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细胞研究。2015年8月；25(8): 930–945.
2015年7月14日在线发布。 数字对象标识：10.1038/cr.2015.84
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HNF1α调节反馈电路通过肝细胞和肝星状细胞之间的串扰调节肝纤维化

慧倩,1,4,* 邢登,1,* 黄兆伟,1,4,* 季伟,1 陈洪鼎,1 任信锋,1 Xin Zeng（曾欣）,1 陈月香,1 金鼎,三 雷秋,2 胡振林,2 张欣（Xin Zhang）,1 王宏扬（音）,三 张俊平,2,*和谢伟芬1,*
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摘要

肝细胞对维持肝内环境稳定至关重要，但其参与肝纤维化仍不明确。肝细胞核因子1α（HNF1α）是一种富含肝脏的转录因子，在肝细胞功能中起着关键作用。我们之前的研究显示HNF1α对肝癌有显著的抑制作用。在本研究中，我们报告HNF1α在人和大鼠纤维化肝脏中的表达均受到显著抑制。在大鼠二甲基亚硝胺（DMN）或胆道结扎（BDL）模型中，肝脏中HNF1α的敲除显著加剧肝纤维化。相反，强制表达HNF1α可显著减轻肝纤维化。HNF1α通过直接结合SHP-1启动子调节肝细胞中SH2结构域磷酸酯酶-1（SHP-1）的转录表达。抑制SHP-1表达可消除DMN治疗大鼠中HNF1α的抗纤维化作用。此外，HNF1α在原代肝细胞中的阻遏导致NF-κB和JAK/STAT通路的激活，并启动由HNF1β、SHP-1、STAT3、p65、miR-21和miR-146a组成的炎症反馈回路，维持肝细胞中HNF1 a的放松调节。更有趣的是，肝细胞和肝星状细胞（HSC）之间的协调串扰参与了这种正反馈回路，并促进了肝细胞损伤的进展。我们的发现表明受损的肝细胞在肝纤维化形成中发挥积极作用。早期干预HNF1α调节的肝细胞炎症反馈回路可能对慢性肝病的治疗有一定的疗效。

关键词：肝细胞核因子1α、肝纤维化、SH2域磷酸酶-1、microRNA、反馈、串扰

介绍

多种病因引起的慢性肝损伤与进行性肝纤维化有关，其特征是肝内过度生成和沉积细胞外基质（ECM）。纤维化最终导致肝功能丧失和肝结构破坏。人们普遍认为，将常驻肝星状细胞（HSC）激活为成纤维细胞样细胞是肝纤维化的标志1,2活化的HSC是纤维化细胞外基质（ECM）的主要生产者，被认为是抗纤维化治疗的一个有吸引力的靶点三,4然而，目前临床上尚无有效的治疗肝纤维化的方法。

肝细胞是肝脏中的主要细胞类型，其功能完整性对维持肝内稳态至关重要5,6众所周知，在所有动物模型中，肝纤维化的进展与大量肝细胞损伤相关7一些研究表明凋亡的肝细胞可能是HSC激活的主要炎症刺激物8,9,10TAK1、Mcl-1或Bcl-xL肝细胞特异性缺失诱导的肝细胞凋亡触发小鼠模型中的纤维化11,12,13然而，受损肝细胞在肝纤维化形成中的作用仍不清楚。此外，肝细胞损伤与HSC激活之间的关系尚不清楚。

肝细胞核因子1α（HNF1α）是一种POU同源域家族转录因子，在肝细胞功能的许多方面发挥着关键作用，包括糖的合成和储存、脂质代谢、解毒和血清蛋白的合成14,15,16.HNF1α基因敲除小鼠(HNF1型α−/−)肝脏急剧增大，并发生进行性肝损伤，导致肝细胞变性17,18.全基因组关联研究（GWAS）表明，HNF1α基因座中的SNP影响血浆中肝酶的水平19HNF1α还通过与CRP启动子直接结合调节细胞因子诱导的C反应蛋白（CRP）的表达20这些发现表明HNF1α在肝脏疾病的炎症反应中起主要作用。我们最近的研究表明，HNF1α的强制表达通过诱导肝癌细胞分化为肝细胞来阻碍小鼠肝细胞癌（HCC）异种移植的生长21然而，HNF1α在肝纤维化形成中的作用尚待阐明。

SH2域酪氨酸磷酸酶-1（SHP-1，也称为Ptpn6）主要在造血和上皮细胞中表达22,23被广泛认为是炎症的负调节因子24SHP-1通过跨膜受体（包括细胞因子受体和生长因子受体）的去磷酸化抑制细胞内信号转导25,26SHP-1还结合并去磷酸化活化的信号分子，如ERKs、JNKs、STATs、JAK2和NF-κB27最近的研究表明，肝细胞特异性Shp1敲除小鼠（Ptpn6H-KO公司)在高脂饮食（HFD）中生存时，可保护肝脏免受胰岛素抵抗的影响，并可发展为肝脏脂肪变性28,29然而，SHP-1在肝纤维化中的作用尚未见报道。

在本研究中，我们阐明了HNF1α在肝纤维化形成中的作用，并通过由HNF1 a、SHP-1、STAT3、p65、miR-21和miR-146a组成的炎症反馈回路阐明了肝细胞和HSC之间的串扰。

结果

HNF1α在大鼠和人纤维化肝中受到抑制

已知HNF1α是一种富含肝脏的转录因子。HNF1α调节肝细胞系必需基因的转录，并被用作成熟肝细胞的标记物15,30我们的结果表明，内源性HNF1α存在于肝细胞核中，而在大鼠肝脏非实质细胞的细胞核中未观察到(图1A). 有趣的是，随着二甲基亚硝胺（DMN）或胆管结扎（BDL）诱导的肝纤维化的进展，大鼠肝细胞中HNF1α的mRNA水平逐渐降低(图1B和补充信息，图S1). 大鼠纤维化肝脏中HNF1α的蛋白水平也降低(图1C). 在纤维化或肝硬化患者的肝脏中也观察到类似的现象(图1D和​和1E1E级)。

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HNF1α在纤维化肝中被抑制。（A）正常大鼠肝脏HNF1α的免疫组织化学染色。HNF1α仅在肝细胞细胞核中检测到（箭头）。非实质细胞无明显染色（箭头）。比例尺，100μm。（B）mRNA水平HNF1α通过实时PCR对接受二甲基亚硝胺（DMN，左）或胆管结扎（BDL，右）治疗的肝脏进行评估(n个=每组6人）。**P（P）< 0.01;***P（P）经Mann-Whitney U检验<0.001。（C）检测3只大鼠注射DMN（顶部）或BDL手术（底部）后肝脏中HNF1α蛋白水平。（D）散点图显示HNF1α通过RT-PCR分析评估12例人类对照和44例纤维化样本的表达水平。数据（中值）标准化为β-肌动蛋白、和P（P）该值通过Mann-Whitney U检验计算(P（P）= 0.0008).（E）对3名健康对照者和10名纤维化或肝硬化患者肝脏中HNF1α进行Western blot分析。

HNF1α下调加剧肝纤维化

然后，我们通过携带小发夹RNA的腺病毒抑制HNF1α的表达，探讨了HNF1的α减少对肝纤维化形成的影响HNF1α（AdshHNF1）DMN治疗或BDL手术前(补充信息，图S2A和S2B型). 单次注射AdshHNF1α可显著降低两种模型肝脏中HNF1的表达(图2A和​和2B）。2B型). 天狼星红染色显示，注射DMN两周后，经AdshHNF1α处理的肝脏有过多的ECM沉积，结缔组织连续网状浸润肝实质，而对照病毒处理的肝脏只有少量ECM沉积(图2A). 同样，AdshHNF1α治疗也导致BDL诱导的纤维化肝脏中更多ECM沉积(图2B). 与AdshNC对照组相比，HNF1α敲除在DMN和BDL纤维化模型中分别增加了202%和156%的ECM面积(P（P）< 0.01,图2C). 此外，HNF1α敲除上调了纤维化标记物α-SMA的表达，表明HSC的激活增强(图2A和​和2B）。2B型). 实时PCR显示，AdshHNF1α治疗后纤维化肝脏中α-SMA和COL1A1的mRNA水平也增加(图2D). 此外，在DMN模型中，AdshHNF1α治疗组的羟脯氨酸含量远高于AdshNC组（251.0±23.1μg/mg vs 163.2±13.2μg/mg，P（P）<0.01）和BDL模型（242.8±12.9μg/mg vs 167.3±12.9µg/mg，P（P）< 0.01). 此外，与对照组相比，AdshHNF1α治疗的纤维化肝中肝细胞中促纤维化和炎症细胞因子的表达也增加，包括TGFβ1、TNFα和IL-6(补充信息，图S3)。

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在DMN和BDL模型中，HNF1α的抑制都会加重肝纤维化。（A）,B）携带shRNA的腺病毒HNF1α在给大鼠注射DMN之前，将（shHNF1α）或阴性对照（shNC）注射到大鼠体内（A）和BDL处理（B）2周后用免疫组织化学方法分析肝纤维化组织中HNF1α和α-SMA的表达。苏木精-伊红（HE）和天狼星红染色用于检查病理改变和胶原沉积。（C）AdshHNF1α和AdshNC治疗大鼠肝纤维化中天狼星红染色的半定量分析(n个=每组10只大鼠）。（D）mRNA水平HNF1α,α-SMA和COL1A1公司通过实时PCR比例尺（100μm）检测肝脏。**P（P）< 0.01;***P（P）< 0.001.

据报道，腺病毒在动物体内诱导强烈的免疫反应，这可能影响肝纤维化31因此，我们使用携带shHNF1α的慢病毒在大鼠体内击倒了HNF1，并且我们再次观察到HNF1的击倒加重了DMN注射诱导的肝纤维化(补充信息，图S4A). 数据证实HNF1α的下调加剧了肝纤维化(补充信息，图S4)。

HNF1α过度表达改善肝纤维化

我们接下来测试HNF1α的过度表达是否可以减轻大鼠的肝纤维化。单次注射AdHNF1α(补充信息，图S2C和S2D系列)显著恢复肝纤维化肝细胞核中HNF1α的水平(图3A和​和3B）。3B公司). 与AdGFP对照组相比，注射AdHNF1α使DMN和BDL纤维化模型中的ECM面积分别减少了50.9%和49.8%(P（P）< 0.01,图3C). AdHNF1α处理后，纤维化肝脏中α-SMA和COL1A1的mRNA水平也降低(图3D). 在两种DMN模型中，AdHNF1α治疗的肝脏羟脯氨酸水平均显著低于AdGFP对照组（163.0±17.4 g/mg vs 259.3±23.7μg/mg，P（P）<0.01）和BDL模型（191.8±10.8μg/mg vs 252.5±12.2μg/mg，P（P）< 0.01). 与AdGFP对照组相比，AdHNF1α治疗组在两种纤维化模型中均显著降低了肝脏中的炎性细胞因子(补充信息，图S5). 同样，慢病毒感染上调HNF1α也能改善DMN诱导的肝纤维化(补充信息，图S6)。

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HNF1α过度表达可减轻肝纤维化。（A）,B）单剂量携带人腺病毒HNF1α在注射DMN（A）或BDL手术（B）后，将HNF1α基因或对照病毒（GFP）注射到大鼠体内。在DMN治疗后4周或BDL治疗后3周对纤维化肝脏进行分析。用免疫组织化学方法检测HNF1α和α-SMA的表达。HE和天狼星红染色用于检查病理改变和胶原沉积。（C）AdHNF1α或AdGFP治疗大鼠肝纤维化中天狼星红染色的半定量分析(n个每组6只大鼠）。（D）mRNA水平HNF1α,α-SMA和COL1A1公司实时PCR检测肝脏中的。比例尺，100μm。**P（P）< 0.01;***P（P）< 0.001.

HNF1α的抗纤维化作用主要取决于SHP-1型

众所周知，炎症会导致各种急慢性肝病的肝纤维化。据报道，许多酪氨酸磷酸酶参与炎症反应的调节32,33,34,35通过搜索高质量转录因子结合谱数据库，JASPAR36，6个酪氨酸磷酸酶基因的启动子区含有HNF1α的假定结合位点，被选为HNF1β的潜在靶点(补充信息，表S1). 有趣的是，HNF1αsiRNA对原代大鼠肝细胞的抑制显著降低了SHP-1型水平(图4A)，但对其他五种磷酸酶的表达没有显著影响（数据未显示）。我们还发现HNF1α和SHP-1型肝硬化（纤维化）患者的肝脏(图4B,第页= 0.8169,P（P）<0.0001），来自DMN模型的大鼠纤维化肝脏(补充信息，图S7A,第页=0.7909，P（P）=0.0037）和在DMN模型中用AdshHNF1α或AdHNF1(补充信息，图S7B)。

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HNF1α的抗纤维化作用取决于SHP-1的转录激活。（A）成绩单等级HNF1α和SHP-1型用AdshHNF1α或AdshNC处理的原代大鼠肝细胞。（B）mRNA水平之间的相关性HNF1α和SHP-1型在人体肝组织中。每个数据点代表一个单独的样本，并显示相关系数（r）。（C）启动子区的示意图SHP-1型，潜力顺式-HNF1α的作用元件（箭头）、突变位点和ChIP PCR中扩增的片段。（D）巢式缺失分析显示HNF1α对大鼠的反式激活作用SHP-1型发起人。（E）HNF1α入住率SHP-1型通过ChIP-PCR在新鲜分离的肝细胞中检测到的位点。（F）抑制SHP-1逆转HNF1α的抗纤维化作用。将AdshSHP-1或AdshNC与AdHNF1α同时输送到DMN治疗的大鼠体内。检测肝脏胶原沉积和HNF1α、SHP-1和α-SMA的表达。（G）测定纤维化肝脏中的羟脯氨酸含量(n个=每组9只大鼠）。比例尺，100μm。*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.01;***P（P）< 0.001.

为了进一步确定HNF1α对SHP-1型，一系列包含嵌套缺失的荧光素酶报告质粒SHP-1型启动子转染AdHNF1α感染的HeLa细胞(图4C). 该方法确定了一个潜在的HNF1α结合区域，位于-1563 nt至-2500 nt，相对于转录起始位点SHP-1型发起人(图4D). 突变实验表明顺式-中的作用元件SHP-1型启动子是诱导SHP-1型HNF1α转录(补充信息，图S7D). 染色质免疫沉淀（ChIP）分析证实HNF1与SHP-1型新分离肝细胞中的启动子(图4E). 总的来说，这些数据表明肝细胞中SHP-1的表达受HNF1α的转录调控。

验证SHP-1在HNF1α抗纤维化作用中的功能作用体内，我们同时将AdshSHP-1和AdHNF1α输送到DMN治疗的大鼠体内(补充信息，图S2E). SHP-1敲除降低了HNF1α诱导的胶原沉积减少和HSC活化的程度(图4F). AdSHP-1+AdHNF1α组的羟脯氨酸水平（278.9±25.8μg/mg）显著高于AdshNC+AdHNF1α组（181.6±10.8μg/mg，P（P）= 0.0059,图4G)。

由HNF1α、SHP-1、p65、STAT3、miR-21和miR-146a组成的炎症反馈回路加重肝细胞损伤

人们普遍认为SHP-1负调节炎症信号。在此，我们发现HNF1α的过度表达抑制了纤维化肝脏中p65（RelA）、STAT3和ERK的激活，而SHP-1的抑制可逆转这些激活(补充信息，图S8). 然后我们研究了HNF1α在肝细胞炎症信号中的作用。从DMN治疗大鼠分离的原代肝细胞中HNF1α和SHP-1的表达显著降低，而JAK/STAT和NF-κB信号通路被激活(图5A). 有趣的是，在这些受损的肝细胞中，包括IL-6、TNFα和TGFβ1在内的代表性炎症前和纤维化前细胞因子的表达水平显著增加(图5B). 此外，HNF1α在原代大鼠肝细胞中的敲除也导致STAT3和p65（RelA）的磷酸化(图5C)IL-6、TNFα和TGFβ1的表达增加(图5D). 此前的一项研究表明，IL-6对HBV感染肝细胞中HNF1α表达的抑制作用37一致地，我们还发现IL-6刺激降低了正常肝细胞中HNF1α的水平(图5E). 同样，TNFα治疗降低肝细胞中HNF1α的表达(图5F). 这些数据表明，炎症反馈机制可能维持受损肝细胞中HNF1α的放松调节。

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HNF1α抑制加重肝细胞炎症。（A）DMN治疗2周大鼠肝细胞裂解物中HNF1α、SHP-1和STAT3、p65磷酸化的Western blot分析。（B）mRNA水平HNF1α,SHP-1型,白介素-6,肿瘤坏死因子α和转化生长因子β1DMN治疗2周的大鼠肝细胞与对照大鼠相比。（C）经AdshHNF1α或AdshNC处理的肝细胞中HNF1 a、SHP-1、p65和STAT3的代表性western blot。（D）成绩单等级白介素-6,肿瘤坏死因子α和转化生长因子β1用AdshHNF1α或AdshNC处理肝细胞12-36小时。（E）,F）重组IL-6（rIL-6，50 ng/ml，E）或重组TNFα（rTNFα，20 ng/ml，F）刺激的肝细胞中HNF1α的蛋白水平。同时向培养基中加入兔抗IL-6（抗IL-6）或抗TNFα（抗TNF）抗体，分别阻断IL-6或TNFα的作用。对照组为正常兔IgG。*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.01;***P（P）< 0.001.

微RNA（miRNAs）是基因表达的重要转录后调节因子38为了阐明肝细胞中HNF1α被抑制的机制，我们搜索了microRNA.org网站可能直接调节HNF1α表达的miRNA候选网站。序列互补分析表明，HNF1α是miR-21、miR-31和miR-146a的潜在靶点(补充信息，图S9A)，所有这些都被证明参与炎症信号通路39,40,41我们发现这些miRNAs在DMN或BDL诱导的大鼠纤维化肝脏中升高(图6A和​和6B）。6亿). Western blot显示肝细胞中的HNF1α和SHP-1均被miR-21和miR-146a的模拟物显著抑制，而miR-31 minic无明显作用(图6C). mRNA水平HNF1α也被miR-21或miR-146a的模拟物降低(图6D). 荧光素酶分析显示miR-21或miR-146a的模拟物显著降低HNF1αHEK293T细胞中3′UTR报告活性(图6E). 总之，这些结果表明miR-21和miR-146a都可以直接抑制肝细胞中HNF1α的表达。

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HNF1α调节的炎症回路介导肝细胞损伤。（A）,B）DMN注射大鼠肝组织miR-21、miR-31和miR-146a的实时PCR分析(n个=每组6人）（A）和BDL处理(n个=每组6人）（B）.（C）转染指定miRNA模拟物72 h的肝细胞中HNF1α和SHP-1的Western blot分析。（D）mRNA水平HNF1α用miRNA模拟物转染肝细胞48小时。（E）miR-21和miR-146a模拟物对小鼠荧光素酶活性的影响HNF1αHEK293T细胞中的3′UTR。（F）转染miRNA抑制剂并用IL-6（rIL-6，左）或TNFα（rTNFα，右）处理48 h的肝细胞中HNF1α的Western blot分析。（G）AdshHNF1α或AdshNC处理的肝细胞中miR-21和miR-146a的水平。（H）肝细胞损伤中所提出的HNF1α反馈电路的示意图模型。*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.01;***P（P）< 0.001.

先前的研究表明，NF-κB激活上调miR-21和miR-146a的表达，而miR-21也被STAT3反式激活42,43在这里，我们还发现IL-6增加了肝细胞中miR-21的水平，但没有增加miR-146a的水平。siRNA抑制STAT3逆转IL-6上调miR-21表达(补充信息，图S9B)但没有改变miR-146a的水平。同样，抑制p65可以减弱TNFα诱导的miR-21和miR-146a的上调(补充信息，图S9C). 此外，miR-21抑制剂通过IL-6治疗减弱了HNF1α的减少。同样，miR-21和miR-146a抑制剂明显消除了TNFα刺激肝细胞对HNF1α的抑制(图6F). 此外，肝细胞中HNF1α的敲低导致miR-21和miR-146a的表达增加(图6G). 基于这些发现，我们得出结论，由HNF1α、SHP-1、STAT3、p65、miR-21和miR-146a组成的内在炎症反馈环可加重肝细胞损伤(图6H)。

HNF1α调节肝细胞和HSC之间的串扰

众所周知，HSC的激活是肝纤维化的中心事件三DMN治疗后受损肝细胞中炎性细胞因子的表达增加(图5B)或HNF1α抑制时(图5D)使我们研究了肝细胞中HNF1α表达对HSC活化的潜在影响。以前的研究已经证明在标准组织培养塑料上培养的HSC的渐进激活在体外HSC的自发激活可用于研究与肝损伤相似的细胞事件44因此，我们将原代HSC与HNF1α敲除或过表达的原代肝细胞共同培养(图7A). 值得注意的是，肝细胞中HNF1α的敲低导致α-SMA和COL1A1公司HSC中(图7B). 此外，IL-6或TGFβ1抗体阻断肝细胞HNF1α敲除对HSC激活的影响(图7C). 一贯地，在肝细胞中联合转染siHNF1α和siIL-6、siTgfb1可逆转肝细胞中HNF1 a敲低对HSC激活的影响(补充信息，图S10A). 相反，培养肝细胞中HNF1α的恢复显著抑制了α-SMA和COL1A1公司HSC中(图7D). 这些观察结果表明，肝细胞中HNF1α的抑制可以促进HSC的激活。

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HSC与肝细胞之间的串扰在体外.（A）大鼠原代HSC和肝细胞共培养实验示意图。（B）抑制肝细胞中的HNF1α可增强HSC的激活。western blot检测经AdshHNF1α或AdshNC预处理的原代大鼠肝细胞内源性HNF1 a水平（左）。mRNA水平α-SMA和COL1A1公司用RT-PCR（右）对例HSC进行评估。（C）mRNA水平α-SMA和COL1A1公司与AdshHNF1α或AdshNC处理的肝细胞共同培养的HSC。将抗IL-6、TNFα或TGFβ1的抗体加入共培养物中以阻断相应的细胞因子。（D）肝细胞过表达HNF1α可减弱HSC的活化。用western blot分析经AdHNF1α或AdGFP处理的肝细胞中外源性人和内源性大鼠HNF1 a的表达，如上图所示；mRNA水平α-SMA和COL1A1公司HSC中的显示在底部面板中。（E）与静止或激活的HSC共同培养48 h的肝细胞中HNF1α和SHP-1的Western blot分析。使用抗TNFα、IL-6抗体和对照IgG阻断共同培养中的细胞因子。（F）HNF1α和SHP-1在转染miRNA抑制剂的肝细胞中的表达，然后与静止或活化的HSC共培养48小时。

活化的HSC产生多种炎症细胞因子，包括IL-6和TNFα44然后我们询问活化的HSC是否影响肝细胞中HNF1α的表达。通过将原代肝细胞与HSC共培养，我们发现活化的HSC而非静止的HSC抑制肝细胞中HNF1α的表达，这种抑制可以通过中和IL-6或TNFα抗体来减弱(图7E). 敲除活化HSC中的IL-6或TNFα也增加肝细胞中HNF1α的表达(补充信息，图S10B)表明活化HSC释放的IL-6和TNFα可能抑制肝细胞中HNF1α的表达。此外，用miR-21或miR-146a抑制剂转染肝细胞也可以消除活化HSC诱导的HNF1α的减少(图7F). 总之，这些发现表明，microRNA-HNF1α炎症回路介导肝细胞和HSC之间的串扰，并推动肝细胞损伤和HSC激活的进展(图8)。

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HNF1α介导的反馈电路调节HSC和肝细胞之间的串扰。HSC和肝细胞之间拟议的自分泌调节和串扰的示意图。内源性炎症反馈回路可加重肝细胞损伤。miR-21和miR-146a对肝细胞中HNF1α的抑制导致IL-6和TGFβ1的产生增加，从而导致HSC的激活。另一方面，活化的HSC分泌IL-6和TNFα，进一步抑制肝细胞中HNF1α和SHP-1的表达。

讨论

在这项研究中，我们提供了一些证据表明HNF1α与肝纤维化有关。首先，在动物模型和人类慢性肝病的纤维化过程中，肝细胞中HNF1α的丰富表达逐渐下降。其次，在两个独立的大鼠模型中，抑制HNF1α会加剧肝纤维化。第三，HNF1α过度表达可减轻大鼠纤维化肝脏中ECM的沉积。我们之前已经证明HNF1α对肝癌有治疗作用21由于绝大多数HCC发生在纤维化或肝硬化的肝脏中，因此HNF1α对HCC和纤维化的双重作用将在临床实践中高度适用。我们以前的研究表明，上调HNF4α可以潜在地抑制肝纤维化45HNF1α对纤维化的类似作用为我们之前的假设提供了另一个支持，即调节血统决定转录因子（如HNF1和HNF4α）为慢性肝病的治疗提供了一种有希望的方法46.

虽然磷酸酶SHP-1主要在造血细胞中检测到，但它也在肝脏中表达，并且在肝癌组织中表达受到抑制47先前的研究表明，SHP-1通过调节肝脏中的胰岛素信号和胰岛素清除来调节葡萄糖稳态48最近的一项研究表明，SHP-1的肝细胞特异性缺失可促进小鼠肝脏脂质沉积28此外，Tai等报道称SHP-1是索拉非尼的主要靶点，索拉非尼布是第一种临床批准的治疗肝癌的药物，对肝纤维化具有额外的治疗作用49这些研究表明SHP-1在肝脏稳态中起着重要作用。在本研究中，我们发现HNF1α转录通过直接结合SHP-1启动子激活SHP-1表达。SHP-1的敲除可显著逆转HNF1α对纤维化以及JAK/STAT和NF-κB信号通路的抑制作用。这些结果表明，SHP-1抑制炎症通路对HNF1α的抗纤维化作用有显著作用。

Kupffer细胞和HSC在肝损伤后炎症反应中的炎性细胞因子生成中起重要作用50肝细胞表达多种炎症细胞因子受体，如IL-6和TNFα，表明肝细胞是细胞因子的潜在效应器51我们的实验表明，肝细胞中HNF1α的抑制促进STAT3和p65的磷酸化，从而导致IL-6和TNFα的升高。两种细胞因子水平的升高导致肝细胞中HNF1α的进一步抑制。这些结果表明，肝细胞是炎性细胞因子的另一来源，肝细胞损伤可以通过IL-6和TNFα以自分泌方式持续。微RNA是包括癌症和纤维化在内的多种疾病的关键调节因子52已明确miR-21由STAT3和NF-κB直接激活42,43LPS诱导免疫细胞产生miR-146a依赖于NF-κB43一贯地，肝细胞中的炎症细胞因子上调miR-21和miR-146a。IL-6或TNF-α对肝细胞中HNF1α的抑制由miR-21和miR-146a介导。综上所述，这些发现表明HNF1α是肝细胞保护细胞免受肝细胞损伤的监护人。HNF1α的下调启动由HNF1β、SHP-1、STAT3、p65、miR-21和miR-146a组成的反馈回路，该反馈回路使肝纤维化永久化。

据报道，Kupffer细胞和HSC之间的串扰可介导肝纤维化的进展53,52,54然而，在过去几十年中，肝细胞在肝纤维化形成中的作用研究相对较少。据报道，凋亡的肝细胞可以驱动HSC的激活11,12,13最近的一项研究表明，c-Myc在肝细胞中的过度表达有可能激发常驻HSC的活化、增殖和肌成纤维细胞分化55然而，受损肝细胞在慢性肝损伤中激活HSC的作用仍不明确。此外，HSC在肝再生中的作用及其潜在机制也远未明确。一些研究表明，活化的HSC可以刺激肝细胞再生56,57然而，易卜拉欣卡尼的一项研究等证明了HSC通过5-HT2B信号传导对肝细胞再生的负调控58这里我们展示了细胞因子介导的肝细胞和纤维化HSC之间的相互作用。肝细胞中HNF1α的敲低触发HSC的激活。由于在AdshHNF1α治疗的大鼠肝细胞中未观察到明显的凋亡（数据未显示），HSC的激活不能归因于肝细胞凋亡。此外，活化的HSC对肝细胞中HNF1α的抑制表明，肝细胞损伤不仅以自分泌方式诱导，而且以旁分泌方式诱导。考虑到肝脏中各种细胞类型之间的复杂相互作用，我们不排除其他肝细胞（如Kupffer细胞）在HSC激活中的作用。除IL-6、TNFα和TGFβ1外，其他细胞因子也可能参与肝细胞与HSC之间的串扰。

目前肝纤维化的治疗主要针对HSC。我们以前的研究表明，下调HNF4α促进肝纤维化形成，上调HNF4β通过阻断大鼠肝细胞EMT改善肝纤维化45目前的数据表明，HNF1α的减少可促进大鼠肝纤维化的发展，而HNF1的恢复可显著减轻大鼠的肝纤维化。鉴于肝细胞损伤是慢性肝损伤的普遍事件7我们认为恢复肝细胞功能，尤其是HNF1α或HNF4α的活性，可能是治疗肝纤维化的一种更有效的策略。

总之，本研究阐明了一种新的分子和细胞机制，该机制与肝细胞损伤和肝纤维化有关。这些发现突出了HNF1α和肝细胞在肝纤维化形成中的生物学意义，并启发了治疗慢性肝病的新策略。鉴于肝纤维化与肝癌之间的密切关系，HNF1α和SHP-1在肝细胞癌发生中的作用值得探讨。

材料和方法

人体组织样本

肝组织取自上海第二军医大学东方肝胆外科医院肝组织库。健康对照(n个=12）为正常肝脏或伴有血管瘤或脂肪瘤的肝脏。纤维化肝脏(n个=18）来自肝纤维化或肝硬化患者。所有受试者均获得知情同意书。该研究方案得到了第二军医大学科学调查委员会的批准。

实时PCR

从不同处理的肝组织、肝细胞和HSC中纯化的RNA进行逆转录，然后进行基于SYBR Green的实时PCR分析。mRNA表达根据β-actin进行标准化。如前所述，对MicroRNA表达水平进行量化59microRNA转录物根据U6进行标准化。对于每种情况，至少进行了三个独立的实验。引物序列可以在补充信息，表S2.

病毒

重组腺病毒AdHNF1α和AdGFP先前在我们实验室建立21.含有shRNA靶向的腺病毒载体HNF1α（AdshHNF1α）或SHP-1型（AdshSHP-1）和对照腺病毒（AdshNC）如前所述构建60.

为了产生用于击倒或过度表达HNF1α的慢病毒，使用FuGENE 6转染试剂（Promaga）将慢病毒载体（pmiRZIP-shHNF1 a或pCDH-CMV-HNF1 a-）与包装质粒psPAX2（Addgene）和包膜质粒pMD2.G（Addgene）共转染到亚流HEK 293T细胞中。48小时后收集含有慢病毒的培养基。如前所述，浓缩慢病毒颗粒，并在使用前将其储存在−80°C的低温瓶中61.

动物和治疗

雄性Sprague-Dawley大鼠（6周龄，约200 g，来自中国科学院上海实验中心）通过重复注射DMN（10 mg/kg，每周三次注射，持续2-4周）或胆管结扎（BDL）建立两种不同的肝纤维化模型。为了观察HNF1α对肝纤维化的抑制作用，单剂量4×109在首次注射DMN或BDL前2天，通过尾静脉注射pfu AdshNC或AdshHNF1α，2周后处死动物(补充信息，图S2A和S2B型). 使用慢病毒进行HNF1α敲除，单次剂量为1×108首次注射DMN前5天，通过尾静脉注射TU lent-shNC或lent-shHNF1α(补充信息，图S4A). 为了评估HNF1α的潜在疗效，单剂量为4×109在BDL后3天或首次注射DMN后2周通过尾静脉输送pfu腺病毒(补充信息，图S2C和S2D系列). 用慢病毒进行HNF1α过度表达，单次剂量为1×108第一次注射DMN后1周通过尾静脉注射TU lent-Ctrl或lent-HNF1α(补充信息，图S6A). 对DMN诱导的大鼠同时给予AdHNF1α和AdshSHP-1，以研究SHP-1在HNF1的抗纤维化作用中的作用(补充信息，图S2E). 所有动物实验均符合《国家卫生研究所实验动物护理和使用指南》，并经第二军医大学科学调查委员会批准。

组织学和免疫组织学分析

天狼星红用于胶原蛋白染色。对石蜡包埋的肝脏切片进行免疫组化。使用抗HNF1α（ab96777，Abcam）、α-SMA（BM0002，博斯特，中国武汉）、SHP-1（ab2020，Abcam）、p-Erk1/2（Thr202/Tyr2044370，细胞信号传导）、p-p65（sc-101752，Santa Cruz）和p-STAT3（Ser7279134，细胞信号传导）的抗体进行免疫组织化学。切片用ImmunoCruz染色™山羊ABC染色（Sc-2023，Santa Cruz）或EnVision兔/鼠检测试剂盒（GK500710，GeneTech，中国上海），并用苏木精进行复染。使用图像分析软件image-Pro Plus 6.0（媒体控制论）测量阳性染色部位的面积。计算肝组织相应区域的阳性面积百分比，以显示胶原沉积或蛋白质表达的强度。

肝羟脯氨酸含量的测定

测定肝水解物中的总肝羟脯氨酸水平。使用建城（中国南京建城A030-2）的商用试剂盒对100 mg湿肝样品进行酸水解，以测定羟脯氨酸的量。

细胞分离和治疗

原代肝细胞和HSC由雄性Sprague-Dawley大鼠制备，并按前述方法培养62,63用腺病毒载体感染肝细胞，感染倍数（MOI）为10。siRNA、miRNA模拟物、miRNA抑制剂及其阴性对照物（NC或NC抑制剂）由GenePharma（中国上海基因制药有限公司）合成，并按照制造商的说明用脂质体2000（Invitrogen）转染到肝细胞、HSC或HEK293T细胞。siRNA序列列于补充信息，表S3.

蛋白质印迹分析

细胞在RIPA缓冲液中裂解（P0013B，Beyotime，Suzhou，China）。蛋白质在10%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到甲醇活化的NC膜（HAHY00010，Millipore）。在4°C下与一级抗体孵育过夜之前，将膜在含有5%牛奶的PBS-T中封闭2小时。用驴抗鼠或驴抗兔二级抗体（分别为IRDye 700或IRDyde 800）孵育2小时后，使用奥德赛红外成像系统（LI-COR）在700或800 nm波长下检测并拍摄信号。所使用的一级抗体包括HNF1α（sc-10791，Santa Cruz）、SHP-1（sc-33162，Santa Cruz；610125，BD biosciences）、p-STAT3（Ser7279134，细胞信号传导）、STAT3（4904，细胞信号传导）、p-p65（Ser5363033，细胞信号传导）、p65（3987，细胞信号传导）和GAPDH（BSAP0063，Bioworld）。对于每种情况，至少进行了三个独立的实验。

染色质免疫沉淀

使用10μg抗HNF1α抗体（sc-6548，Santa Cruz）免疫沉淀来自未处理肝细胞的染色质片段。使用QIAGEN纯化试剂盒进行DNA提取。对SHP-1启动子中的HNF1α结合位点进行实时PCR分析。对于每种情况，至少进行了三个独立的实验。使用的引物如所示补充信息，表S4.

报告者构建和荧光素酶分析SHP-1启动子构建

测试HNF1α在SHP-1型启动子，大鼠SHP-1型从肝细胞基因组DNA中扩增出−2500、−1563、−640和−323/+165的片段。扩增片段在pGL3-Enhancer载体（E1771，Promega）中克隆千磅我和Xho公司I.测试HNF1α结合位点SHP-1型启动子区域，SHP-1型将启动子片段（−3100/−1951）插入pGL3-启动子载体（E1761，Promega）。使用QuikChange创建突变®定点突变试剂盒（200518，Stratagene）。向量构建的引物列在补充信息，表S5将预先感染腺病毒24小时的HeLa细胞与SHP-1型启动子载体和对照pRL-CMV载体（E2261，Promega）。荧光素酶活性通过Dual-Glo测定®荧光素酶检测系统（E2920，Promega）转染后48小时。每个构造至少进行了三个独立的实验。

HNF1α3′UTR结构

HNF1α从大鼠肝细胞cDNA中PCR扩增3′UTR并克隆到psiCHECK™-2矢量（C8021，Promega）位于Xho公司我和不是I.引物包括：正向5′-CCGCTCGAGGGATGGCTCTGGAGGTGTCTC-3′和反向5′-ATAAGATGCGGCCGCCAAACCCGTGTTTACACT-3′。HEK293T细胞与psiCHECK共转染-HNF1α3′UTR或控制载体和microRNA模拟物。转染24小时后测量荧光素酶活性。每种情况下至少进行三次独立的转染实验。

HSC和肝细胞的共培养

为了检测肝细胞中HNF1α的敲除对HSC的影响，将原代肝细胞（分离后48 h）以10的MOI感染AdshHNF1 a或AdshNC 12 h。用PBS彻底冲洗后，将肝细胞与原代HSC在0.4μm横穿板（3450，Corning）的上腔中共培养24 h。同时向培养基中添加抗IL-6（ab6672，Abcam）、TNFα（ab66579，Abcam）、TGFβ1（sc-146，Santa Cruz）或对照IgG（兔子）的抗体，以中和细胞因子。48～72h后采集HSC总RNA和肝细胞蛋白裂解物。为了检测HNF1α修复后的肝细胞对HSC的影响，将正常大鼠的原代肝细胞以10μMOI感染AdHNF1 a或AdGFP 12 h，用PBS冲洗，然后与原代HSC在跨well板中共同培养。24-72 h后提取HSC总RNA和肝细胞蛋白裂解物。

为了确定HSC对肝细胞的影响，从大鼠分离HSC。原代培养7天的HSC被用作激活的HSC，新鲜分离的HSC在2天内被用作静止的HSC。活化的HSC或静止的HSC与原代肝细胞在横穿板中共同培养。同时向培养物中添加抗体或miRNA抑制剂，以阻断细胞因子或miRNA的作用。48小时后提取肝细胞蛋白裂解物。对于每种情况，至少进行了三个独立的实验。

统计分析

结果显示为平均值±sem。双侧独立学生的t吨进行测试以分析基因和miRNA表达水平、羟脯氨酸含量、荧光素酶活性和组织学数据。使用Mann-Whitney方法对位置参数（中位数）数据进行分析。

致谢

我们感谢Zhao Hui Wei博士（TigerMed有限公司，中国上海）在统计分析方面提供的帮助。这项工作得到了国家自然科学基金（81470871；重点项目，81230011；创新研究群体，30921006）和上海市重点项目科学技术委员会（13JC1407400）的支持。

脚注

(补充信息链接到细胞研究网站。）

补充信息

补充信息，图S1

HNF1α在大鼠肝纤维化中的表达。

补充信息，图S2

诱导大鼠纤维化模型和治疗的示意图。

补充信息，图S3

HNF1α阻遏增加肝纤维化中促纤维化和炎症细胞因子的表达。

补充信息，图S4

HNF1α的下调增加了大鼠肝纤维化的发生。

补充信息，图S5

HNF1α过度表达可减轻DMN或BDL诱导的大鼠肝纤维化。

补充信息，图S6

HNF1α上调可降低大鼠肝纤维化的发生。

补充信息，图S7

SHP-1受HNF1α转录调控。

补充信息，图S8

HNF1α的抗纤维化作用主要依赖于SHP-1的转录激活。

补充信息，图S9

HNF1α被炎症相关miRNA下调。

补充信息，图S10

肝细胞和HSC之间的串扰由细胞因子介导。

补充信息，表S1-S5

JASPAR数据库预测HNF1α在六种磷酸酶基因（大鼠）启动子上的结合位点

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