表观遗传与序列特异性招募脱钩

摘要

单个细胞可以产生具有不同基因表达模式和表型的后代，而不会改变其DNA序列。在真核细胞中，引起这种表型或表观遗传状态的主要机制包括组蛋白翻译后修饰和染色质结构的改变(1,2). 染色质的基本单位是核小体，核小体由147 bp的DNA组成，两次包裹在由组蛋白H2A、H2B、H3和H4组成的八聚体上(三). 组蛋白高度保守的碱性氨基末端，以及在较小程度上的球状结构域，包含各种影响核小体稳定性或为激活或抑制转录的效应器提供结合位点的翻译后修饰(4–8).

近四十年来，人们已经知道，在DNA复制过程中，亲本组蛋白被保留并随机分布到新合成的子DNA链上(9–12). 因此，提出组蛋白修饰的组合（有时称为“组蛋白密码”）负责基因表达模式的表观遗传记忆是合乎逻辑的(13,14). 然而，以往将序列特异性建立与维持分离的尝试未能为显示稳定表观遗传表达状态的系统中纯粹基于组蛋白的遗传机制提供明确支持(2,15,16). 最值得注意的是沉默子，即在芽殖酵母中调节沉默染色质低乙酰化结构域建立的DNA序列酿酒酵母持续需要，以保持静默状态(17,18). 类似地果蝇属多梳反应元件（PRE）与酵母沉默剂类似，持续需要用于维持H3K27甲基化域和报告基因沉默(19,20). 因此，在没有来自潜在DNA序列的任何输入的情况下，组蛋白是否可以作为表观遗传信息的载体仍然是一个问题。

裂变酵母绒球裂殖酵母在其近中位DNA重复序列、亚中层区域和沉默交配型基因座上包含广泛的异染色质结构域(21). 这些结构域具有多细胞真核生物异染色质的许多特征，如H三K（K）9甲基化，这是由人类Suv催化的39h同源Clr4，与HP1蛋白（Swi6和Chp2)组蛋白乙酰化不足。此外，S.pombe公司异染色质表现出表观遗传特性，异染色素内插入报告基因的细胞表现出多样的报告基因表达(22). 这些报告基因的ON和OFF状态可以通过有丝分裂和减数分裂细胞分裂以顺式稳定传递(23,24). 然而，由于这些表观遗传的观察是在本地序列中进行的，因此不能排除序列特异性元素对异染色质稳定的贡献(2). 为了确定异染色质维持是否可以从启动异染色质建立的序列中分离出来，我们在S.pombe公司通过将Clr4甲基转移酶催化域融合到细菌四环素阻遏物（TetR）蛋白。这使我们能够建立一个扩展的异色结构域，并通过四环素介导的从DNA中释放TetR-Clr4或删除TetR模块来研究其启动子依赖性维持。我们的结果表明，H3K9甲基化的结构域可以遗传>50没有序列特异性招募的世代，并定义假定的去甲基化酶Epel在H擦除中的中心作用三K（K）9甲基化和Clr4甲基转移酶的色域在其维持中的作用。

异染色质的诱导建立

通过与异源DNA结合蛋白融合，组蛋白修饰酶异位募集到染色质中，可以建立沉默的染色质结构域(25,26). 为了创建异染色质形成的诱导系统，我们融合了一种缺乏氨基末端色结构域的Clr4蛋白（与甲基化的his tone H3K9结合所需），同时保留其酶促甲基转移酶活性的细菌TetR蛋白（TetR-Clr4-I表示TetR-Clr4-Initiator）(图1A). TetR DNA结合域有助于蛋白质靶向包含同源DNA结合序列的位点，并且这种招募活动通过添加四环素（TetR_远离的系统）(27). 我们生成了TetR-Clr4-I取代野生型Clr4的细胞(TetR-clr4-I型)或野生型Clr4完整且TetR-Clr4-I插入另一个位点的细胞(TetR-clr4-T型,氯丁橡胶4⁺). 有无菌株的比较氯丁橡胶4⁺允许我们评估Clr4色域对建立和/或维护的贡献。为了生成报告基因座，我们替换了eu-chromatic尿酸4⁺带有ade6⁺启动子上游含有10个四环素操作符的基因(10X测试O-ade6⁺) (图1A).ade6⁺在腺嘌呤浓度有限的培养基上生长时，沉默会导致红色或粉红色菌落的形成，因此提供了一个方便的视觉报告器(22).

在单独的窗口中打开

图1

外源异染色质在添加四环素后序列特异性建立后丢失

(A类)TetR-Clr4-l引发剂介导的H3K9甲基化在ura4Δ：：10XtetO-ade6⁺轨迹。四环素（tet）促进TetR-Clr4-l从四氧化二铁站点，以便测试启动器独立维护。(B类)测试ade6⁺在无四环素（-tet）和有四环素存在（+tet）的低腺嘌呤培养基上沉默。ade6+沉默会导致红细胞聚集。中心的ade6⁺(otrlR:：ade6)，仅目标轨迹(ura4Δ：：10XtetO-ade6⁺)、和ura4Δ：：ade6⁺细胞分别作为阳性和阴性对照。(C类)染色质免疫沉淀（ChlP）-qPCR实验评估FLAG标记的TetR-Clr4-l与10XtetO-ade6型⁺存在和不存在四环素的位点。（−）表示来自不表达TetR-Clr4-l的细胞的背景ChIP信号。在四环素存在下，TetR-Clr4-l占用率接近背景水平。(D类)ChlP-seq实验表明，TetR-Clr4-l诱导了一个新的H3K9me2结构域，该结构域围绕着四人制-ade6⁺两侧约20 kb的位点（用红色突出显示），在有或无细胞中抄送：r4⁺，添加四环素24小时后损失。图SI显示了（D）中样品的H3K9me2 ChlP-qPCR数据和H3K9 me3。染色体3（插入位点10X测试O-ade6⁺)和1号染色体（左着丝粒1，厘米1L)坐标显示在轨道上方，读取的数字（每百万）显示在右侧。H3K9me2，DNA重复厘米1L作为ChlP-seq数据的内部控制。

如所示图1B，个单元格包含10X测试O-ade6⁺报告人结合TetR-Clr4-I融合蛋白的表达，而不是那些仅含有融合蛋白或报告人的表达，在缺乏四环素（-tet）的低腺嘌呤培养基上形成粉红色菌落。与之前的观察结果一致(26)，静音不需要氯丁橡胶4⁺表明Clr4的色域不需要用于新异染色质的建立(图1B)，但依赖于HP1蛋白（Swi6和Chp2）和组蛋白脱乙酰酶（Clr3和Sir2），它们在H3K9甲基化的下游起作用(图S1A). 然后将在没有四环素的情况下生长的菌落接种在含有四环素（+tet）的培养基上，以确定从DNA中释放TetR-Clr4-I后是否可以保持沉默状态。四环素依赖性地从tetO位点释放TetR-Clr4-I导致沉默丧失，如白色菌落的形成所示(图1B，+tet）。染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实，添加四环素导致TetR-Clr4-I从10倍测试位点，因为在四环素存在的情况下，TetR-ChIP信号接近背景水平，类似于在缺乏TetR-Clr4-I的细胞中观察到的信号(图1C). 此外，ChIP结合高通量测序（ChlP-seq）和ChlP-qPCR实验表明，H3K9二甲基和三甲基化（H3K9me2和me3）的40-50kb结构域包含10X测试O-ade6⁺在生长培养基中加入四环素后24小时（约10次细胞分裂），该区域完全消失(图1D图SI，B至D）。我们对携带野生型氯丁橡胶4⁺除了TetR-clr4-I型(图1D以及图SID，较低的2行）。这些结果表明，序列特异性起始剂从DNA中释放后，H3K9甲基化的一个结构域和相关的沉默状态在10次细胞分裂中被逆转。

从序列特定启动中解耦的遗传

含有H3K9me标记的结构域的遗传的最低机械要求是识别预先存在的H3K9甲基化组蛋白，并对新沉积的组蛋白进行修饰。TetR-Clr4-I释放后H3K9二甲基化a～45kb结构域的丢失(图1D)可能是由于与转录和染色质重塑相关的核小体交换过程，或者是由于去甲基化酶对甲基标记的擦除。或者，异位位点和天然异色结构域之间的竞争可能促进该结构域甲基化的快速衰退，以获得在维持中发挥关键作用的有限蛋白质库。

为了测试这些不同的场景，我们构建了TetR-clr4-I型,10X测试O-ade6⁺单元格（有或无氯丁橡胶4⁺)携带与各种染色质维持途径有关的基因缺失(28–30). 删除环境保护计划1⁺，编码假定的组蛋白H3K9去甲基酶(30)如tet培养基上出现的红色菌落所示，不影响沉默的建立TetR-clr4-I型,epe1Δ单元格和TetR-clr4-I型,第4类⁺,epe1Δ单元格(图2A，左侧）。与…对比环境保护计划1⁺细胞，epelΔ在四环素存在下，细胞形成红色、白色和扇形集落，表明在释放引发剂后保持沉默状态，并且只有在含有野生型拷贝的细胞中才能观察到这种表型氯丁橡胶4⁺(图2A，右侧，将最后两行与前两行进行比较）。ChIP实验证实四环素的添加促进了TetR-Clr4-I从四氧化二铁站点(图2B). 与菌落颜色沉默实验一致，ChlP-seq和ChlP-qPCR实验也表明H3K9的大区域二甲基和三甲基围绕着10X测试O-ade6⁺轨迹丢失于TetR-clr4-I型,epelΔ细胞，但保存在TetR-clr4-I型,第4类⁺,epelΔ单元格(图2C和图S2、A至C)添加四环素后24小时。在这个域中，其他几个转录单位的表达在tet培养基上被沉默，这种沉默在四环素添加后维持了几个小时(图S3).

在单独的窗口中打开

图2

删除埃佩尔⁺允许在释放TetR-Clr4-l后维持异染色质

(A类)颜色沉默分析表明，在TetR-clr4-l中，氯丁橡胶4⁺,epelΔ细胞沉默维持在+tet培养基上。(B类)ChIP实验表明TetR-Clr4-l从四氧化二铁+tet培养基中的位点。(C类)ChlP-seq实验表明epelΔ细胞H3K9me2在加入四环素24小时后维持第4类⁺-依赖方式。（C）和（D）中样品的H3K9me2 ChlP-qPCR和H3K9 me3 ChlP-seq数据见图S2误差条表示标准偏差。染色体3（插入位点10X测试O-ade6⁺)和1号染色体（左着丝粒1，厘米1L)坐标显示在轨道上方，读取的数字（每百万）显示在右侧。H3K9me2在厘米1L作为ChlP-seq数据的内部控制。

在中保持静默状态epelΔ细胞需要HP1蛋白（Swi6和Chp2）以及Clr3和Sir2组蛋白脱乙酰酶(图3A)但不是Dicer核糖核酸酶（Dcri）或Argonuate蛋白（Agol）(图3、B和C). 因此，维持需要作用于H3K9甲基化下游的机械，但独立于基于RNAi的机制发生。与Epel作为去甲基酶的观点一致环境保护计划1⁺含有活性位点突变的等位基因（epel-K314A和epel-H297A) (30,31)显示与缺失相似的维持表型(epelΔ) (图3D). 此外，符合氯丁橡胶4⁺在维护中(图2A)，更换氯丁橡胶4⁺用一个clr4-IΔ等位基因（缺乏色域）导致在+tet培养基上只形成白色菌落(图3E). 因此氯丁橡胶4⁺剂量，红色/扇形菌落的外观取决于Clr4与完整的脊索瘤的存在。

在单独的窗口中打开

图3

维护启动器独立静默状态的要求

(A类)建立和维护需要HP1蛋白（Swi6和Chp2）和HDAC（Clr3和Sir2）。(B类)异位沉默的维持epelΔ红细胞的生长表明，细胞不需要Dicer（Deri），dcrlΔ+tet培养基上的细胞。（C） 维持异位沉默epelΔ红细胞的生长表明，细胞不需要精氨酸（Agol），agolΔ+tet培养基上的细胞。(D类)要么删除重剑(epelΔ)或其活性部位的突变(epel-K314A或epel-H297A)允许在释放TetR-Clr4-I启动器后保持关闭状态。(E类)更换氯丁橡胶4⁺具有clr4ΔCD，编码缺少色域的Clr4，消除启动子依赖性沉默。

为了确定染色质的其他可能对维护很重要的特征，我们删除了两个与转录相关的基因，毫秒2⁺，编码组蛋白乙酰转移酶(32)、和集合1⁺，编码组蛋白H3K4甲基转移酶(33). 在这两种情况下，我们都观察到强于野生型建立（-tet）和弱维持（+tet）效应(图S4、A和D). 虽然在四环素培养基上生长3天后对菌落颜色没有明显影响，但我们观察到H3K9甲基化的持续性以及TerR-Clr4-I的释放mst2Δ添加四环素24小时后的细胞(图S4、B和C). 然后我们测试了不稳定的内源性异色区域是否可以通过删除波兹尔⁺，端粒异染色质形成所需的DNA结合蛋白(34)，或dcrl公司⁺，这是在着丝粒处RNAi依赖性异染色质形成所必需的(35) (图S5). 在这些突变体中，对菌落颜色没有影响(dcrlΔ,图S5A)或微妙的(pozlΔ,图S5D)，但我们清楚地观察到在两种缺失背景中释放TetR-Clr4-I后24小时后H3K9甲基化持续存在(图S5、B、C、E和F).

这些结果表明，在没有序列特异性启动的情况下，通过有丝分裂细胞分裂可以维持H3K9二甲基化结构域及其相关的沉默状态。这种表观遗传状态的衰变率主要受假定的去甲基化酶Epel清除甲基化标记的影响，在较小程度上受促进内源性位点转录或异染色质组装的途径的影响。我们注意到，维持的效率与初始沉默状态（建立）的强度无关，这表明对每个途径的扰动导致释放或招募对异染色质的建立和/或维持有不同贡献的蛋白质亚群。

由于不同的缺失基本上改变了异位H3K9甲基化的衰变率，我们假设在少数细胞分裂的时间尺度上，野生型细胞中也可能存在异位基因座的表观遗传学维持。为了观察具有较高时间分辨率的沉默染色质的衰变，我们生成了一个GFP报告子被TetR-Clr4-I沉默的细胞尿酸4⁺编码Ura4-GFP融合蛋白的基因。此外，我们插入了相同的10倍测试早期实验中使用的114bp片段上游的位点尿酸4⁺发起人(图4A). 如通过FACS分析所确定的，10XtetO-ura4-GFP在有或无氯丁橡胶4⁺为了评估衰变率，我们将生长在缺乏四环素培养基中的细胞（GFP OFF细胞）转移到含有四环素的培养基中，并在0、3、6、9、12、15、23、26、32、36、39、50、60、77和100小时采集样本进行FACS分析。这些时间点子集的FACS数据显示在图4，B到E，绘制所有时间点的结果图4F一般来说，添加四环素后10XtetO-ura4-GFP其中之一是记者epelΔ或epelA在~2天的时间范围内与10X测试O-ade6⁺沉默结果(图4、B和C). 由于具有较高的时间分辨率和检测表型表达状态的敏感性，我们发现转移到四环素培养基后，约10%的TetR-clr4-I，clr4+，epeT细胞中的OFF状态持续40小时（约20个细胞分裂）(图4、D和F)，而单元格包含TetR-clr4-I型,第4类⁺,epelΔ，显示出最稳定的维持模式，约60%的细胞在含有四环素的培养基中生长100小时（约50次细胞分裂）后仍保持OFF状态(图4E). 这些观察结果表明表观遗传维持并不是epelΔ细胞，其检测通常被Epe1快速擦除H3K9me标记所掩盖。而含有TetR-clr4-I型,环境保护工程⁺很快（<6小时），即使在这种背景下，Epel的缺失也会导致较慢的衰减速度(图4E). 我们观察到GFP OFF状态TetR公司-第4-I条,epelΔ细胞缺乏氯丁橡胶4⁺，转移到四环素培养基后6小时，仅在转移后约23小时完全转移到ON状态(图4C). 在这些细胞中，消除Epel后，衰变率可能主要由修饰组蛋白的稀释决定，在没有Clr4介导的重建的情况下，修饰组蛋白可能会在几代内保持表观遗传状态。

在单独的窗口中打开

图4

使用GFP报告基因释放TetR-Clr4-l后沉默状态衰减的动力学揭示了埃佩尔⁺细胞

(A类)的示意图10XtetO-ura4-GFP轨迹。(B类到E类)添加四环素后0、6、23和100小时，FACS对指示菌株中GFP表达的分析显示了GFP-OFF细胞分布的时间演变。(F类)绘制了添加四环素后0到100小时之间的时间点数据，以显示GFP-OFF细胞的分数随时间的变化。剂量-反应曲线拟合用作指导。

可以认为，在基于引发剂的实验中维持H3K9甲基化和沉默状态可能是由于四环素存在下TetR-Clr4-I与DNA的低亲和力结合引起的(27). 我们试图明确排除序列特异性启动在我们观察到的遗传中的任何作用，我们使用同源重组来取代TetR-clr4-I型具有clr4-lΔ含有TetR DNA结合域的缺失(图5A). 改造后更换TetR-clr4-T型具有clr4-lΔ在选择性低腺嘌呤介质上电镀(图5A和图5图例），我们获得了红色、扇形和白色菌落，这些菌落通过等位基因特异性PCR检测和确认为替换事件(图S6). 红色的隔离clr4-lΔ,epelΔ细胞证实，在完全不存在序列依赖性Clr4募集到DNA的情况下，可以维持沉默状态。此外，镀红clr4-lΔ,epelΔ低腺嘌呤培养基上的细胞产生红色和白色集落(图5B)，同时镀白clr4-lΔ,epelΔ分离物只产生白色菌落(图5C). 在没有发起者和其他重建手段的情况下，沉默状态的丧失是一个不可逆转的事件(图5C). 与TetR结构域的删除一致，ChIP实验显示，TetR占用信号在10X测试O-ade6⁺基因座(图5D). 另一方面，我们检测到H3K9二甲基化在10X测试O-ade6⁺红色而非白色分离物的基因座(图5E). 我们的结论是，一旦组装，沉默的染色质和组蛋白H3K9甲基化在10X四氧六烯酸⁺该位点可以在完全没有序列特异性招募的情况下保持。为了确定启动子依赖性沉默状态是否也可以通过减数分裂遗传，我们将缺乏TetR DNA结合域的相反交配型红色单倍体细胞杂交(clr4-lΔ,氯丁橡胶4⁺,epelΔ)，获得二倍体细胞(图6A). 然后，这些二倍体细胞形成孢子，在四分体分离后，将产生的单倍体后代置于低腺嘌呤培养基上。如所示图6B，由此产生的单倍体细胞大多形成红色或扇形菌落，表明沉默状态也是通过减数分裂细胞遗传的。

在单独的窗口中打开

图5

TetR DNA结合域缺失后保持沉默和H3K9甲基化

(A类)显示转换的实验方案的图表TetR-clr4-l型到clr4-IΔ，它缺少招聘活动，因为它不再绑定到四氧化二铁地点。扇形和红色的隔离clr4-IΔ细胞在完全缺乏TetR DNA结合域的情况下保持(B类)，而白色clr4-IΔ菌落表明沉默不可逆转(C类). (D类)ChlP-qPCR实验表明，FLAG标记的TetR-Clr4信号可以在四氧化二铁中的站点clr4-IΔ细胞。(E类)ChlP-qPCR实验显示沉默状态下H3K9甲基化水平升高clr4-IΔ细胞（红色分离物），但甲基化的背景水平阿德6⁺表达（白色）clr4-IΔ细胞。误差线表示标准偏差。

在单独的窗口中打开

图6

启动子依赖性沉默通过减数分裂细胞的遗传

(A类)无声（红色）配合方案ade6⁺所示基因型的单倍体细胞，其中缺失了TetR-Clr4l。在二倍体细胞产孢后，四分体被切割，单倍体减数分裂后代被镀在低腺嘌呤介质上(B类). 四个四分体的解剖结果显示了沉默状态的遗传和杂色。

H3K9me在天然异染色质上的遗传

接下来，我们确定了与观察到的异位位点相似的表观遗传维持机制在多大程度上也可能在自然状态下起作用S.pombe公司着丝粒周围重复序列。虽然RNAi是沉默插入着丝粒周围重复区的报告基因所必需的，但RNAi组分的缺失并不能完全消除H3K9甲基化和沉默(36,37) (图7A). RNAi缺失中残留的H3K9甲基化可能由表观遗传维持机制或着丝粒内微弱的RNAi独立建立信号引起(38). 为了检测可能在着丝粒周围重复序列中运行的RNAi非依赖性信号的存在，我们确定了在RNAi因子缺失的细胞中，H3K9甲基化是否可以在重复序列中从头建立dcr1型⁺或阿戈尔⁺为了进行这个实验，我们重新引入了氯丁橡胶4⁺进入之内clr4Δ,clr4Δ agolΔ，或clr4Δ dcrlΔ单元格(图7B)并使用ChlP-seq和ChlP-qPCR定量H3K9二甲基化水平。如所示图7C，重新引入第4类⁺进入之内clr4Δ细胞在1号染色体的着丝粒周围dg和dh重复区完全恢复H3K9二甲基化。相反，氯丁橡胶4⁺重新引入clr4Δ agolΔ或clr4Δ dcrlΔ双突变体细胞未能促进H3K9二甲基化(图7，C和D). 这些结果表明，RNAi是近着丝粒H3K9me结构域序列特异性建立的主要机制，并表明RNAi成分缺失后在这些重复序列中观察到的H3K9是表观遗传维持的结果。

在单独的窗口中打开

图7

着丝粒周围重复序列的RNAi非依赖性H3K9甲基化是表观遗传的

(A类)ChlP-seq实验显示组蛋白H3K9me2残留在着丝粒周围的持久性分布式电源和dh公司1号染色体的重复agolΔ和dcrlΔ细胞。在llumina HiSeq2500平台上对库进行测序，并将其归一化为百万分之一读数（y轴）。染色体坐标如图所示。(B类)重新引入氯丁橡胶4⁺进入之内RNAiΔ,clr4Δ用于测试H3K9me设施中RNAi需求的细胞。氯丁橡胶4⁺为了避免过度表达，将其重新导入本地基因座。(C类)ChlP-seq实验表明氯丁橡胶4⁺进入之内clr4Δ单元格，但不是clr4ΔagolA或clr4Δ dcrlΔ细胞，在1号染色体的着丝粒周围重复区恢复H3K9me2（左）。1号染色体端粒H3K9me2的读数(电话)右侧显示，与着丝粒不同，端粒H3K9me的建立不需要RNAi。(D类)ChlP-qPCR实验证实，在近着丝粒dg重复序列中重建H3K9me2需要RNAi。(E类)ChlP-qPCR实验表明，Clr4的色域发生突变(clr4W31G型)取消H3K9me2的维护分布式电源重复。(F类)ChlP-qPCR实验表明，野生型的额外拷贝氯丁橡胶4⁺，但不是第4W31G条，提高残留H3K9me2水平分布式电源误差条表示标准偏差。

我们的异位异染色质实验确定了Clr4的色域在H3K9me表观遗传中的作用(图2到​至5）。5). 与中心点周围重复序列的RNAi非依赖性H3K9me由表观遗传机制维持的假设一致，中心点的残留H3K9 me分布式电源年废除了重复agolΔ 第4类W31G双突变细胞(图7E). Clr4-W31G在色域中包含一个突变，减弱与H3K9me的结合(39). H3K9me的完全损失agolΔ clr4-W31G型因此，双突变体细胞表明，残留的H3K9me标记是由一种机制维持的，该机制涉及到Clr4对先前存在的标记的直接色域依赖性补充。为了进一步支持这个假设，引入了一个额外的野生型拷贝氯丁橡胶4⁺，但不是clr4-W31G型突变体，到agolΔ细胞将残留的H3K9甲基化水平提高了约3倍(图5F). 总之，这些结果支持一种直接的“读写”机制，即Clr4与预先存在的H3K9甲基化核小体结合，并催化新沉积核小体上的H3K9甲基化，以保持异染色质独立于诱导甲基化的初始信号。值得注意的是，在RNAi突变细胞中埃佩尔⁺,毫秒2⁺和poz1（poz1）⁺提高H3K9me水平并在着丝粒周围重复区不同程度地恢复沉默(28–30). 此外，与它在H3K9me遗传中的作用一致，Clr4的色域也是H3K9 me在交配型位点进行RNAi非依赖性传播所必需的(40). 我们的结果表明，H3K9甲基化的表观遗传学维持，而不是替代的建立途径，是这些缺失背景中RNAi非依赖性沉默的主要原因。

讨论

我们对H3K9甲基化和沉默染色质的有丝分裂和减数分裂遗传的研究发现，在没有序列特异性招募的情况下，不需要与RNAi或其他已知修饰系统（如DNA CpG甲基化）相关的小RNA阳性反馈环，强烈提示H3K9甲基化修饰的组蛋白可以作为表观遗传信息的载体。这一结论得到了以下证据的支持：（1）我们的证据表明，分裂酵母假定组蛋白H3K9去甲基酶的缺失，埃佩尔⁺稳定表观遗传OFF状态，并允许其通过>50个细胞分裂进行传播，（2）需要Clr4甲基转移酶色域，这是一个识别二甲基和三甲基H3K9的域，表明这种表观遗传模式的直接读写机制。

最近的几项研究描述了环境诱导的基因表达变化从父母到后代的转基因遗传(41). 这种跨代遗传的机制尚未完全确定，但似乎是通过小RNA依赖和独立途径发生的。在秀丽线虫组蛋白修饰模式的传递通常与小RNA生成和/或CpG DNA甲基化有关(42–44). 后一种途径可以形成正反馈环，帮助维持组蛋白修饰模式(2,45). 正反馈环的这种耦合将增加沉默结构域的重建速率，从而抵消酶如Epel的擦除活性或增加组蛋白周转速率的机制。

以前的一项研究使用了小分子二聚化策略，表明小鼠成纤维细胞Oct4位点H3K9甲基化的外源诱导结构域在去除小分子诱导物后可以通过CpG DNA甲基化加强的机制得以维持(46). 然而，与这里介绍的实验不同，Oct4基因座的使用，通常被包装成成纤维细胞的异染色质(46)，排除了关于序列依赖性遗传的任何结论，因为不能排除在分化细胞中通常沉默Oct4的位置特异性序列元素的贡献。因此，H3K9甲基化是否可以独立于特定DNA序列或哺乳动物细胞中H3K9-脱甲基酶活性的调节而遗传，尚待确定。此外，在裂变酵母中，先前的一项研究报告了异位异染色质依赖性沉默ade6⁺在切除着丝粒DNA片段后，由着丝粒基因片段诱导的等位基因以RNAi依赖的方式保持(47)，表明可能以某种方式在ade6⁺有助于保持沉默状态的轨迹。然而，这些发现与其他研究相矛盾，这些研究表明沉默尿酸4⁺在没有诱导发夹的情况下，发夹产生的小RNA不能维持等位基因(48,49). 我们的发现表明，即使没有与其他正反馈回路或序列依赖的启动信号的耦合，H3K9甲基化也定义了一种可以表观遗传的沉默状态(图S7). 关闭状态的维持可能取决于Clr4读写器模块的H3K9甲基化率与Epel依赖机制、转录偶联核小体交换和DNA复制期间组蛋白稀释导致的去甲基化损失率之间的平衡。

虽然脱甲基酶活性S.pombe公司Epel蛋白尚未在体外得到证实，其他Jumonji结构域蛋白中去甲基化酶活性所需的关键残基在Epel中保存，并需要其体内沉默作用(30,50)，及其对异染色质启动子依赖性遗传的影响（本研究，图4C). 此外，最近的一项研究表明，人类PHF2（Jumonji结构域蛋白家族的另一成员）的活性受磷酸化调节(51)，增加了Epel脱甲基酶活性重建可能需要翻译后修饰或辅因子的可能性。组蛋白去甲基化活性的调节可能在决定表观遗传状态的可逆性方面起着广泛的作用。虽然尚不清楚Epel活性或水平是否调节S.pombe公司组蛋白去甲基化酶活性的调节与多细胞真核生物发育转变的控制有关。在小鼠胚胎干细胞中，多能性转录因子Oct4激活Jumonji结构域Jmjdla和Jmjd2c H3K9脱甲基酶的表达，这种激活似乎对干细胞自我更新很重要(52). 一个有吸引力的可能性是，当表观遗传状态在从多能性向分化状态的过渡过程中建立时，H3K9去甲基化酶表达的减少有助于稳定分化状态(52). 在另一个例子中，在哺乳动物鼻子中单个嗅觉受体（OR）基因激活期间，胺氧化酶家族组蛋白去甲基化酶LSD1的下调被认为是为了创建一个“表观遗传陷阱”，阻止其他OR基因的激活(53). 更普遍地说，H3K9去甲基化酶可以作为监视酶，防止虚假的H3K9甲基化结构域的形成，这可能导致表观遗传突变和基因失活。

补充材料

致谢

参考文件和注释