM1表达可增加氧化葡萄糖代谢并抑制细胞增殖和肿瘤生长(克里斯托夫克等。, 2008;以色列等。, 2013;伦特等。, 2015). 然而，异位PKM1表达在多大程度上重演了PKM2的小分子激活尚不清楚，因此不确定PKM2活性的小分子调节是否会导致肿瘤生长或生存能力的改变。

为了更严格地测试这种治疗方法的潜力，更好地理解丙酮酸激酶活性在癌症生物学中的作用，需要PKM2的小分子激活剂，然而激活蛋白功能被认为是小分子的一个高要求。为了解决这个缺口，MLP进行了一次筛选，以确定在生化分析中增加PKM2活性的分子。三种不同的化学类型被确认为PKM2的真正激活剂。随后对这些命中进行优化，识别出ML203（DASA-58；图3)和ML265（TEPP-46；图3)，前两个报道的PKM2激活物(拳击手等。, 2010). 进一步的表征表明，探针通过稳定PKM2四聚体（酶的活性更高的形式）的形成来提高活性。在果糖-1,6-二磷酸（FBP）（PKM2的内源性激活剂）的存在下，四聚体的稳定性进一步增强。结构研究表明，合成的小分子活化剂在单体-单体界面上占据与FBP结合的变构位点不同的结合位点(阿纳斯塔西奥等。, 2012). 因此，这些MLP探针通过稳定蛋白质相互作用来增强酶的活性，这种作用机制通常被视为难以实现(泰尔等。, 2012).

接下来，这些探针被用于探索激活PKM2可能带来治疗益处的癌症背景。在培养的癌细胞系中，ML203和ML265降低了细胞增殖，并对代谢物水平产生影响，这与异位PKM2表达的变化不同(阿纳斯塔西乌等。, 2012). 丝氨酸代谢的变化是观察到的最显著的变化之一，PKM2的激活可以与丝氨酸剥夺协同作用，减缓癌细胞的生长(孔等。, 2012). 丙酮酸激酶激活还可以通过口服ML265抑制异种移植瘤的生长，导致肿瘤潜伏期增加和肿瘤缩小(阿纳斯塔西奥等。, 2012). 尽管这些结果提供了激活PKM2具有抑瘤作用的初步证据，但其作用相对较小，并且这些分子在减缓肿瘤发生方面具有最高的功效。

关键的下一步将是确定是否存在特别依赖于低PK活性的既定肿瘤环境，或者是否存在对PKM2激活具有特别敏感性的联合治疗，例如丝氨酸代谢调节剂。除了在肿瘤中的作用外，在非癌组织（包括肝脏和红细胞）中也发现了受调节的PK活性。因此，使用小分子激活PKM2或其他PK亚型可能对癌症和非癌症疾病状态都有益。为此，PK激活剂目前正在被探索作为丙酮酸激酶缺乏症的治疗药物，丙酮酸酶缺乏症是一种先天性代谢错误，它特别影响PK的红细胞亚型(扎内拉等。, 2007).

作者要感谢Matthew Boxer、Sivaraman Dandapani、Richard Y Ebright、Juan Marugan、Andrew Phillips、Craig Thomas、Matthew Vander Heiden和Bridget Wagner对手稿进行了深思熟虑的讨论和批评性阅读，并感谢Katie Ris Vicari对人物设计的帮助。MLPCN中的中心通过NIH拨款U54 MH084681-01（NIH化学基因组中心）、1 U54 HG00503-01（康拉德·普雷比斯化学基因组中心，1 U54 HG005034-01（南方研究专业生物遏制筛选中心）、U54 MH084690-01（新墨西哥大学分子发现中心）、U 54 MH0846 91-01（约翰霍普金斯医学院离子通道中心）、1 U54 H G005031-01（堪萨斯大学专业化学中心）和U54 MH084659-01（范德比尔特加速探针开发专业化学中心）。

HR是Reception的科学创始人和顾问，Recepton已授权RPC-1063。BFC是Abide Therapeutics的科学创始人和顾问，该公司对开发丝氨酸水解酶抑制剂作为治疗剂感兴趣。LAS和BE是Intellicyt的科学联合创始人，Intellicyt销售高通量流式细胞仪仪器。范德比尔特大学的所有作者都获得了Janssen、Bristol-Myers Squibb和AstraZeneca的资助，用于开发用于中枢神经系统疾病的GPCR变构调节剂。