临床投资杂志。2015年1月2日;125(1): 194–207.
代谢编程和PDHK1控制CD4+T细胞亚群与炎症
,1 ,1 ,1,2,三 ,1,2,三 ,2 ,三 ,1 ,4 ,5 ,6 ,6 ,6 ,5 ,1 ,7 ,6 ,6 ,8 ,4 ,1,三 ,2和1,2,三
Rigel J.Kishton公司
1药理学和癌症生物学系,
阿曼达·G·尼科尔斯
1药理学和癌症生物学系,
2免疫学系
三美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学杜克分子生理研究所。
安德鲁·N·麦金太尔
1药理学和癌症生物学系,
2免疫学系
三美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学杜克分子生理研究所。
奥尔加·伊尔卡耶娃
三美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学杜克分子生理研究所。
Bhavana Priyadharshini公司
5美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院和哈佛医学院外科。
玛尔塔·斯拉文斯卡
6瑞士巴塞尔诺华生物医学研究所,自体免疫,移植和炎症。
利亚·海伯里
6瑞士巴塞尔诺华生物医药研究院,自身免疫、移植和炎症。
凯瑟琳·哈克
6瑞士巴塞尔诺华生物医学研究所,自体免疫,移植和炎症。
劳伦斯·图尔卡
5美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院和哈佛医学院外科。
保罗·A·史密斯
6瑞士巴塞尔诺华生物医学研究所,自体免疫,移植和炎症。
马丁·A·施耐德
6瑞士巴塞尔诺华生物医学研究所,自体免疫,移植和炎症。
南茜·J·麦基弗
8美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学儿科。
Jason W.Locasale先生
4美国纽约州伊萨卡康奈尔大学营养科学部。
克里斯托弗·纽加德
1药理学和癌症生物学系,
三美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学杜克分子生理研究所。
杰弗里·拉思梅尔
1药理学和癌症生物学系,
2免疫学系,以及
三美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学杜克分子生理研究所。
1药理学和癌症生物学系,
2免疫学系
三杜克大学分子生理研究所,美国北卡罗来纳州达勒姆。
4美国纽约州伊萨卡康奈尔大学营养科学部。
5美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院和哈佛医学院外科。
6瑞士巴塞尔诺华生物医学研究所,自体免疫,移植和炎症。
7病理科
8美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学儿科。
通信地址:Jeffrey Rathmell,DUMC Box 3813,Duke University Medical Center,Durham,North Carolina 27710,USA电话:919.681.1084;电子邮件:ude.ekud@llemhtar.ffej. 2014年3月10日收到;2014年10月30日接受。
- 补充材料
补充数据
GUID:69D5A68F-64A8-4CCD-B939-FF60BC857764
摘要
激活CD4+T细胞导致快速增殖并分化为效应和调节亚群。CD4细胞+效应T细胞(Teff)(Th1和Th17)和Treg亚群在代谢上是不同的,但改变T细胞群的具体代谢差异尚不确定。在这里,我们评估了CD4+小鼠模型中的T细胞群,并确定炎症性Teffs维持糖酵解基因的高表达并依赖高糖酵化率,而Tregs是氧化性的,需要线粒体电子传递来增殖、分化和存活。代谢谱分析表明丙酮酸脱氢酶(PDH)是T细胞糖酵解和氧化代谢之间的关键分岔点。PDH激酶(PDHKs)抑制PDH功能。PDHK1在Th17细胞中表达,但在Th1细胞中不表达,在Tregs中低水平表达,PDHK1的抑制或敲除选择性地抑制Th17细胞并增加Tregs。CD4的这种改变+T细胞群部分通过活性氧介导N个-乙酰半胱氨酸(NAC)治疗恢复了Th17细胞的生成。此外,PDHK1的抑制调节免疫,保护动物免受实验性自身免疫性脑脊髓炎的影响,减少Th17细胞并增加Tregs。总之,这些数据表明CD4+亚群利用并需要不同的代谢程序,以控制自身免疫和炎症疾病中的特定T细胞群。
介绍
CD4细胞+T淋巴细胞对介导或抑制正常免疫以及炎症或自身免疫性疾病至关重要。抗原暴露最初导致T细胞活化,诱导快速生长和增殖。根据激活期间的细胞因子环境,CD4+然后,T细胞分化为效应器(Teff)(Th1和Th17)或Treg亚群。这些亚群中的每一个在适应性免疫系统中都发挥着独特的作用,Teffs驱动免疫和炎症,而Tregs则发挥着相反的作用,抑制Teffs以限制过度的炎症反应(1). Teffs和Tregs之间的平衡对于在不促进自身免疫的情况下提供足够的免疫保护至关重要。事实上,许多自身免疫性疾病,包括多发性硬化症和炎症性肠病(IBD),都涉及Teffs与Tregs的失衡或Treg功能下降(2). 尤其是Th17在许多自身免疫性疾病中起关键的促炎作用,包括实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、IBD和移植物抗宿主病(三–5). 因此,识别每个T细胞群的特征以调节Teffs和Tregs的平衡可能提供一种防止或抑制自身免疫的方法。
新出现的证据表明CD4+T细胞的代谢是高度动态的,可以针对特定的T细胞群体。T细胞激活导致对生物合成前体和效应器功能的足够能量的需求(6,7). 这种重新编程包括减少脂质氧化,增加葡萄糖摄取和糖酵解,以及氨基酸转运和谷氨酰胺水解(8–12). 重要的是,Teffs和Tregs的代谢重编程导致不同的代谢程序。虽然Teffs利用大量葡萄糖和高糖酵解率来支持其能量需求,但Tregs可以氧化脂质,即使在没有葡萄糖的情况下也能扩张和发挥功能(13,14). 然而,激活和分化Teffs和Tregs所需的特定代谢底物使用和代谢程序尚不确定。
丙酮酸代谢是葡萄糖代谢的一个调节点,可能在Teffs和Tregs的糖酵解或氧化作用中发挥中心作用。丙酮酸脱氢酶(PDH)催化细胞溶质丙酮酸转化为线粒体乙酰辅酶A以进行氧化代谢。PDH激酶(PDHK)抑制PDH,以抑制丙酮酸氧化,并通过乳酸脱氢酶(LDH)促进其转化为乳酸(15). PDHK有4种亚型,受致癌信号和缺氧调节(16,17). 事实上,癌细胞也具有高度的糖酵解作用,用二氯乙酸(DCA)靶向PDHK可以抑制糖酵分解并导致氧化代谢增加和活性氧的产生(15,18). DCA还被证明在体外和几种体内炎症模型中减少促炎细胞因子的产生并促进FoxP3的表达(19–21)尽管相关机制尚未建立。
在这里,我们研究了体内和体外每个T细胞亚群的代谢程序,以确定不同的代谢途径,从而可以选择性地靶向不同的T细胞群体。我们发现,Tregs不仅能高速氧化脂质,而且还能氧化糖酵解衍生的丙酮酸。Teff需要糖酵解代谢来促进增殖、分化和存活,而Tregs需要氧化代谢来完成这些过程。基因表达和代谢组学数据表明,PDHK亚型1(PDHK1)是Th17和Treg代谢的重要调节剂。事实上,PDHK1表达的抑制或DCA的抑制会导致ROS积聚,并选择性地抑制Th17细胞的存活和增殖。DCA还能够抑制Th17细胞和CD4+IBD和EAE模型中T细胞介导的炎症。总之,这些代谢数据已确定PDH是CD4的关键调节点+T细胞亚群的命运,并表明抑制PDHK1可导致炎症和自身免疫性疾病体内Th17细胞选择性ROS生成和靶向。
结果
T细胞在体内进行糖酵解表型的代谢重编程。
虽然T细胞在体外进行糖酵解的代谢重编程,但对体内炎症T细胞亚群的代谢知之甚少。因此,在激活和过继转移诱导EAE时,观察到髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)特异性2D2 TCR转基因T细胞的代谢表型(图A) ●●●●。比较体外抗原活化的2D2 T细胞和直接从EAE小鼠脊髓分离的2D2 T-细胞的免疫和代谢基因表达。Ifng公司和第17页在体外刺激下急剧诱导,在EAE疾病部位的T细胞中也显著升高(图B) ●●●●。与从氧化代谢到糖酵解的体外代谢重编程类似,EAE小鼠脊髓的T细胞也具有糖酵化基因Hexokinase 2的高表达(香港2号)脂肪氧化基因肉碱棕榈酰转移酶1A的表达降低(Cpt1a型,图C) ●●●●。接下来通过流式细胞术直接检测EAE中IL-17产生细胞或FoxP3表达细胞体内分化T细胞的代谢情况。在活动性EAE疾病期间,产生IL-17的细胞显示脾脏和腹股沟淋巴结中葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)和HK2蛋白水平升高(图D) ●●●●。相反,在FoxP3表达细胞中,GLUT1和HK2均未升高。因此,体内炎症部位的Teffs似乎是糖酵解的,而Tregs利用独特的代谢程序。
Teffs(而非Tregs)在体内炎症过程中上调糖酵解代谢。
(一–C类)在2D2 TCR转基因小鼠中诱导EAE,并从活动性疾病小鼠或体外MOG-刺激(MOG-stim)2D2 T细胞的脊髓中提取RNA,如下所示(一)用于实时PCR(B类)炎症和(C类)代谢基因表达。(D类)在野生型小鼠和CD4中诱导EAE+用流式细胞术检测活动性疾病小鼠脾脏和腹股沟淋巴结中的T细胞。数据代表了两个实验(一–C类,n个= 10;D类,n个=5),并显示为平均值±SD*P(P)< 0.05.
Teffs和Tregs利用不同的代谢途径,具有不同的燃料容量。
尽管之前的研究(13,14)和体内分析(图)已经确定了Teffs(Th1和Th17)和Tregs之间的基本代谢差异,即CD4的潜在代谢特征+T细胞亚群不确定。检测CD4的详细代谢表型+在体外对T细胞亚群、Teffs和Tregs进行分化,并使用细胞外代谢通量分析仪测量耗氧量和乳酸生成量。细胞在没有葡萄糖、谷氨酰胺或脂质的情况下培养,细胞外酸化率(ECAR)是乳酸产生的一种测量方法,在葡萄糖还原后测定(图A) ●●●●。所有CD4+添加葡萄糖后,T细胞亚群的ECAR增加,尽管Th1和Treg的增加幅度小于Th17细胞。然后添加寡霉素以阻止线粒体ATP生成并促进最大糖酵解速率。重要的是,寡霉素处理后Th1和Th17细胞的ECAR均显著增加,但Tregs基本不变。这些数据表明,添加葡萄糖后,Tregs以最大速率进行糖酵解,并且增加该途径的能力有限。相反,Teffs可以高速生成乳酸,并且在需要生成ATP时可以进一步提高糖酵解速率。与Th1和Th17细胞相比,Tregs的糖酵解能力和糖酵化储备都严重受损(图、B和C)。因此,当葡萄糖是唯一可用的燃料时,Teffs有效地进行糖酵解,而Tregs无法增加其糖酵分解能力。
Teffs和Tregs利用不同的代谢途径,具有不同的燃料容量。
CD4细胞+CD25型–T细胞在体外极化3天,分裂成1:2,与IL-2单独培养2天,以产生诱导的Th1或Th17细胞或Tregs。(一–C类)T细胞在不含葡萄糖或谷氨酰胺的基础DMEM培养基中培养。在添加25 mM葡萄糖(gluc)以及代谢抑制剂寡霉素(oligomycin)和2DG后评估ECAR。显示的是(一)时间进程和计算(B类)糖酵解能力和(C类)糖酵解储备。(D类和E类)T细胞在含有25 mM葡萄糖的DMEM培养基中培养。根据线粒体抑制剂寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素A(Rot/AntiA)对OCR进行基本评估。显示的是(D类)时间进程和(E类)计算SRC。(F类)测量T细胞亚群中的葡萄糖氧化,并绘制葡萄糖氧化与糖酵解的比率。数据显示为三份样品的平均值±SD(B类,C类,E类、和F类),所有数据均代表至少3个独立实验*P(P)< 0.05.
线粒体和氧化代谢在支持T细胞活化和增殖中起关键作用(22,23). 而Tregs的脂质氧化率很高(13)丙酮酸的线粒体氧化以前没有被检测过。因此,在每个CD4中测量线粒体耗氧量(OCR)+含有葡萄糖的培养基中的亚群。在添加代谢抑制剂之前,与Teffs相比,Tregs的耗氧量处于中等水平,Th17细胞的基本耗氧量最高(图D) ●●●●。抑制线粒体ATP生成的寡霉素处理将每个亚群的耗氧量抑制到相当低的水平,表明耗氧量与所有T细胞亚群的ATP生成紧密耦合。在添加原核羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯基腙(FCCP)以将氧化磷酸化与电子传输解耦并允许最大呼吸时,Tregs和Th17极大地上调了耗氧量。与基本耗氧量相比,这些数据表明,Tregs具有子集中最大的备用呼吸容量(SRC)(图E) ●●●●。因此,Tregs的乳酸糖酵解生成量较低,不能进一步提升该途径,但当葡萄糖是唯一可用的燃料时,其线粒体氧化能力最强。
这些数据表明,Teffs和Tregs可能对葡萄糖有不同的利用,其中Teffs优先将葡萄糖衍生的丙酮酸转化为乳酸,而Tregs则氧化线粒体中的这种燃料。我们之前已经证明,Tregs优先氧化脂质,但T细胞亚群中的相对葡萄糖氧化速率尚未直接测试(13). 测量糖酵解酶衍生丙酮酸CD4的去向+T细胞亚群由放射性标记的葡萄糖提供,糖酵解通量通过磷酸烯醇丙酮酸烯醇化酶的生成和葡萄糖氧化为CO来测量2。Tregs中葡萄糖氧化与糖酵解通量的比率较高,支持这一结论,即该亚群优先氧化葡萄糖,而不是将丙酮酸转化为乳酸(图F) ●●●●。总之,这些数据表明Tregs利用线粒体氧化途径使用两种脂质(13)而Teffs的线粒体氧化代谢水平较低,主要进行有氧糖酵解,将丙酮酸转化为乳酸。
抑制糖酵解或线粒体氧化选择性地影响Teff或Treg的增殖、分化和存活。
尽管细胞外通量分析表明,Teffs和Tregs通过不同的糖酵解或线粒体氧化代谢途径利用丙酮酸,但这些亚群对每种代谢模式的依赖性尚不清楚。确定每个CD4+子集需要这些程序,CD4+用增殖指示剂CellTrace Violet(CTV)标记T细胞亚群,在体外进行分化,并分别用低剂量2-脱氧葡萄糖(2DG)或鱼藤酮处理以抑制糖酵解或电子传递(图A和补充图1A;本文在线提供的补充材料;数字对象标识:10.1172/JCI76012DS1号机组). 2DG治疗抑制了每个Teff亚群的增殖,反而增加了Treg增殖(图B) ●●●●。相反,鱼藤酮不影响Teffs,但显著降低Treg增殖。
糖酵解或线粒体电子传递的抑制选择性地影响Teff或Treg的存活、增殖和功能。
(一)药物治疗示意图B类和C类. (B类和C类)CD4细胞+CD25型–用CTV标记T细胞,并在体外极化3天,以生成Th1或Th17细胞或Tregs。用250μM 2DG或5 nM鱼藤酮处理细胞(B类)扩散或(C类)72小时后用流式细胞仪检测转录因子染色。(D类)药物治疗示意图E类和F类. (E类和F类)CD4细胞+CD25型–T细胞在体外极化3天,分裂成1:2,与IL-2单独培养2天,然后与(E类)250μM 2DG或(F类)5 nM鱼藤酮;存活率是通过排除碘化丙啶(propidium-idide)来确定的。(G公司)CD4细胞+CD25细胞+用CTV标记天然Tregs,并在250μM 2DG或5 nM鱼藤酮存在下激活,通过CTV稀释评估增殖。数据显示为三份样品的平均值±SD(B类,E类、和F类),所有数据均代表至少3个独立实验*P(P)< 0.05.
每个CD4的分化+T细胞亚群的特征是在细胞进行DNA复制和分裂时诱导特定转录因子(1). 鉴于Teffs依赖于糖酵解,Tregs依赖于线粒体代谢以促进增殖,因此亚群表达这些转录因子的能力也可能对代谢敏感。与这一概念一致,2DG治疗抑制了Th1条件下培养的细胞中Th1特异性转录因子T-bet的诱导,以及Th17条件下培养T细胞中Th17所需的维甲酸相关孤儿受体γT细胞(RORγT)(图C) ●●●●。重要的是,这种效应并不依赖于细胞分裂,因为T-bet和RORγT在每个等效细胞周期分裂时都受到抑制。同样,在每个等效细胞分裂处,T-bet和RORγT转录靶点IFN-γ和IL-17的表达也被2DG抑制(补充图1B)。先前研究表明,活化T细胞中最大IFN-γ产生需要有氧糖酵解(22),2DG还抑制了IFN-γ的产生和在没有倾斜条件下激活的T细胞的增殖(补充图2A)。然而,2DG不影响Treg转录因子FoxP3的诱导。相反,电子传递抑制剂鱼藤酮在每个等效细胞分裂时选择性地降低Tregs中FoxP3的表达,并且Th1和Th17细胞仅轻微抑制T-bet和RORγT的表达(图C) 或活化T细胞的IFN-γ产生或增殖(补充图2A)。福克斯P3+鱼藤酮治疗后,从脾细胞分离出的天然Tregs(nTregs)降低了增殖,但没有降低细胞存活率(补充图2、B和C)。重要的是,分化后的Teff不受2DG和鱼藤酮的影响,这表明2DG主要在早期激活和子集规范期间影响Teff的分化和细胞因子的产生(补充图3、A和B)。同样,鱼藤酮对分化Tregs中FoxP3表达没有影响。
CD4细胞+亚群可能依赖于特定的代谢程序,不仅是为了增殖和分化,也是为了生存。因此,在体外建立了Teff和Treg亚群,并在分化后用2DG或鱼藤酮处理(图D) ●●●●。如碘化丙啶排除法所测,Tregs在2DG存在下存活良好,仅受到糖酵解抑制的中度影响(图E) ●●●●。相反,Th1和Th17对2DG治疗敏感,并显示细胞死亡增加(图E和补充图3C)。Teffs对鱼藤酮相对不敏感,鱼藤酮反而增强了Th17相对于载体(图F) ●●●●。然而,Tregs对鱼藤酮治疗敏感,生存能力降低(图F和补充图3C)。这种效应并不是诱导的Tregs所特有的,因为在鱼藤酮处理的天然Tregs中也观察到增殖减少(图G) ●●●●。总的来说,这些数据表明Teffs和Tregs的特定代谢程序与CD4密切相关+T细胞增殖、分化和存活。
Th17细胞和Tregs具有不同的代谢表型。
Teffs和Tregs的不同代谢依赖性表明详细的代谢谱可以揭示CD4的关键调控点+T细胞亚群。因此,我们详细检查了Th1、Th17细胞和Tregs的代谢产物水平和代谢基因表达,因为这些亚型的平衡在各种炎症环境中至关重要。通过高分辨率非靶向Q精确质谱(QE-MS)代谢组学测量的约400种代谢物稳态水平的无监督聚类(24)表明Teffs和Tregs具有广泛的代谢差异(图A和补充表1)。重要的是,Tregs与聚集在一起的Th1和Th17细胞不同。对大约200种代谢物进行的单独液相色谱/气相色谱-质谱(LC/GC-MS)分析发现了类似的结果(补充图4和补充表2)。Th17细胞和Tregs最为明显,Th17细胞具有高水平的早期糖酵解和戊糖磷酸途径中间产物(图B) ●●●●。晚期糖酵解中间产物更为相似,尽管Th17具有较高的丙酮酸和较高的乳酸水平,表明丙酮酸优先转化为乳酸。尽管丙酮酸水平较低,但Tregs的TCA循环中间产物相当于Th17细胞的TCA周期中间产物,直至α-酮戊二酸,这可能表明Tregs中的丙酮酸优先氧化和Th17对谷氨酰胺的氧化。
CD4代谢组学分析+各亚群表现出不同的代谢特征。
天真的CD4+CD25型–在体外收集或极化T细胞3天,1:2分裂,并与IL-2单独培养2天,以生成Th1、Th17或Tregs。从3个生物复制样品中提取T细胞亚群裂解物,并使用高分辨率LC-QE-MS分析细胞代谢物。(一)热图显示了每种代谢物的相对水平,以及来自独立生物复制的无监督分级聚类。(B类)显示了糖酵解和TCA循环途径中每种代谢物的相对水平。样本归一化为原始T细胞,如红线所示。数据显示为三份样品的平均值±SD。
接下来检查Th17细胞和Treg亚群的氨基酸和酰基肉碱水平,这是反映脂质氧化产物和可用线粒体燃料的中间产物。与Th17相比,除了Tregs的天冬氨酸水平升高外,在氨基酸水平方面没有观察到明确的T细胞亚型模式(补充图5A)。酰基肉碱在Th17细胞和Tregs之间存在差异,与Th17相比,Tregs增加了C2和C4-OH肉碱水平(补充图5、B和C)。这些代谢物分别与乙酰基和β-羟丁基辅酶A物种平衡并反映其性质。我们还观察到油基肉碱(C18:1)下降。长链酰基肉碱的下降与C4-OH(羟基丁酰肉碱)的增加相一致,这与脂肪酸氧化增加相一致(25)并支持Tregs对脂肪酸的利用程度高于Th17的模型。总之,这些代谢数据表明每个CD4+T细胞亚群具有独特的代谢表型,表明Treg和Teff亚群在燃料消耗模式和依赖性方面存在特定的代谢差异。
接下来在Th17细胞和Tregs中测定代谢基因和选择蛋白的表达。基因聚类分析表明,Th17的葡萄糖代谢基因表达普遍较高,其次是Tregs和原始T细胞(图A、 补充图6和补充表3和4)。具体而言,与Tregs相比,Th17的许多糖酵解基因的表达水平更高(图B) ●●●●。有趣的是,CD4+T细胞优先表达每个糖酵解基因的单一亚型(图B) ●●●●。此外,CD4+T细胞表达多种葡萄糖转运蛋白,包括GLUT1和GLUT3。与Tregs相比,Th17中GLUT1蛋白的表达升高,Tregs未表达可检测到的GLUT3水平(图C和补充图6和7)。葡萄糖在摄取后被己糖激酶(HK)磷酸化,其中有4种亚型。令人惊讶的是,Tregs主要表达HK1蛋白,而Th17主要表达HK2和HK3(图C和补充图7)。有趣的是,尽管Tregs中HK1蛋白水平升高,但HK1–3的RNA水平相对于Th17降低(图C和补充图7)。线粒体基因的无监督聚类显示,Th17细胞和Tregs表达的线粒体代谢基因水平高于原始T细胞(图D、 补充图6和补充表4和5)。在Th17细胞和Tregs之间,与TCA循环和电子传递相关的基因表达相似(图E) ●●●●。此外,Tregs的许多电子转运链蛋白水平升高,脂肪酸转运蛋白CPT1A和电子转运链组分细胞色素水平升高c(c)与Th17相比(图F和补充图7)。总之,这些数据显示出明显的遗传和代谢差异,这些差异可能介导了Teffs和Tregs的特定代谢程序和依赖性。
Th17细胞和Tregs具有不同的代谢基因和蛋白表达。
CD4细胞+CD25型–T细胞在体外极化3天,分裂成1:2,与IL-2单独培养2天,以产生Th17或Tregs(一,B类,D类、和E类)实时PCR或(C类和F类)免疫印迹。(一,B类,D类、和E类)所示数据为3个生物复制品的平均值±SD,如2所示ΔCT归一化为参考基因的几何平均值Tbp公司和Bgu公司数据代表2(一,B类,D类、和E类)或2(香港3号), 3 (葡萄糖转运蛋白1,谷氨酸3,香港1号,香港2号,氧磷化合物), 4 (细胞c),或5(Cpt1a型) (C类和F类)独立实验*P(P)< 0.05.
PDHK是Th17在体外发挥功能所必需的,但不是Treg。
不同底物利用模式的发现表明,丙酮酸转化为乳酸或通过线粒体氧化的PDH复合物转化为乙酰辅酶A的分叉点可能是Th17和Treg CD4的重要调节节点+子集。为了测量丙酮酸通过PDH的流量,向Th17细胞和Tregs提供放射性标记的丙酮酸及其氧化为CO2已测量。Tregs中丙酮酸的氧化程度更高,表明Tregs优先将丙酮酸导向线粒体代谢(图A) ●●●●。PDH是一种高度调控的多亚单位复合物,部分由PDHK控制,PDHK磷酸化并抑制PDH将丙酮酸直接转化为乳酸,而不是乙酰辅酶a。4的表达普德克因此在CD4中检测了亚型+T细胞亚群。T细胞表达Pdhk1号机组和巴基斯坦电力公司3,使用Pdhk1号机组是主要的同种型(图B) ●●●●。在RNA和蛋白质水平上,Th17表达最高水平的PDHK1,其次是Tregs,而Th1几乎没有PDHK1表达(图C和补充图8A)。因此,PDHK1在CD4细胞中差异表达+T细胞亚群和可能在控制T细胞代谢中发挥作用。
体外Th17(而非Treg)功能需要PDHK。
CD4细胞+CD25型–T细胞在体外极化3天,分裂成1:2,与IL-2单独培养2天,以产生Th1、Th17或Tregs。(一)显示丙酮酸不同命运和DCA抑制机制的示意图以及14Th17细胞和Tregs中的C-丙酮酸氧化。(B类)实时PCR和(C类)免疫印迹显示了4个独立实验的代表性。(D类–F类)用10 mM DCA处理细胞,然后产生细胞因子(D类)和转录因子染色(E类)流式细胞术检测。(F类)通过体外Treg抑制试验评估Treg功能。(G公司和H(H))T细胞极化并感染表达PDHK1 shRNA的慢病毒(G公司)FoxP3和RORγT的转录因子染色或(H(H))对IL-17进行细胞内细胞因子染色。数据显示为三份样品的平均值±SD(一,B类、和H(H)),所有数据均代表至少3个独立实验*P(P)< 0.05.
PDHK是抑制剂化合物DCA的靶点(图A和参考。26)之前已经证明它会影响细胞因子的产生和Tregs(19–21). 测定PDHK抑制对CD4的影响+T细胞命运和功能,CD4+T细胞在DCA存在下在体外分化或在分化3天后用DCA处理。DCA治疗并不影响Th1分化或功能,因为无论治疗如何,IFN-γ的产生和T-bet的表达都是相似的(图,D和E,以及补充图8,B–D)。相反,DCA抑制在Th17倾斜条件下培养的细胞中IL-17的产生,并抑制Th17转录因子RORγT的表达(图,D和E,以及补充图8,B–D)。相反,与载体相比,DCA治疗Tregs增加了FoxP3的表达,并维持或潜在增加了Tregs的体外抑制能力(图、D–F和补充图8E)。我们下一步的基因目标Pdhk1号机组使用3种不同的慢病毒shRNA结构(补充图9A)。预测值1缺乏抑制Th17细胞中RORγT和IL-17的表达,增加FoxP3的表达,与DCA的体外效应相似(图、G和H以及补充图9、B和C)。慢病毒转导本身对代谢没有影响(补充图9、D和E)。这些数据表明丙酮酸代谢和PDHK1在调节Th17细胞和Tregs中起着关键作用。
DCA治疗促进丙酮酸氧化的一个结果是ROS生成的潜在增加。事实上,DCA可以抑制癌细胞的有氧糖酵解并刺激ROS生成,从而导致癌细胞衰老(15,18). 先前的文献也表明,Teffs可能比Tregs对ROS应激更敏感(27–29). 因此,在T细胞亚群中检测ROS水平。活性氧指示剂染料DCFDA显示,Tregs的活性氧水平高于Teff亚群(图A) ●●●●。与活性氧应激相一致,与Th1和Th17相比,Tregs还具有大量的还原性谷胱甘肽(GSH)储备库以及高水平的氧化性谷胱甘肽(GSSG)(图B) ●●●●。这表明Tregs比Teffs有更大的能力处理ROS,并在更大程度上利用GSH池。Treg还被证明具有较高水平的抗氧化剂硫氧还蛋白-1,也有助于调节Treg氧化还原(30). 为了确定DCA是否通过ROS生成发挥部分作用,对已建立的Th17和Treg培养物进行DCA急性治疗。在这两种情况下,DCA增加了DCFDA染色,表明ROS的产生(图C) ●●●●。接下来,我们通过用DCA和抗氧化剂NAC共同处理Th17细胞和Tregs来测试DCA诱导的活性氧的作用,以防止活性氧积聚。用DCA治疗的分化T细胞显示出与急性DCA治疗相似的ROS积累水平(补充图10A),1 mM NAC足以部分挽救DCA治疗后的ROS积聚(图10AC和补充图10B)。DCA单独治疗抑制IL-17的产生;然而,NAC的联合治疗阻止了IL-17的下降(图D) ●●●●。相反,虽然DCA促进Tregs的增加,但NAC的联合治疗阻止了Tregs增加。这些数据表明,DCA可以驱动Tregs计划管理的葡萄糖氧化和ROS生成。
DCA治疗产生ROS,对Th17产生负面影响。
CD4细胞+CD25型–T细胞在体外极化3天,分裂成1:2,与IL-2单独培养2天,以产生Th1、Th17或Tregs。(一)使用指示染料DCFDA通过流式细胞术测量ROS的产生。(B类)使用LC/MS测量T细胞亚群中的相对谷胱甘肽水平(C类)使用DCFDA测量经载体、DCA或DCA/NAC处理的Th17细胞和Tregs的ROS生成。(D类和E类)用10 mM DCA、1 mM NAC或两者联合处理Tregs和Th17细胞,以及(D类)3天后检测IL-17的产生和FoxP3的表达。数据显示为一式三份样品的平均值±标准差(一,B类、和D类),所有数据均代表至少2个独立实验*P(P)< 0.05.
体内抑制PDHK可不同程度地影响Th17细胞和Tregs,以抑制结肠炎和EAE的进展。
在体外,DCA对PDHK的抑制不影响Th1,但对Th17功能有选择性的有害影响,同时有利于Treg分化。虽然DCA以前被证明可以抑制关节炎、哮喘和同种异体反应中的炎症反应(19–21),对分化的CD4的特异性影响+体内尚未检测T细胞亚群。因此,我们测试了DCA抑制Th17介导的炎症疾病的能力。IBD由Th1和Th17共同驱动,并由Tregs缓解,这允许在体内对每个亚群进行功能检查(31). 在没有Tregs的情况下,将幼稚T细胞过继性转移到免疫缺陷受体,然后给小鼠饮用正常或含有DCA的饮用水。T细胞转移后2周接触临床相关非甾体抗炎药吡罗昔康后,因与肠道微生物群接触而产生Teffs,由此引发IBD。CD4显著减少+在接受DCA治疗的小鼠的肠系膜淋巴结中发现了细胞,这些细胞浸润到肠道组织中,与接受载水的小鼠相比(图A和补充图11A)。虽然Th17细胞减少,但DCA治疗并未导致Th1细胞减少,如产生IFN-γ的CD4的百分比所测+T细胞(图、B和C以及补充图11B)。这些数据表明,PDHK抑制选择性地影响Th17,但不影响体内Th1的增殖和功能。尽管抑制Th17细胞,但DCA治疗并不能阻止肠道炎症或疾病进展,这可能是由于功能性Th1反应所致(补充图11C)。
Th17选择性需要PDHK,但不需要Treg、体内扩张和功能。
(一–C类)抹布1–/–给小鼠注射朴素的Teffs(CD4+CD25型–CD45RB你好),并诱发结肠炎。给小鼠服用2 g/l DCA(n个=10)或车辆(n个=10)。(一)CD4的数量+T细胞或(B类和C类)用流式细胞术测定脾脏和肠系膜淋巴结中产生IFN-γ和IL-17细胞的百分比。(D类–H(H))在有或没有DCA处理的野生型小鼠中诱导EAE(每组10只小鼠)。(D类)显示了临床评分的时间进程。(E类和F类)百分比(E类)CD4细胞+福克斯P3+和(F类)CD4细胞+白介素-17+使用流式细胞术测定第9天引流淋巴结中的T细胞。(G公司)H&E和(H(H))对活动期疾病小鼠的脊髓切片进行LFB染色。数据显示为平均值±SD(一–C类,E类、和F类),数据代表了3个独立实验*P(P)< 0.05.
为了独立测试PDHK对Th17和Treg人群的作用,我们接下来检查了DCA在EAE中的作用。虽然Th1细胞可以发挥作用,但该模型在很大程度上依赖于Th17,因为RORγT基因敲除小鼠具有抗病性(32,33). 通过MOG免疫在野生型小鼠中诱导EAE,并在整个实验过程中在饮用水中给予DCA;定期评估EAE的临床症状。通过DCA治疗抑制PDHK可在整个疾病进展过程中显著缓解EAE临床症状(图D) ●●●●。从腹股沟引流淋巴结分离的T细胞数量减少,FoxP3增加+Tregs与IL-17生成和CD44减少你好T细胞,与我们的体外研究结果一致(图、E和F以及补充图11D)。重要的是,根据H&E和Luxol Fast Blue(LFB)染色的测量,DCA治疗还可损害T细胞向脊髓的浸润并防止脱髓鞘(图、G和H)。因此,体内PDHK抑制选择性地调节Th17细胞和Tregs之间的平衡并抑制自身免疫。这些数据表明CD4的不同代谢程序+各亚群对每个亚群都是必不可少的,可以利用这些亚群来针对炎症性疾病中的特定T细胞群。
讨论
越来越明显的是,代谢重编程在T细胞激活、分化和功能中起着至关重要的作用。激活的CD4+T细胞需要高速度的葡萄糖摄取和糖酵解、谷氨酸分解和脂质合成来支持增殖和功能(10–12,34). 我们首次对Teffs(Th1和Th17)和Tregs的代谢程序进行了详细分析。在体内和体外,我们的数据显示炎症Teffs和CD4+Tregs有不同的代谢程序和依赖性。具体来说,Teffs依赖糖酵解,而Tregs具有更大的燃料灵活性,除脂质外还氧化葡萄糖。虽然Th1和Th17对葡萄糖的需求相似,但下游途径的代谢差异和每个T细胞亚群的调节允许选择性靶向Th17细胞。在这里,我们确定PDHK是CD4的选择性调节器+T细胞分化和炎症,并显示PDHK抑制特异性损害Th17,同时保留Th1并促进Tregs。
通过详细的代谢分析,发现了Th1和Th17细胞以及Tregs的不同程序。每个亚群表达不同水平的代谢酶和代谢物。虽然Th1和Th17都是高度糖酵解的,但Th17细胞具有较高的糖酵解基因表达水平和糖酵解中间体水平。Th1细胞也依赖于糖酵解,但似乎在转录后调控此途径,而没有糖酵化中间产物的积累。谷氨酰胺代谢也可能优先在Th17细胞中增加。这些代谢差异与Th1和Th17的不同调节机制一致,例如Th17细胞对HIF1α的选择性需求(14,35). 相反,Tregs依赖于线粒体代谢,并具有氧化脂质或葡萄糖的灵活性。虽然代谢产物的稳态水平不一定反映通路通量率,但我们的综合数据支持一个模型,即Th1和Th17细胞依赖糖酵解和潜在的谷氨酰胺解,而Tregs氧化丙酮酸盐和脂质。
虽然Teffs能有效地将葡萄糖转化为乳酸,但Tregs具有较高的呼吸能力,优先氧化葡萄糖衍生的丙酮酸。Tregs中葡萄糖转运蛋白和糖酵解成分的表达减少可能部分限制了Treg的葡萄糖代谢。然而,CPT1A的高表达和脂质氧化为Tregs提供了多种燃料来源。这种燃料灵活性对于支持体内T细胞抑制可能很重要。呼吸能力增加与细胞活力增加有关(36)而糖酵解可能会限制细胞寿命(37). 还有越来越多的证据表明,Tregs可能利用代谢策略来抑制Teffs(33). 这些策略包括通过上调CD39的表达来降解ATP,CD39将细胞外ATP/ADP转化为AMP,并直接与Teffs竞争半胱氨酸摄取(34). Tregs还可以诱导树突状细胞消耗必需氨基酸,从而抑制T细胞增殖(35). 因此,Tregs具有不同于Teffs的代谢谱可能是有利的,而Teffs和Tregs之间的代谢差异可能是Tregs发挥功能和抑制炎症的能力所必需的。
用2DG进行体外治疗可以削弱糖酵解并阻止Teff促炎细胞因子的产生、存活、增殖甚至分化(14). 相反,Tregs不受2DG影响,而是对线粒体抑制剂敏感。以前的文献已经证明糖酵解酶GAPDH可以与IFNG公司mRNA和抑制其翻译将糖酵解与炎症细胞因子的产生联系起来(22). 在这里,我们发现2DG处理还抑制了Teff的增殖和效应转录因子T-bet和RORγT的表达,表明糖酵解抑制可以通过不同的途径影响T细胞分化。相反,线粒体抑制抑制了Tregs。这可能部分是由于抗氧化剂NAC对Tregs的调节,ATP生成减少或ROS调节改变。
鉴于Tregs利用线粒体氧化,而Teffs将葡萄糖衍生的丙酮酸转化为乳酸,糖酵解和葡萄糖氧化之间的分支点被确定为调节Teffs和Tregs之间平衡的潜在靶点。PDHK是该分支点的主要调节器,通过抑制PDH抑制葡萄糖氧化而促进乳酸生成和糖酵解。有趣的是,PDHK1在T细胞亚群中有差异表达,在Th17中有稳定表达,但在Th1中很少表达,在Tregs中有中间表达。天真的CD4+T细胞也表达PDHK1,尽管这些细胞主要是氧化性的而非糖酵解性的。DCA抑制PDHK,目前正在研究几种不同类型的癌症(38–42)DCA可能通过抑制乳酸的生成而抑制有氧糖酵解,进而引导葡萄糖在线粒体中被氧化,从而发挥有效作用。DCA还可以在一些可能导致癌细胞衰老的癌症模型中促进ROS(15,38,42). 在免疫系统中,DCA治疗人外周血单个核细胞(PBMC)可抑制促炎细胞因子的产生,并促进哮喘和同种异体反应时FoxP3的表达(19–21). 然而,这些研究并没有直接检测PDHK或DCA在T细胞亚群中的作用,也没有建立起作用机制。
我们的数据表明,DCA通过抑制PDHK1以及随后的葡萄糖利用率和ROS的改变来抑制Teff分化和细胞因子的产生。通过抑制PDHK1促进葡萄糖氧化选择性抑制Th17生成;这在一定程度上是通过ROS的生成来介导的。相反,Th1细胞不受PDHK1的调节,而是通过独立的途径维持糖酵解程序。最近的几份报告表明,Teffs比Tregs对ROS压力更敏感(27,28,30). T细胞中抗氧化分子过氧化物酶原II的缺失增加了Tregs并预防了右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎(28). 在我们的研究中,Tregs被发现具有高水平的抗氧化剂谷胱甘肽。虽然与Teffs相比,Tregs的ROS水平也很高,但Tregs很可能在线粒体氧化过程中产生ROS,并配有抗氧化分子来处理这一ROS生成。我们的数据表明,由于DCA抑制IL-17的产生,Th17细胞对PDH激活和随后的葡萄糖氧化所产生的ROS应激的处理能力较差。与此模型一致,ROS与抗氧化剂NAC的中和使IL-17的产生正常化。因此,PDHK选择性地调节Th17细胞和Tregs之间的平衡,部分通过ROS生成。
先前的研究已经描述了调节Teffs和Tregs之间平衡的潜在治疗策略。每个亚型在免疫中起着不同的作用,抑制其中一个亚型而不影响其他亚型可能在治疗上有用。Th1细胞表达少量PDHK1的发现提供了微调CD4的潜力+T细胞分化与免疫反应。抑制PDHK1并不影响Th1细胞中T-bet的表达或IFN-γ的产生,但抑制了体外RORγT和IL-17的产生。此外,在IBD环境下用DCA治疗小鼠可抑制IL-17,但保留IFN-γ的产生。因此,我们的数据表明,靶向PDHK1可以抑制Th17分化和细胞因子的产生,而不会影响Th1。这在Th17驱动的自身免疫性疾病中可能很重要,在这种情况下,有利于抑制Th17谱系而不影响Th1免疫。总的来说,这项工作确定了CD4之间的关键代谢差异+将PDHK1确立为Th17/Treg平衡和炎症疾病的选择性调节器的T细胞亚群。
方法
老鼠。
除非另有说明,否则所有实验均使用6至8周龄性别匹配的C57BL/6J小鼠(杰克逊实验室)。
T细胞分离和分化。
天真的CD4+CD25型–体外分离T细胞,如前所述生成T辅助细胞亚群(13). 简单地说,CD4+CD25型–在补充有10%FBS、丙酮酸钠、青霉素/链霉素、HEPES和β-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中,用2.5μg/ml的抗CD3抗体以5:1的比例在辐照(30Gy)的脾细胞上培养T细胞。添加以下细胞因子以产生每个亚群:Th1、10 ng/ml IL-12(R&D Systems)、10μg/ml抗IL-4(eBioscience,克隆11B11)、1μg/ml对抗IFN-γ(eBioscience);Th17,20 ng/ml IL-6(研发系统),2.5 ng/ml TGF-β(研发系统;Tregs,3 ng/ml TGF-β。在刺激后第3天,细胞以1:2的比例分裂,并在分析前用20 ng/ml IL-2单独替换2天。在一些实验中,根据制造商的说明,用5 nM鱼藤酮或250μM 2DG处理细胞,或用CTV(Invitrogen)标记细胞,以评估细胞增殖。
qRT-PCR。
按照制造商的说明,使用RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN)从原始(Th0)、Th1或Th17细胞或Tregs中分离RNA。1μg总RNA通过RT进行单链cDNA合成2第一股套件(QIAGEN)。在某些实验中,根据制造商的说明(QIAGEN)在线粒体能量代谢和葡萄糖代谢SuperArray RT中使用cDNA2Profiler PCR阵列或定制阵列,设计用于在T细胞激活的重要途径中包含代谢基因(QIAGEN,CAPM1256)。PCR阵列在ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行分析。使用RT分析数据2QIAGEN提供的并归一化为参考基因TATA盒结合蛋白的Profiler程序(Tbp公司)和β-葡萄糖醛酸酶(Bgu公司),由GeNorm稳定性分析确定。
免疫印迹。
如前所述测量蛋白质表达(13). 简言之,在含有Triton X-100和SDS以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂的缓冲液中裂解细胞。使用了以下抗体:GLUT1(ab652,Abcam)、GLUT3(密理博)、HK1(密理博尔)、HK2(密理伯)、HK3(Abcamc(c)(BD Biosciences)、肌动蛋白(Abcam)和PDHK1(Abcam)。
代谢组学和酰基肉碱。
使用LC-QE-MS(Thermo Scientific)进行非靶向代谢组学分析(24). 使用GC/MS和LC/MS/MS平台(Metabolon Inc.)进行额外的代谢组学分析,以测定细胞代谢物。然后使用MetaboAnalyst软件通过无监督聚类对数据进行分组。使用Bradford蛋白质浓度对样品进行标准化,并重新缩放,以将中位数设置为1。缺失值用最小值进行插补。如前所述,通过靶向流动注射-MS/MS测量酰基鸟氨酸(43).
代谢分析。
利用XF24细胞外通量分析仪(Seahorse Bioscience)对T细胞进行分化,并对OCR和ECAR进行分析。OCR和ECAR值归一化为细胞数。糖酵解能力被定义为注射1μM寡霉素(Seahorse Bioscience)后的ECAR与基础ECAR读数(在不添加葡萄糖或谷氨酰胺的碱性DMEM中培养的T细胞)之间的差异。糖酵解储备被定义为葡萄糖和寡霉素注射液的ECAR差异。SRC被定义为初始基础读数(在添加25 mM葡萄糖的碱性DMEM中培养的T细胞)与注入500 nM离子载体FCCP(Seahorse Bioscience)解偶联氧化磷酸化和电子传递之间OCR的百分比增加。在一些实验中,在鱼藤酮(5 nM)和2DG(250μM)存在下测量OCR和ECAR。如前所述测量糖酵解通量以及葡萄糖和丙酮酸盐的氧化(44). 简单地说,糖酵解通量是通过测量[三H] -葡萄糖。葡萄糖和丙酮酸氧化通过U-14C葡萄糖或U-14丙酮酸C用于测量14一氧化碳2.
活性和细胞内染色。
使用以下抗体:大鼠抗小鼠CD4+太平洋蓝、IL-2藻红蛋白(PE)、IL-17 PE、IFN-γAPC、T-bet PE、RORγT PE、FoxP3 PE和山羊抗兔PE(均来自eBioscience)。通过排除1μg/ml碘化丙啶来测量细胞死亡。为了测量细胞内细胞因子,在GolgiPlug(IL-2,IFN-γ,IL-17)或GolgiStop(IL-17。使用小鼠调节性T细胞染色试剂盒(eBioscience)进行转录因子染色,并对T-bet、RORγT或FoxP3进行细胞内染色。如前所述,对GLUT1和HK2进行细胞内染色(13). 数据在MacsQuant分析仪(Miltenyi Biotec)上采集,并使用FlowJo(TreeStar软件)进行分析。
慢病毒PDHK1 shRNA。
PDHK1 shRNA-表达和对照慢病毒购自Sigma-Aldrich(嘌呤霉素抗性)或Origene(GFP-表达)。CD4细胞+如上所述分离和分化T细胞,并在激活24小时后感染PDHK1 shRNA或控制慢病毒。添加聚溴乙烯(8μg/ml)以促进感染,并在750℃下离心细胞90分钟克如有指示,2天后将细胞以1:2的比例分裂,并用2μg/ml嘌呤霉素处理2天,以选择受感染的细胞。
结肠炎的T细胞转移模型。
野生型CD4+如上所述分离T细胞,以及初始效应物(CD4+CD25型–CD45RB你好)对T细胞进行分类(FACSVantage,BD Bioscience)。将Naive Teffs静脉注射到6至8周龄的C57BL/6中抹布1–/–收件人(Jackson Laboratories)(4×105单元格/鼠标)。在整个实验过程中,给小鼠饮用普通水或饮用2 g/l DCA。T细胞移植两周后,给小鼠服用200 ppm吡罗昔康(Sigma-Aldrich)的鼠食粉,为期5天,以破坏肠道屏障并引发疾病(31).
EAE公司。
如前所述诱发EAE(45). 简单地说,向野生型小鼠注射100 ng MOG35–55与CFA混合的肽(新英格兰肽),包括热杀肽结核分枝杆菌(Sigma-Aldrich),然后在第0天和第2天通过静脉注射给予200 ng百日咳毒素。在小鼠饮用水中给予溶媒或DCA(2 g/l)。根据以下评分评估EAE的临床症状:0分,无疾病迹象;1、尾部语调丧失;2、后肢麻痹;3、后肢瘫痪;4、四肢瘫痪。如前所述,在H&E和LFB染色的小鼠脊髓切片中评估淋巴细胞浸润和脊髓脱髓鞘(46). 在选定的实验中,用20μg/ml MOG肽和0.5 ng/ml IL-12在体外刺激具有MOG特异性TCR转基因T细胞的2D2小鼠脾细胞48小时,然后将其转移到抹布1–/–受体诱导EAE。然后从脊髓中分离T细胞进行qRT-PCR。
统计。
使用双尾学生的t吨测试,以及P(P)<0.05被认为是显著的。对于EAE模型,采用双向方差分析法对溶媒和DCA治疗的小鼠进行分析P(P)<0.05被认为是显著的。
研究批准。
所有动物研究均由杜克大学动物护理与使用委员会和诺华生物医学研究院审查委员会批准。
致谢
我们要感谢Rathmell实验室成员的支持和有益的讨论,以及Marshall Nichols的技术援助。这项工作得到了肯尼思·雷宁基金会(J.C.Rathmell)、白血病和淋巴瘤学会(J.C.Rathmell)、美国克罗恩和结肠炎基金会(J C.Rathmel高级研究奖;A.N.Macintyre博士后奖学金284879)的资助,狼疮研究联盟(向J.C.Rathmell提供狼疮靶点识别)和国家多发性硬化学会(RG4536-A-1向M.L.Shinohara提供),并由NIH向J.C.Rathmell提供R01HL108006、R56AI102074、R00CA168997和R01AI110613(向J.W.Locasale提供)。
脚注
关于本手稿评估的说明:杜克大学、北卡罗来纳大学教堂山分校、杜克-美国和桑福德-伯纳姆医学研究所的科学家撰写的手稿,不是由编辑委员会成员处理,而是由科学编辑处理,他们与选定的外部编辑和审稿人协商。
利益冲突:Marta E.Slawinska、Lea Haeberli、Catherine Huck、Paul A.Smith和Martin A.Schneider是诺华生物医学研究院的员工。Laurence A.Turka拥有诺华的股权,并有一名家庭成员受雇于诺华。
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