转录因子淋巴增强因子1控制不变的自然杀伤T细胞扩增和Th2型效应器分化

iNKT细胞开发本质上需要LEF1

为了确定iNKT细胞发育缺陷是否与勒夫1^Δ/Δ细胞，我们生成了混合骨髓嵌合小鼠，其中勒夫1^Δ/ΔCD45.2型⁺骨髓祖细胞与对照CD45.1混合⁺CD45.2型⁺竞争细胞并移植到致命照射的CD45.1中⁺老鼠。Lef1型^Δ/ΔCD45.2型⁺CD45.1型⁻细胞占四聚体的79%⁻DP胸腺细胞和77%的ST0 iNKT细胞，证实LEF1不需要用于ST0细胞的发育(图1 I). 相反，只有13.2%的ST1-3 iNKT细胞来源于勒夫1^Δ/ΔCD45.2型⁺CD45.1型⁻骨髓细胞，证明勒夫1^Δ/ΔST0后细胞处于不利地位(图1 I). 失去勒夫1^Δ/Δ当计算ST0和ST1-3 iNKT细胞总数时，ST1–3 iNKT细胞尤其明显(图1 J).勒夫1^Δ/ΔiNKT细胞在肝脏中也同样处于不利地位，只有13.9%的iNKT细胞来源于CD45.2⁺人群，而TCRβ的40%⁺细胞为CD45.2⁺CD45.1型⁻(图1、K和L). 我们的数据表明，正常生成的ST1–3 iNKT细胞以及外周iNKT细胞需要LEF1。

LEF1控制iNKT细胞增殖和存活

为了更好地了解LEF1的功能，我们检测了iNKT细胞发育各个阶段细胞中LEF1的表达。我们使用IL-2/15受体（CD122）的β链来解析ST3 iNKT细胞，因为我们的小鼠处于FVB/NJ背景，无法表达经典的NK细胞标记NK1.1。CD122表达与ST3转录因子TBET直接相关，CD44和CD122分离CD24^洛iNKT细胞转化为ST1（CD44^洛CD122型⁻)，ST2（CD44⁺CD122型⁻)和ST3（CD44⁺CD122型⁺)单元格(图2 A). 我们发现LEF1在ST1和ST2细胞中高度表达，并且在ST3的大多数细胞中不存在(图2 B). LEF1在ST0 iNKT细胞中也高表达(图2 B). 因此，LEF1在iNKT细胞发育的早期表达。

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图2。

LEF1促进iNKT细胞增殖并调节抄送127和c-myc公司基因。（A） TBET（左）或CD44（右）和CD122在WT-FVB/NJ Tetr上的表达⁺CD24型^洛流式细胞术检测胸腺iNKT细胞。显示了每个象限中的细胞百分比和iNKT细胞阶段。（B） 通过流式细胞术测定WT FVB/NJ小鼠所示iNKT细胞阶段中LEF1的表达，并显示为直方图。如A（ST1、ST2和ST3）和图1 C（ST0）。对照样品为LEF1染色勒夫1^Δ/ΔiNKT细胞。这些图代表了每个基因型至少10个独立实验，每个基因型有一到两只小鼠。（C） 对照组和对照组胸腺中Ki67、BrdU或FLICA阳性的iNKT细胞期染色百分比勒夫1^Δ/Δ老鼠。图表示四个独立实验的平均值。（D） LEF1和CD127在CD4t中的表达（选通为CD4^你好CD8（CD8）^洛TCRβ⁺CD69型⁺)流式细胞术检测WT FVB/NJ胸腺细胞。CD4t胸腺细胞（E）或对照和对照的ST0和ST1（F）iNKT细胞中（E和F）CD127的表达勒夫1^Δ/Δ通过流式细胞术测定小鼠。数据代表了每个基因型用一到两只小鼠进行的四到八个独立实验。实心灰色直方图显示同型对照抗体染色。（G） CD127的平均百分比⁺对照组ST0和ST1 iNKT细胞内CD127的MFI（左）或MFI勒夫1^Δ/Δ老鼠。每个基因型一只小鼠的六个独立实验的平均数。（H） 的表达式抄送127mRNA相对于Hprt（小时）来自分拣的ST0 iNKT细胞（Tetr⁺TCRβ⁺CD24型^你好)通过qRT-PCR测定。条形图表示三个独立实验的平均值。（I和J）LEF1染色质结合由分选的CD4t胸腺细胞（I）或ST1/2上的α-LEF1 ChIP测定Vα14Tg胸腺iNKT细胞（J；Tetr⁺TCRβ⁺CD24型^洛CD122型⁻)然后使用跨越TCF1/LEF1结合位点的引物进行qPCR抄送127和c-myc公司启动子区或位于β-珠蛋白基因位点。数字表明免疫沉淀DNA相对于β-珠蛋白来自三个独立实验的轨迹。（K） c的表达式-myc公司mRNA相对于Hprt（小时）通过qRT-PCR测定分选的ST0、ST1和ST2 iNKT细胞的mRNA。条形图表示三个独立实验的平均值。所有误差条代表SEM。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。

我们的数据表明，LEF1对于iNKT细胞的扩增、存活或分化是必需的。确定是否勒夫1^Δ/ΔiNKT细胞被发出适当进入细胞周期的信号，我们检测了它们Ki67的表达，Ki67是进入细胞周期细胞的标记，以及它们在复制过程中将胸腺嘧啶类似物BrdU并入DNA的能力。与之前的研究一致(D’Cruz等人，2014年)，我们发现近60%的对照ST0/ST1 iNKT细胞表达Ki67，并且当细胞转化为ST1时，以BrdU掺入为标志的增殖最大(图2 C;Gapin等人，2001年;Benlagha等人，2002年). 与对照细胞相比，只有35%勒夫1^Δ/ΔST0/ST1 iNKT细胞为Ki67⁺表明LEF1影响了进入细胞周期的细胞数量。尽管约4%的对照ST0细胞掺入了BrdU，但基本上没有BrdU掺入勒夫1^Δ/ΔST0-iNKT细胞，以及勒夫1^Δ/ΔST1细胞还显示BrdU掺入显著降低(图2 C). 来自对照小鼠的ST2和ST3 iNKT细胞Ki67表达较低，与ST1细胞相比，BrdU掺入较少，LEF1对Ki67或BrdU在这些细胞中的掺入没有必要(图2 C). 我们还发现勒夫1^Δ/Δ与用荧光标记半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂（FLICA）染色的对照小鼠相比，ST1 iNKT细胞的细胞频率更高，FLICA是一种与凋亡期间触发的活化半胱氨酸蛋白酶不可逆结合的试剂(图2 C). Ki67染色、BrdU掺入和FLICA反应性在来自勒夫1^Δ/Δ与对照小鼠相比，表明LEF1缺陷对iNKT细胞有特异性影响（未描述）。我们的数据表明，LEF1是ST0/ST1 iNKT细胞胸腺内扩增所必需的，它保护这些细胞免受凋亡。

LEF1直接监管抄送127和c-myc公司iNKT细胞中的基因

iNKT细胞扩增需要CD127，即IL-7受体（IL-7Rα；Tani-ichi等人，2013年). 我们发现LEF1的表达与CD4中的CD127直接相关⁺过渡性（CD4t；CD4⁺CD8（CD8）^洛CD69型⁺TCRβ⁺)胸腺细胞，包括ST0-iNKT细胞，导致我们质疑LEF1是否可以调节CD127的表达(图2 D). 事实上，CD127表达在勒夫1^Δ/ΔCD4t胸腺细胞与对照细胞的比较(图2 E). 此外，显著减少勒夫1^Δ/Δ与对照小鼠相比，ST0和ST1 iNKT细胞表达CD127，CD127的平均荧光强度（MFI）也降低(图2，F和G). CD4单阳性胸腺细胞中CD127表达略有下降，CD8胸腺细胞保持不变（未描述）。与这些发现一致，抄送127来自勒夫1^Δ/Δ与对照小鼠相比(图2 H).

LEF1相关转录因子TCF1直接调节抄送127Th2细胞和ILC2中的表达(Yu等人，2009年;Yang等人，2013). 因此，我们质疑LEF1是否可以调节抄送127直接。事实上，我们发现LEF1在抄送127通过抗LEF1染色质免疫沉淀（ChIP）和定量PCR（qPCR）测定CD4t细胞和iNKT细胞中的基因；图2、I和J)表明LEF1直接调控抄送127在这些细胞中。

虽然IL-7R信号促进iNKT细胞的胸腺内增殖，但致癌转录因子c-myc公司对于最佳扩张也是至关重要的(Dose等人，2009年;Mycko等人，2009年). 我们发现c-myc公司mRNA在勒夫1^Δ/ΔST1-ST2 iNKT细胞(图2 K). c（c）-myc公司在B细胞和T细胞中IL-7R信号的下游受到调节，但它也是上皮细胞中LEF1的靶点(Morrow等人，1992年;Yip-Schneider等人，1993年;Lim和Hoffmann，2006年;Nakashima等人，2013年). 我们发现LEF1与c绑定-myc公司CD4t细胞和iNKT细胞中的基因座，证明LEF1可以调节这两种细胞抄送127和c-myc公司(图2、I和J). 总的来说，这些数据表明LEF1是正确表达镉127和c-myc公司，这可能有助于减少胸腺内扩张勒夫1^Δ/ΔiNKT细胞。

LEF1促进iNKT2细胞的发育

我们的数据表明，LEF1在所有iNKT细胞的发育中发挥了重要作用。然而，与对照胸腺iNKT细胞相比，ST1和ST2细胞的频率降低，ST3细胞的频率增加勒夫1^Δ/Δ胸腺iNKT细胞(图3，A和B)尽管所有iNKT细胞的数量都有所减少(图3 C). 最近的研究表明，ST3 iNKT细胞在很大程度上与TBET同义⁺iNKT1细胞，而ST2细胞是RORγt的混合物⁺iNKT17细胞和GATA3^你好iNKT2细胞，也在ST1细胞中发现。标志性iNKT细胞转录因子PLZF在iNKT细胞亚群中也有差异表达，iNKT2细胞中表达最高(Lee等人，2013年). 为了确定LEF1缺陷如何影响iNKT细胞效应器亚群，我们检测了勒夫1^Δ/ΔiNKT细胞表达PLZF和RORγt，可用于解决iNKT1（PLZF^洛RORγt⁻)，iNKT2（PLZF^你好RORγt⁻)和iNKT17（PLZF^整数RORγt^你好)单元格(图3 D). 根据这个定义，iNKT1和iNKT17细胞的频率略有增加，而iNKT2细胞在勒夫1^Δ/ΔiNKT细胞与对照组比较(图3、D和E)尽管，正如预期的那样，所有iNKT效应器亚群的绝对数量都减少了。(图3 F). 肝脏和脾脏中的iNKT细胞总数也减少勒夫1^Δ/Δ小鼠与对照小鼠的比较(图1 H); 然而，在这些组织中，与iNKT1细胞相比，iNKT2细胞的频率降低(图3，G和H). 总之，我们的数据表明，在iNKT细胞扩增后，LEF1促进了iNKT2细胞的发育。

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图3。

iNKT2开发需要LEF1。（A） CD44和CD122在门控Tetr上的表达⁺CD24型^洛来自对照组和对照组胸腺的iNKT细胞勒夫1^Δ/Δ用流式细胞仪检测小鼠。（B和C）对照组和对照组总iNKT细胞中ST1、ST2和ST3细胞的平均百分比（B）和数量（C）勒夫1^Δ/Δ老鼠。数据是八个独立实验的平均值，每个基因型一只老鼠。（D） Tetr中PLZF与RORγt的表达⁺CD24型^洛来自对照组和勒夫1^Δ/Δ小鼠用于解决iNKT1（PLZF^洛RORγt⁻)，iNKT2（PLZF^你好RORγt⁻)和iNKT17（PLZF^整数RORγt⁺)流式细胞术检测效应细胞亚群。数字显示了每个群体在总iNKT细胞中的百分比。（E和F）对照组和对照组胸腺中iNKT1、iNKT2和iNKT17细胞的平均百分比（E）和数量（F）Lef1型^Δ/Δ老鼠。数据是五个独立实验的平均值。（G） 用PLZF和TBET的表达鉴定对照组和对照组肝和脾中的iNKT1和iNKT2细胞勒夫1^Δ/Δ流式细胞术检测小鼠。（H） iNKT2和iNKT1在来自对照组和勒夫1^Δ/Δ老鼠。数字是三个独立实验的平均值。所有误差条代表SEM。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。

LEF1是产生IL-4的iNKT2细胞发育所必需的

与CD4相比，iNKT细胞效应器命运的细胞因子产生谱更具灵活性⁺Th细胞对应物。IL-4和IFNγ的双重产生是iNKT细胞的一个特征，这归因于其PLZF的高表达(Savage等人，2008年). 事实上，一些PLZF^你好经PMA和离子霉素体外刺激后，iNKT细胞同时产生IFNγ和IL-4，而PLZF^洛iNKT细胞只产生IFNγ(图4 A). 鉴于大多数PLZF^你好这些细胞是iNKT2细胞，我们预计LEF1将需要用于双IL-4+IFNγ产生人群的发育。事实上，用PMA和离子霉素体外刺激总iNKT细胞表明勒夫1^Δ/ΔiNKT细胞产生Th2细胞因子IL-4，IL-4和IFNγ产生者的频率也降低(图4、B和C). 相比之下勒夫1^Δ/Δ仅产生IFNγ的iNKT细胞与对照小鼠没有差异，并且产生IL-17A的细胞增加(图4、B和C). 因此，LEF1也需要用于产生IL-4和IFNγ的功能性iNKT2细胞的发育。

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图4。

LEF1促进产生IL-4或IL-4加IFNγ的iNKT细胞的发育。（A） IL-4和IFNγ在PLZF中的表达^你好和PLZF^洛用PMA和离子霉素体外刺激胸腺细胞4小时后，通过流式细胞术检测iNKT细胞。（B） 胸腺中IL-4、IFNγ或IL-17A的表达⁺TCRβ⁺来自对照组和勒夫1^Δ/Δ小鼠在用PMA和离子霉素体外刺激胸腺细胞4小时后。图是四到六个独立实验的代表。（C） 平均控制百分比和勒夫1^Δ/Δ表达IL-4、IFNγ、IL-4加IFNγ或IL-17A的iNKT细胞。数据是六个独立实验的平均值。（D） CD8α和EOMES在TCRβ中的表达⁺CD8α⁺流式细胞术检测胸腺细胞。（E） EOMES的平均百分比⁺TCRβ中的细胞⁺CD8α⁺来自四个独立实验的胸腺细胞。所有误差条代表SEM。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

在一些小鼠株中，iNKT2细胞产生的IL-4达到诱导发育中的CD8 T细胞中EOMES表达的水平，导致其转化为先天效应样细胞(Verykokakis等人，2010年;Weinreich等人，2010年;Lee等人，2013年). 我们发现，在FVB/NJ小鼠中，约8%的CD8 T细胞表达EOMES，这与iNKT2细胞的高频率一致(图4、D和E). 此外，该表型依赖于LEF1，因为这些EOMES⁺CD8 T细胞在勒夫1^Δ/Δ老鼠(图4、D和E). 这些观察结果与功能性IL-4产生的iNKT2细胞数量减少相一致勒夫1^Δ/Δ老鼠。

LEF1表达与GATA3、PLZF和Th-POK相关

为了确定LEF1如何调节iNKT2细胞的发育，我们进一步考虑了哪些iNKT细胞亚群表达LEF1。如所示图2 BLEF1在ST0、ST1和ST2细胞中高表达，但在ST3细胞中极低。当我们根据PLZF和TBET的表达分离出iNKT细胞效应器亚群时，我们发现LEF1表达在iNKT2（PLZF^你好TBET（待定）⁻)iNKT1（PLZF^洛TBET（待定）⁺)或iNKT17（PLZF^整数RORγt⁺)单元格(图5 A). 与其他转录因子相比，LEF1的表达与GATA3和PLZF成比例，并且与TBET在很大程度上呈反相关，这与iNKT2细胞中LEF1的最高表达一致(图5 B). LEF1在RORγt中的水平很低⁺细胞，并与Th POK共表达，Th POK是一种抑制iNKT17细胞发育并促进CD4发育的转录因子⁺iNKT细胞(图5 B;Enders等人，2012年;Engel等人，2012年). 这些数据表明，LEF1在iNKT2细胞中表达最高，其表达与GATA3、PLZF和Th-POK直接相关，这些转录因子与CD4表达和iNKT3命运相关。

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图5。

LEF1表达与CD4、GATA3、PLZF和Th-POK相关，并支持CD4的发育⁺iNKT细胞。（A） 通过流式细胞术测定WT FVB/NJ小鼠iNKT效应细胞中LEF1的表达，并显示为直方图。对照样品为LEF1染色勒夫1^Δ/ΔiNKT细胞。图中至少有四个独立的实验，每个基因型有一到两只小鼠。（B） 流式细胞术检测WT FVB/NJ胸腺iNKT细胞中LEF1和GATA3、TBET、PLZF、RORγt或Th-POK的表达。显示了每个象限中的单元格百分比。图代表了至少六个独立实验，每个基因型有一到两只小鼠。（C和D）总iNKT细胞（C）或iNKT2（PLZF）中LEF1和CD4的表达^你好待定⁻)，iNKT1（PLZF^洛TBET（待定）⁺)和iNKT17（RORγt⁺TBET（待定）⁻; D） 流式细胞术检测WT-FVB/NJ小鼠胸腺细胞。结果代表了至少四个独立实验。（E） CD4在对照组和对照组胸腺iNKT细胞上的表达勒夫1^Δ/Δ用流式细胞仪测定小鼠，并以直方图显示。（F和G）CD4的平均百分比（F）和数量（G）⁺和CD4⁻CD8（CD8）⁻所示小鼠株中的（DN）胸腺iNKT细胞。数据平均来自10个以上的独立实验。（H） CD45.1型⁺CD45.2型⁺对照组和CD45.1⁻CD45.2型⁺ 勒夫1^Δ/Δ以1:1的比例混合FACS分选的LK骨髓细胞，并将其转移到致命照射的CD45.1中⁺C57BL/6小鼠。6-8周后，通过流式细胞术分析重组小鼠对照组CD4的表达（CD45.1⁺CD45.2型⁺)和勒夫1^Δ/Δ（CD45.2⁺)胸腺iNKT细胞。（一） cCD4中LEF1的表达⁺胸腺细胞（cCD4），胸腺CD4⁺用流式细胞术检测iNKT和胸腺DN-iNKT细胞。LEF1缺陷iNKT细胞中的LEF1染色为实心灰度直方图。直方图代表了每个基因型至少10个独立实验，每个实验使用一到两只小鼠。（J和K）对照组或对照组胸腺中cCD4细胞的百分比（J）和数量（K）勒夫1^Δ/Δ老鼠。图表显示了10个独立实验的平均值。误差线代表SEM。**，P<0.01；****，P<0.0001。

LEF1支持的CD4⁺iNKT细胞的发育和阻止外周iNKT细胞上CD8的表达

iNKT细胞缺乏共受体蛋白CD8的表达，但这些细胞中有一部分表达CD4，这与产生IL-4的能力有关(Lee等人，2013年). 在传统T细胞和iNKT细胞中，CD4的表达和CD8的抑制是由Th2转录因子GATA3及其下游靶Th POK介导的(Wang等人，2010年). 鉴于LEF1的表达与GATA3直接相关，并且是功能性iNKT2细胞发育所必需的，我们质疑是否删除勒夫1也会出现CD4和CD8表达方面的GATA3缺陷(Kim等人，2006年;Wang等人，2010年). 正如所料，我们发现LEF1在CD4亚群中最高⁺iNKT细胞(图5 C). 大部分CD4⁺iNKT细胞是iNKT2细胞，但iNKT1和iNKT17细胞的一小部分也表达CD4和LEF1(图5D). 重要的是，CD4的频率⁺胸腺细胞减少勒夫1^Δ/ΔiNKT细胞与对照组相比，尽管CD4和CD4的总数⁺DN iNKT细胞减少(图5，E–G). CD4选择性丢失⁺细胞是固有的勒夫1^Δ/ΔiNKT细胞，因为它是在混合骨髓嵌合动物中观察到的(图5 H). 值得注意的是，尽管LEF1在常规CD4（cCD4）T细胞中高度表达(图5 I)，它们的频率和总数在勒夫1^Δ/Δ小鼠与对照组的比较(图5、J和K). 因此，LEF1是CD4正常发育所必需的⁺胸腺中的iNKT细胞。

在肝脏和脾脏中勒夫1^Δ/Δ小鼠，CD4的频率⁺iNKT细胞减少，新的CD8群体⁺iNKT细胞出现(图6，A和B). 肝iNKT细胞上CD4的丢失和CD8表达的增加是细胞凋亡的内在原因勒夫1^Δ/Δ混合骨髓嵌合体中测定的细胞(图6、C和D). 我们检测了Th-POK在Lef1型^Δ/Δ脾iNKT细胞，因为Th-POK被认为是一个GATA3靶点，可抑制镉8在这些细胞中的表达(Wang等人，2010年)LEF1表达与GATA3和Th-POK均相关(图5 B). 我们发现，在缺乏LEF1的情况下，Th-POK表达降低，特别是在表达CD8的iNKT细胞中(图6 E). 因此，与GATA3相似，LEF1需要Th-POK的正确表达并促进CD4的发育⁺同时阻止外周iNKT细胞上CD8的表达。

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图6。

LEF1抑制外周iNKT细胞CD8α的表达。（A） Tetr上CD4和CD8的表达⁺TCRβ⁺来自对照组或勒夫1^Δ/Δ用流式细胞仪检测小鼠。（B） CD4的平均数量⁺、DN和CD8⁺来自对照组和勒夫1^Δ/Δ老鼠。数据平均来自至少六个独立实验。（C） CD45.1型⁺CD45.2型⁺对照和CD45.1⁻CD45.2型⁺ 勒夫1^Δ/Δ以1:1的比例混合FACS分选的LK骨髓细胞，并将其转移到致命照射的CD45.1中⁺C57BL/6小鼠。6-8周后，用流式细胞术分析重组小鼠在对照组或对照组的CD4和CD8表达勒夫1^Δ/Δ来自肝脏的iNKT细胞。（D） CD4的平均百分比⁺、DN和CD8⁺来自竞争性BM嵌合体的肝iNKT细胞。数据代表了三个独立的实验，每个实验有两到三个嵌合体。（E） 通过流式细胞术测定所示小鼠脾iNKT细胞中Th-POK和CD8α的表达。数据是五个独立实验的代表，每个基因型一到两只小鼠。所有误差条代表SEM。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

在iNKT细胞中，LEF1独立于TCF1发挥功能

我们质疑LEF1缺乏是否会影响iNKT细胞中TCF1的表达，因为TCF1对CD4至关重要⁺Th2细胞分化和ILC2发育，通常与LEF1重复或占优势。TCF1在所有iNKT细胞中表达，LEF1的表达与这些细胞的一个子集中的TCF1直接相关(图7 A). 与LEF1一样，TCF1在ST1和ST2 iNKT细胞中表达最高(图7 B); 然而，TCF1在CD4和CD4中都表达⁺和DN iNKT细胞以及ST3 iNKT细胞(图7、B和C). 与这种表达模式一致，TCF1在iNKT2和iNKT17细胞中的表达水平与cCD4相当⁺iNKT1细胞中的T细胞和低水平(图7 B). 重要的是，TCF1在对照组和勒夫1^Δ/ΔST1和ST2 iNKT细胞，表明LEF1缺陷引起的iNKT细胞发育变化不是TCF1缺失的结果(图7 D). TCF1表达在勒夫1^Δ/ΔST3 iNKT细胞，提示当LEF1缺失时，这些细胞或其祖细胞中可能存在TCF1的选择(图7 D). 因此，我们的数据揭示了LEF1在iNKT细胞扩增和iNKT2细胞发育中的关键功能，尽管TCF1在所有iNKT细胞中表达，但TCF1并没有补偿这些功能。

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图7。

TCF1表达不受勒夫1在iNKT细胞中。（A） 流式细胞术测定总WT FVB/NJ iNKT细胞中LEF1和TCF1的表达。（B） 通过流式细胞术测定WT FVB/NJ胸腺细胞中指定iNKT期（左）或iNKT亚群（右）TCF1的表达，并显示为直方图。实心灰色或对照表示TCF1缺陷型iNKT细胞中的抗TCF1染色，并用作阴性对照。CD4中（C和D）TCF1的表达⁺来自对照组和勒夫1^Δ/Δ用流式细胞仪检测小鼠。数据是四个独立实验的代表。

我们感谢Kee、Gounari和Bendelac实验室的成员进行了有益的讨论并提供了试剂，感谢Fotini Guunari对手稿的评论，感谢Aditya Rao对小鼠基因分型的帮助，感谢芝加哥大学流式细胞术核心设施对细胞分选的帮助，以及感谢Brian Green对畜牧业的帮助。

这项工作得到了国家卫生研究院对B.L.Kee的资助（R01 CA99978/AI106352和R56 AI104303）。B.L.Kee是白血病和淋巴瘤学会的学者。T.Carr获得了免疫学跨学科培训计划（T32 AI007090）的支持。薛海宏得到了美国癌症学会（RSG-11-161-01-MPC）和美国国立卫生研究院（R01 AI105351）的支持。

作者声明没有竞争性的经济利益。

作者贡献：T.Carr、M.Verykokakis和V.Krishnamoorthy进行了实验；S.Yu和H.H.Xue提供了勒夫1^{飞行/飞行}小鼠品系；B.L.Kee和M.Verykokakis监督研究；B.L.Kee获得资金；T.Carr、B.L.Kee和M.Verykokakis设计并分析了实验，解释了数据，并撰写了论文。