一种生产HIV-1包膜装饰物的新方法

克隆构造

表达furin的质粒furin:FLAG/pGEM7Zf（+）来自加里·托马斯博士（俄勒冈州波特兰Vollum研究所）。使用EcoRI和HindIII限制性位点将来自该质粒的furin片段亚克隆到pcDNA3.1（−）（Life Technologies，Inc.）中。

来自JRFL-FD、SF162-FD和CONPEP-FD的密码优化gp140 DNA由Peter Kwong博士（国立卫生研究院疫苗研究中心）提供。这些DNA包含与gp120和gp41胞外结构域对应的序列，直至aa 683。此外，它们在5′端有人CD5分泌信号，在gp120和gp41的交界处有抗呋喃裂解突变SEKS，在C端有FD和六组氨酸标记(49). 使用JRFL-FD作为起始模板，引入了一系列额外的突变。例如，这些包括SOSIP突变(50,51)，稳定突变(52)，增强的furin解理位点RRRRRR(53)，以及中显示的各种截断图2并在“结果”中描述。JRFL gp120克隆也由相同模板通过PCR扩增与gp120对应的适当序列构建而成。

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图2。

带有扩展连接子的Strep-tag II允许快速纯化HIV-1 gp140包膜三聚体。 A类，gp140表达盒示意图。P（P）_CMV公司，CMV启动子；CD5（CD5）、分泌肽；C1–C5，保守域；V1–V5版本，可变域；黑树，gp120中的聚糖；蓝色的树，gp41中的聚糖；BGHpA公司牛生长激素基因的3′poly-A序列。呋喃裂解位点的位置，二硫键突变(紧急求救信号)和I559P突变。B类，标签连接到gp140 C终端。每个标签的aa序列显示在盒HRV-3C是指人鼻病毒蛋白酶裂解位点。C类、和D类，还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶，显示样品的蛋白质模式，如顶部。E类，还原条件下样品的SDS凝胶(+DTT公司)或非还原（−DTT公司)条件。红箭，gp120或gp140的低聚物由非特异性二硫键交联形成。蓝色箭头对应于gp41胞外区带不同程度糖基化的阶梯。F类，使用Strep-tag II特异性单克隆抗体进行Western blot。G公司，Strep-Tactin纯化的gp140样品的BN凝胶。标记为M的车道,M（M）_第页标记。标记蛋白的kDa分子量显示在左边.凝胶C类,D类,E类、和G公司用考马斯蓝染色。

BG505（BG505.W6M.ENV.C2）(28,54)对gp140包络序列进行密码优化，并使用GenArt Strings技术（生命技术）合成优化序列。在此过程中，还引入了一系列突变，如下所示：Asn在aa 332处引入N个-允许BG505 gp140与2G12结合的连接糖基化位点(55)BnAb；SOSIP公司(28); RRRRRR（RRRR）(53); 以及“结果”中描述的各种其他突变

构建了一系列经修饰的pcDNA3.1（−）载体，每个载体包含CD5分泌信号、一个包含三种丙氨酸的连接子以及“结果”中描述的各种Strep-tag II和八组氨酸标记。在CD5信号和丙氨酸连接子之间引入了限制位点NheI和NotI。这些质粒载体DNA是从5-α大肠杆菌细胞（新英格兰生物实验室有限公司）用NheI和NotI消化，并用FastAP碱性磷酸酶（生命技术）去磷酸化。

通过重叠延伸PCR构建gp140（和gp120）克隆(56)或基因组装PCR(57)使用合适的引物。将NheI和NotI的限制性位点引入末端引物中。扩增的DNA用NheI和NotI消化，并用琼脂糖凝胶电泳纯化。然后将DNA与NheI-NotI-消化和去磷酸化的pcDNA3.1（−）质粒DNA连接。gp140 DNA的定向插入导致gp140与CD5信号肽在N端的框内融合，丙氨酸连接子随后在C端出现各种标签（见“结果”）。

将gp140（和gp120）克隆转化为5-α大肠杆菌使用GeneJET质粒miniprep试剂盒（生命技术公司）纯化细胞（新英格兰生物实验室公司）和质粒DNA。然后对DNA进行测序，以确认克隆的gp140 DNA的100%准确性。为了转染到哺乳动物细胞中，按照制造商的说明，使用GeneJET plasmid Midiprep试剂盒（生命科技）纯化质粒DNA。

小规模转染

悬浮电池HEK293F（生命科技）和HEK293CnTI⁻（ATCC CRL-3022）保存在FreeStyle 293表达培养基（Life Technologies）中。细胞在Multitron Pro摇床（Infors HT）中在37°C和8%CO中培养₂.在HEK293S GnTI的情况下⁻生长培养基中添加1%热灭活胎牛血清（FBS，Quality Biologicals）。为了进行转染，将细胞隔夜培养至1×10的密度⁶细胞/ml。转染前2 h，以100×克5分钟后，重新悬浮在新鲜介质中，密度为2×10⁶在没有FBS的情况下，每毫升细胞数。然后将三毫升细胞转移到16.8-ml 6孔Clear Not处理板（科宁公司）的每个孔中。对于切割抗性（CR）（和gp120）DNA，向细胞中加入6μg gp140质粒DNA，然后加入线性聚乙烯亚胺（PEI25k，Polyscience Inc.），PEI/DNA（w/w）比为3:1。对于切割效率（CP）DNA，细胞与3μg furin质粒DNA共同转染。然后在37°C和8%CO中培养细胞₂以130 rpm的转速摇晃一整夜。12小时后，2 ml新鲜培养基、1 ml HyClone SFM4HEK293培养基（GE Healthcare）和蛋白质表达增强丁酸钠(58)最终浓度为2 n的溶液（Sigma-Aldrich）米添加到单元格中。第5天，收集上清液并使用0.2μm过滤器（康宁）进行澄清。

大规模转染

转染的方式与小规模转染类似，但在2.8升烧瓶中放大到1.2升培养物，并在37°C和8%CO中培养₂以90 rpm的转速摇晃。

小型gp140纯化

为了灭活上清液中的生物素，将20μl Bio-Lock生物素封闭溶液（IBA Life Sciences）添加到5 ml含有分泌的gp140（或gp120）的上清液。在4℃下培养30分钟后，添加100μl Strep-Tactin珠（Qiagen），并在4℃条件下旋转过夜。珠子混合物以200 rpm的速度旋转，使珠子成球状。然后将珠子应用于旋转柱（Pierce）上，短暂离心以去除残余上清液，然后用50 m水洗两次米三重HCl，pH值8，300 m米氯化钠。用200μl Strep-Tactin洗脱缓冲液（2.5 m）洗脱结合的gp140或gp120蛋白米 d日-去硫生物素（Sigma），25米米三重HCl，pH值8，150 m米NaCl）。

大规模gp140纯化

为了防止非特异性蛋白酶降解，根据制造商的说明将蛋白酶抑制剂片（罗氏诊断）添加到澄清的上清液中。为了灭活培养基中存在的游离生物素，添加BioLock-biotin封闭液（IBA Life Sciences），并在4°C下培养培养基30分钟。gp140通过Strep-Tactin亲和层析纯化，然后进行尺寸排除层析（SEC）。使用KTA Prime-Plus液相色谱系统（GE Healthcare）以0.7 ml/min的速度将上清液加载到1 ml Strep-Tactin柱（Qiagen）上。通过至少20个柱体积的洗涤缓冲液（50 m米三重HCl，pH值8，300 m米NaCl），直到吸光度达到基线水平。然后用洗脱缓冲液（2.5 m）洗脱Strep-tagged gp140蛋白米 d日-去硫生物素（Sigma），25米米三重HCl，pH值8，150 m米NaCl），流速为1 ml/min。使用100000分子量截止Amicon Ultra-4离心过滤装置（Millipore）合并和浓缩峰值部分。然后将样品应用于高负荷16/600 Superdex-200（制剂级）尺寸排除柱（GE Healthcare），该柱用凝胶过滤缓冲液（25 m米三氯化氢，pH值8150 m米氯化钠）。使用KTA FPLC系统（GE Healthcare）进行色谱分析，收集馏分并将其储存在−80°C的10%甘油中。

融合到六组氨酸或八组氨酸标签的gp140克隆通过HisTrap亲和层析纯化，然后进行SEC。使用KTA Prime-Plus液相色谱系统（GE Healthcare）以0.7 ml/min的流速将培养上清液加载到1ml HisTrap-HP柱上。使用含有50 m的缓冲液去除非特异性结合蛋白米Tris-HCl，pH 8，300米米氯化钠和20 m米咪唑直到吸光度达到基线水平。然后用20–500 m洗脱蛋白质米咪唑梯度。然后将峰馏分应用于Hi-Load 16/600 Superdex-200（制备级）尺寸排除柱（GE Healthcare），并如上所述进行纯化。

SDS-PAGE和Blue Native PAGE（BN-PAGE）

SDS-PAGE分析使用4–20%梯度Tris-glycine凝胶（Life Technologies）或自制10%凝胶在DTT存在（还原）或不存在（非还原）的情况下进行。蓝色染色蛋白阶梯11–245 kDa（金生物科技）被用作分子质量标记。根据制造商的说明（生命科技），使用Novex NativePAGE BisTris凝胶系统在4–16%梯度凝胶中进行BN-PAGE。在JRFL-FD的情况下，将天然的4–12%梯度三甘氨酸凝胶（生命科技）与三甘氨酸缓冲液（Bio-Rad）一起使用。NativeMark未染色蛋白质标准（生命技术）用作分子质量标记。所有凝胶均用考马斯蓝R-250溶液染色。

蛋白酶裂解

将SEC纯化的gp140三聚体与蛋白酶K（Thermo Scientific）的10倍系列稀释液（1–0.01μg/ml）在37°C下孵育1h。将相同的制剂在37°C下孵育时无蛋白酶作为阴性对照。样品在还原性SDS凝胶上进行电泳，用于CR gp140，在非还原性SDS-凝胶上电泳，用于CP gp140。

去糖基化

对于Strep-Tactin纯化的gp140，按照制造商的说明，使用1μl（500单位）PNGase F（新英格兰生物实验室公司）在没有DTT的情况下对10μg蛋白质进行脱糖。对于SEC纯化三聚体，在自然条件下使用每10μg蛋白质3μl（1500单位）PNGase F，并在室温下培养5小时，进行脱糖。

链球菌Tactin ELISA

Strep-Tactin包被的微孔板（IBA Life Sciences）用1μg/ml SEC纯化的gp140三聚体包被在100μl/孔的缓冲液（25 m米三氯化氢，pH 7.6，2 m米EDTA和140米米NaCl），并在室温下培养2小时。在用PBST（PBS中0.05%吐温20）进行三次洗涤后，向微孔中添加100μl PBS中连续稀释的Abs（10–0.001μg/ml），并在37°C下培养平板1h。用PBST清洗三次后，将平板与100μl兔抗人抗体HRP结合物（Santa Cruz Biotechnology）在37°C的PBS中稀释1:3000培养30分钟。然后用PBST清洗平板三次，并添加过氧化物酶底物以形成显色反应（TMB微孔过氧化物酶底产物系统，KPL）。通过添加100μl BlueSTOP溶液（KPL）和OD终止反应₆₅₀使用VersaMax ELISA微孔板阅读器（分子设备）进行记录。

西方印迹法

以抗HIV-1 JRFL gp140的多克隆小鼠抗体作为主要抗体，以兔HRP-结合抗鼠IgG（H+L）作为次要抗体（Novex，Life Technologies）。对于Strep-tag II检测，使用StrepMAB-Classic HRP-conjugated Ab（IBA Life Sciences；PBS中稀释度1:1000）。使用Bio-Rad Gel Doc XR+系统和Image Lab软件测量带强度。

扩展Strep-tag II可有效隔离gp140

我们的结论是，允许直接从培养基中选择性捕获gp140的方法最适合于三聚体的生产。以前通过将gp140与标签（如His标签）融合来实现这一点的尝试都失败了。我们假设这些失败是由于标签附着在gp140结构的底部时可能被遮挡，而聚糖屏蔽的存在又进一步加剧了这个问题，最多12个聚糖附着在C末端七肽重复序列2（HR2）螺旋上（见下文）。如果我们的假设是正确的，那么将标签从基部向外扩展应该会使其更容易绑定。发现在gp140的C末端和His标签之间插入一个27-aa的foldon序列，可以有效地与镍糖结合，支持了这一推理。

我们通过将gp140 C末端与Strep-tag II和八组氨酸标签以及中间的各种连接子融合，构建了一系列36个重组克隆(图2,A类和B类). Strep-tag II是一种8-aa肽（WSHPQFEK），以微摩尔亲和力和严格特异性与修饰的链霉亲和素（即Strep-Tactin）结合。然而，该复合物可以与去硫生物素解离，这是一种温和的条件。我们选择了分支B JRFL gp140作为模板来评估这种方法，但我们也同时构建了分支a BG505 gp140克隆进行比较。引入三个“SOSIP”突变和五个“稳定”突变来稳定JRFL三聚体(50,51). A501C和T605C突变在gp120和gp41之间创建了一个原生物内二硫键，HR1螺旋中的I559P突变加强了亚单位间（gp41）的相互作用，而HR1中或附近的五个突变（I535M、Q543L、S553N、K567Q和R588G）加强了界面上gp120和gp41的相互作用(50,–52).

我们的数据表明，Strep-tag II方法对从培养基中捕获gp140非常有效。带有短Ala的Strep-tagged gp140_三（或Gly-Ser-Gly-Ser）连接子与Strep-Tactin结合不良(图2C类,车道3)而含有23-aa连接子的Twin Strep-tag被有效捕获(车道4)尽管两个克隆表达gp140的水平相似(车道1和2). 结合gp140可以与2.5 m特异性解离米去硫生物素，洗脱的蛋白质纯度为～95%(例如 图2D类,车道1和2). 在gp140 C末端和连接子之间设计的HRV 3C蛋白酶裂解位点没有被裂解，这与我们的假设一致，即大蛋白酶分子会与原聚体碱基发生冲突。可以有效捕获各种形式的gp140(图2D类)：未清洁(车道1–8)或裂开(9–16车道); 在aa 664处截断(1–4车道和9–12)或aa 683(车道5-8和13–16); 用带有灵活链接器的八角头标记(车道4,8,12、和16)或刚性连接件(车道3,7,11、和15); A族（BG505）和B族（JRFL）病毒(图2G公司). 此外，我们还从SF162（B分支）和40007（CRF01 A-E分支）病毒中纯化了三聚体^三（40007 gp140序列由马里兰州银泉沃尔特·里德陆军研究所HIV医学研究项目Stovanabutra Sodsai博士、Jerome Kim博士和Merlin Robb博士善意提供）。此外，与凝集素或2G12 BnAb柱不同，我们的方法捕获全长gp140分子，并排除gp120和通常由非特异性蛋白酶产生的截断分子(表1).

带有链状标签的JRFL gp140可生产大量修剪物

CP和CR gp140分别产生裂解和未裂解三聚体。在CP gp140中，furin裂解几乎完成(图2E类,车道5)而CR gp140中很少或没有明显的卵裂(车道3). 裂解的gp120和gp41亚单位通过SOS二硫键共价结合，这从非还原条件下出现的单个140-kDa带中可以看出(图2E类,车道6)以及两个波段（gp120和gp41）在减速条件下（车道5）。然而，也可以看到由五个gp41带组成的阶梯(蓝色箭头可能对应于0–4的糖基化N个-连接的糖基化位点（见下文）。另一方面，CR gp140在还原和非还原条件下均显示出单一的140 kDa带(车道3和4)（使用高度敏感的Strep-tag特异性单克隆抗体进行Western blotting进一步证实了CR gp140缺乏裂解）(图2F类). 目前尚无法确定CR gp140是否也形成了SOS键。在所有制剂（包括gp120）中也发现了不同水平的高级低聚物，这可能是由于在非还原条件下原聚物的非特异性二硫键交联所致，但对于裂解的gp140则更少(图2E类,红色箭头,车道2,4、和6). 约三分之二的Strep-tagged JRFL CP664-gp140组装成三聚体(图2G公司,车道1)而CR664-gp140产生的二聚体多于三聚体(车道2). Strep-tagged BG505 gp140也有类似的模式。然而，BG505产生了较高水平的未分离三聚体(车道4，与相比车道2)，三聚体带比JRFL更分散，表明糖基化更广泛，也证明了M（M）_第页这些波段的(车道3和4，与相比车道1和2).

将开裂的gp140截断到aa 664以外导致gp140产量低下

我们开发了一种快速筛选策略，使用任何HIV-1 Env序列优化最大三聚体生成的各种参数(图3A类). 构建了40多个不同的Strep标记的gp140克隆，并将每个克隆转染到小体积（6ml）的细胞中。通过将Strep-Tactin珠直接添加到培养基中捕获分泌的gp140，并提高表达效率(图3B类)，解理(图3D类)，和三聚物生产(图3E类)进行了分析。通过直接使用未经Strep-Tactin纯化的上清液进一步评估效率表达(图3C类). 测试的不同参数包括截断点、SOSIP突变和切割的重要性、293F或GnTI的产生⁻细胞（GnTI⁻细胞缺乏N个-乙酰氨基葡萄糖转移酶1，不能引入复杂的糖基化）和B族（JRFL）或A族（BG505）gp140（AN个-在aa 332处将糖基化位点引入BG505，使其等效于JRFL gp140）(62).

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图3。

超过aa 664的截断产生很少或没有gp140三聚体。 A类优化重组gp140生产的筛选策略。B类,D类、和E类，通过向培养基中添加Strep-Tactin珠捕获分泌的gp140，并用2.5 m洗脱米去硫生物素。相同数量的洗脱样品用于测定表达效率(B类)、裂解和gp41糖基化(D类)和三聚体生产(E类).C类，通过直接使用上清液而不添加Strep-Tactin珠进一步评估表达效率。样品在还原条件下进行电泳，使得gp41将被干净地分离并且完全可用于与用于蛋白质印迹的Strep标签mAb相互作用。B类非还原性SDS凝胶比较了aa截短物664和683在培养基中未分离和裂解gp140的产量。C类，减少SDS凝胶，比较在C末端不同aa位置截短的gp140重组体的产量。终点编号对应于C终点处的aa。在每条车道上装载相同体积的上清液。注意，在距离顶部凝胶。D类减少在aa 664和683截短的未分离和裂解gp140蛋白的SDS凝胶。蓝色和红色箭头gp140蛋白的差异糖基化gp41外域带分别在664和683氨基酸处截断。E类，Strep-Tactin纯化gp140样品的BN凝胶。B类,D类、和E类Western blots使用小鼠抗gp140多克隆抗体。C类，使用Strep标签II特异性mAb的蛋白质印迹。显示的数据用于GnTI⁻-生产JRFL gp140。293F-产生的JRFL gp140和GnTI产生的BG505 gp140也观察到类似的模式⁻或293F电池。

我们观察到在293F或GnTI中表达JRFL和BG505 gp140的类似模式⁻细胞。SOSIP突变被证明是必不可少的，因为如果没有它们，大多数蛋白质都会聚集，无法被Strep-Tactin捕获。然而，出乎意料的是，我们发现切割后的gp140在培养基中的含量低于aa 664(图3,B类和C类). aa 672和aa 683结构体产生的量低了3-5倍，而进一步截断导致gp140几乎完全丧失(图3C类). 这并不是因为解理不良，因为683-gp140被有效解理，产生了如预期的稍大的gp41梯带(图3D类,车道2，与相比车道1). 相反，未分离683-gp140的产生没有显著影响。与裂解的683-gp140不同，后者在较低水平上表达(图2D类（比较9–12车道具有13–16车道)和​和3三B类(车道2和6))，未分离的683-gp140的表达几乎高达664(图3B类,车道3和7车道与4车道和8). 最后，aa 683蛋白表现出聚集的趋势，其外观主要表现为高M（M）_第页BN凝胶涂片(图3E类,车道3).

上述结果表明，裂解引发MPER的构象变化，这可能导致一些疏水残基暴露，导致聚集。这个假设与Klasse之前的报告一致等。(63)和Ringe等。(26)这表明，裂解的aa 681（来自KNH1144）和aa 683（来自BG505）gp140蛋白在MPER处形成胶束，可能是通过暴露的MPER疏水残基与脂质组分的相互作用。

裂解对于生产真正的HIV-1 Trimers至关重要

Strep-Tactin纯化的gp140纯度为～95%(图4A.1款)但它含有三聚体和原聚体的混合物以及一些高M（M）_第页物种(图4答3,车道S). SEC将其分为三个主要部分(图4A.2款)：（i）高M（M）_第页空隙体积后立即洗脱并在BN凝胶上作为扩散带迁移的部分(答3,车道1); （ii）三聚体，以相对尖锐的峰洗脱，并在BN凝胶上以致密带的形式迁移(车道2); 和（iii）原聚体二聚体和单体的两个重叠峰(车道3). 为了确定哪些三聚体是正宗的、裂解的或未裂解的，293F-产生的（复合聚糖）或GnTI⁻-生成的（高甘露糖，无复合聚糖）三聚体被大规模表达（1–4升），并通过Strep-Tactin捕获和SEC纯化；CP，～12 mg/L；GnTI公司⁻CR，～3 mg/L；CP，约1毫克/升。然后在还原条件下通过SDS-PAGE分析每个SEC组分，以评估纯度和裂解(图4,B类,C类,D类、和E类) (面板2)，BN-PAGE评估低聚物状态(面板1)，EM阴性以评估三聚体的形状(面板3–5)和抗原性来评估构象（见下文）。这些分析表明，三聚体被纯化至接近均质，高达2–3 mg/L（CP三聚体），并建立了其真实性标准。首先，我们观察到，在JRFL Env的情况下，裂解gp140作为三聚体恢复的gp140的比例是未裂解gp140的3-5倍（相比之下车道S和5–7属于B.1节具有D.1款). 其次，未分离三聚体与裂解三聚体相比质量较差。与CP三聚体组分不同，其在BN凝胶上显示出明显的条带(B.1节,3–7车道)CR三聚体组分含有显著水平的扩散和高M（M）_第页物种(D.1款,3–7车道). 后者代表构象异质性分子，这也从它们与构象特异性BnAb PGT145的不良反应性中明显可见(图5). 这些物种含量最高的组分的反应性最低。第三，未分离三聚体和折叠三聚体的原单体通过二硫键非特异性交联，而裂解三聚体则表现出较少的交联(图6). 第四，未分离三聚体更容易发生非特异性蛋白水解，蛋白酶K对CR三聚体的蛋白水解程度高于CP三聚体(图7). 最后，负染电镜显示，裂解三聚体呈三叶螺旋桨状颗粒(图4,B类和C类,面板3和4; 无参考二维类平均值如所示面板B.6和C.7款)而CR组分中此类颗粒较少(D类和E类;面板3–5)大多数为不规则形状。总的来说，上述结果与2G12方法产生的未分离三聚体和裂解三聚体的行为一致（参见表1) (26).

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图4。

分离和未分离JRFL gp140三聚体的纯化。 A类，通过Strep-Tactin柱从培养上清液中一步纯化Strep-tagged gp140。A.1款，还原各种gp140样品的SDS凝胶。S车道、培养上清液；车道1–6，从Strep-Tactin柱上用2.5 m洗脱的馏分米去硫生物素。A.2款，Superdex 200尺寸排除柱中gp140低聚物的典型洗脱曲线。答3，装载在SEC上的Strep-Tactin纯化gp140的BN凝胶(车道S)以及从SEC洗脱的三个主要级分(车道1–3，对应于峰值1–3如所示A.2、。B类，纯化293F细胞中表达的裂解三聚体。C类，纯化GnTI中表达的裂解三聚体⁻细胞。D类，纯化293F细胞中表达的未分离三聚体。E类，纯化GnTI中表达的未分离三聚体⁻细胞。以下适用于面板在里面B–E类。面板1SEC馏分的BN凝胶。面板2，还原对应于中所示部分的SDS凝胶面板1。面板3,4、和5，峰值SEC分数的负染EM。B.6节和C.7款，三聚体的无参考二维类平均值。凝胶用考马斯蓝染色。S车道，SEC上装载的起始材料（Strep-Tactin-purified gp140）。车道M,M（M）_第页标记。标记蛋白的kDa分子量显示在左边.

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图5。

293F细胞产生的未分离三聚体的构象异质性。SEC分数2-5来自图4D.1款在固定蛋白浓度为1μg/ml的Strep-Tactin平板上涂布，并使用BnAbs 2G12进行ELISA(黑条)或PGT145(蓝色条).插入考马斯蓝染色BN凝胶组分2-5，描述组分中存在不同数量的涂片。涂片显示BN凝胶上构象异质三聚体的差异迁移。请注意，与含有较少涂片的组分5相比，含有广泛涂片的第2组分对构象特异性PGT145 BnAb的反应性较差。另一方面，不依赖于三聚体构象的2G12-BnAb与级分2和5等效地反应。

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图6。

未分离三聚体的原单体与二硫键非特定交联。SEC纯化的JRFL三聚体（Strep-tag未分离(CR公司)，折叠式(财务总监)和链球菌标签裂解三聚体(人物配对关系))在非还原条件下电泳(A类)或减少(B类)没有的条件(车道1,三,5,7,9、和11)或使用(车道2,4,6,8,10、和12)PNGase F处理。注意梯子的高度M（M）_第页FD未分离三聚体和Strep-tag未分离三聚体中的条带(红色箭头在里面车道1和三)但不在劈开的三聚体中(车道5). 还原条件下的电泳和PNGase F处理表明，这些带对应于非特异性的二硫键交联原聚体，但不对应于糖基化的差异M（M）_第页在还原条件下，谱带被转换为单个谱带(车道7和9)，但经过PNGase处理后梯子仍然存在(车道2和4)，尽管脱糖基(DG公司)由于聚糖的去除，条带迁移速度更快（与车道1和三). 劈开的三聚体没有显示出高M（M）_第页非还原条件下的阶梯带(车道5)如预期，经过PNGase F处理后，转换为迁移速度更快的DG带(车道6). 在还原条件下，正如预期的那样，裂解三聚体产生gp120和gp41带阶梯(11号车道)以及更快迁移的DG gp120和单个DG gp41频段(12号车道)PNGase F处理后。

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图7。

切割和未切割JRFL三聚体的蛋白酶K敏感性。 A类293F或GnTI的SEC纯化三聚体⁻在37°C下，用所示浓度的蛋白酶K处理细胞1小时，并在还原性SDS凝胶上电泳，然后进行考马斯蓝染色。这个37°C车道对应于在37°C下孵育1小时而没有蛋白酶K的对照样品。注意，未分离三聚体比裂解三聚体更容易发生蛋白水解，并且293F三聚体比GnTI更容易发生蛋白质水解⁻三聚体。B类，未消化gp140条带的密度定量A类.

未发酵三聚氰胺是高糖基化的

我们观察到GnTI⁻细胞产生的三聚体质量比293F细胞好，尽管GnTI的产量较低⁻单元格(图4，比较面板在里面C类和E类用同样的面板在里面B类和D类). 例如，扩散高M（M）_第页GnTI生产的CR三聚体中未发现上述物种⁻单元格（比较D.1款和E.1类,1–7车道). 阴性染色EM显示GnTI中螺旋桨状三聚体数量较多⁻-产生的CR三聚体比293F-产生的三聚体（比较面板3–5在里面D类和E类)这在一定程度上是由于糖基化的异质性。GnTI公司⁻细胞主要添加Man5GlcNAc2，这是通过293F细胞中的复杂糖基化进一步处理的。在gp41的C末端存在Strep-tag II允许使用Strep-tag-specific单克隆抗体评估糖基化。在还原条件下电泳CPgp140三聚体时，出现了五条gp41带的梯形。其中，波段3的强度最大(图8,A.1款和A.2款). 因为JRFL gp41外结构域包含四个预测的簇N个-在其C末端附近连接糖基化位点，这些带可能对应于0–4个位点的糖基化。这一点通过PNGase F的脱糖基化得到了证实，它将梯形图转化为单个物种，迁移到与梯形图中最低条带相同的位置，即未糖基化的gp41(图8答3,车道2,4,6、和8). 虽然在293F和GnTI中观察到类似的模式⁻细胞中，完全糖基化的293F-gp41条带比来自GnTI的相同条带更扩散⁻-通用条款41(图8答3，比较车道1–3和5–7)可能是由于复杂的糖基化作用。BG505 CP-gp140显示出类似的带型，只是它似乎经历了更广泛的糖基化。这些结果显示了gp41糖基化的“微观异质性”，尽管293F细胞的糖基化程度高于GnTI细胞⁻细胞。先前的报告也推断出gp41糖基化的异质性(64,65).

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图8。

293F细胞产生的未发酵三聚体是高糖基化的。 A1类，使用Strep-tag II单克隆抗体还原SDS凝胶的Western blot，显示gp41胞外区带的阶梯。A.2款，中所示gp41梯形带强度的密度定量A.1、。答3，使用Strep-tag II特异性单克隆抗体还原SDS凝胶的Western blot。B.1节，未分离的非还原性SDS凝胶(CR公司)并被劈开(人物配对关系)293F或GnTI中产生的JRFL和BG505 gp140三聚体⁻细胞。B.2节，来自B.1节用PNGase F处理后，凝胶用考马斯蓝染色。车道M,M（M）_第页标记。标记蛋白的kDa分子量显示在左边.

未分离三聚体的异质性更为严重。事实上，293F细胞产生的未分离三聚体是“高糖基化”的。在非还原条件下，CP gp140和CR gp140都会迁移到相同的位置。当GnTI生产gp140时，他们确实做到了⁻单元格(图8B.1节,车道3和4). 293F gp140的迁移速度比GnTI慢⁻gp140（比较车道1具有车道4和车道2具有车道3)这是因为gp140在293F细胞中经历复杂的糖基化。然而，出乎意料的是，293F-生产的CR gp140迁移速度慢于CP gp140（相比之下车道1和2). 在与PNGase F脱糖基化后，293F或GnTI中产生所有gp140条带，无论是未分离的还是裂解的⁻单元，迁移到相同位置(图8B.2节). 平行测试的BG505 gp140也观察到相同的模式（参见BG505 5-8车道在里面图8). 这些结果表明，与裂解的三聚体相比，293F未裂解三聚体是高糖基化的。