程序性死亡1（PD-1）通路是限制T细胞介导免疫反应的检查点。1PD-1配体PD-L1和PD-L2均与PD-1受体结合，并诱导PD-1信号传导和相关的T细胞“耗竭”，这是对T细胞活化和增殖的可逆抑制。1通过在细胞表面表达PD-1配体并与PD-1受体阳性免疫效应细胞结合，肿瘤可以协同PD-1通路以逃避免疫反应。2
PD-1阻断抗体已被用于增强实体肿瘤的免疫力，并获得具有可接受安全性的持久临床反应。2-5初步数据也支持将PD-1阻断作为某些血液肿瘤的治疗策略。6-12通常与PD-1阻断抗体相关的不良事件包括瘙痒、皮疹和腹泻。4免疫介导性肺炎、结肠炎、肝炎、垂体炎和甲状腺炎是PD-1阻断剂不常见的毒性作用。4,13
典型的霍奇金淋巴瘤包括少量恶性Reed–Sternberg细胞，广泛但无效的炎症和免疫细胞浸润。14,15编码PD-1配体的基因，PDL1（PDL1）和PDL2（PDL2）（也称为CD274型和PDCD1LG2系列是9p24.1染色体扩增的关键靶点，9p24.1扩增是霍奇金淋巴瘤结节硬化型复发性遗传异常。149p24.1扩增子还包括JAK2号机组和基因剂量依赖性JAK-STAT活性进一步诱导PD-1配体转录。14这些拷贝数依赖机制和较少发生的染色体重排16导致霍奇金淋巴瘤患者Reed–Sternberg细胞PD-1配体过度表达。爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）感染也会增加EBV阳性霍奇金淋巴瘤中PD-1配体的表达。17
霍奇金淋巴瘤中PD-1配体过度表达的补充机制表明，这种疾病可能具有遗传决定的PD-1阻断易感性。共同简化PDL1（PDL1）和PDL2（PDL2）在9p24.1染色体上，表明受体而非选择性配体阻断是一种治疗策略。基于这些原因，霍奇金淋巴瘤被纳入了nivolumab（Bristol-Myers Squibb和Ono Pharmaceutical）1期研究的队列扩展组，nivolumba是一种针对PD-1的全人类单克隆IgG4抗体，用于复发性或难治性血液癌患者。
方法
患者
为了有资格参与本研究，患者必须年满18岁，有组织学证实的复发性或难治性霍奇金淋巴瘤的证据，至少有一个病灶超过1.5厘米（根据修订的恶性淋巴瘤反应标准定义18)（请参见补充附录，随本文全文一起提供，网址为NEJM.org网站)，一个东部肿瘤合作组织（ECOG）19性能状态得分为0或1（从0到5分，0表示无症状，得分较高表示残疾增加），之前至少接受过一种化疗方案的治疗，并且在过去100天内没有进行自体干细胞移植。主要排除标准为有中枢神经系统癌症史、有自身免疫性疾病史或活动性自身免疫病史、伴发第二次癌症、既往器官移植或异基因骨髓移植。
研究设计
这项第一阶段研究包括剂量递增和扩大队列。在剂量递增队列中，复发或难治性血液肿瘤患者接受尼沃单抗治疗，剂量为每公斤体重1毫克，剂量递增至每公斤3毫克。由于未达到最大耐受剂量，因此选择了每公斤3毫克的剂量用于扩大队列。复发性或难治性霍奇金淋巴瘤患者在第1周、第4周接受尼沃单抗，剂量为每公斤3毫克，然后每2周接受一次，直到病情进展或完全缓解，或最多接受2年。
主要目的是评估尼沃单抗的安全性和副作用。次要目标包括描述nivolumab的疗效，评估PD-1配体位点的完整性和编码配体的表达。
根据国家癌症研究所第4版《不良事件通用术语标准》，在整个研究期间以及最后一次给药后100天内评估不良事件。20在第4周、第8周、第16周和第24周以及此后每16周对患者进行疗效评估。所有患者均接受了CT和18筛查时的F-氟脱氧葡萄糖-正电子发射断层扫描（FDG-PET）、随后的CT（如上所述）和FDG-PET-扫描以确认完全反应。
研究监督
该研究方案由各中心的机构审查委员会批准，并根据《赫尔辛基宣言》和《国际协调会议良好临床实践指南》进行。所有患者在进入研究前均提供了书面知情同意书。主要研究人员与赞助商（Bristol-Myers Squibb）合作，负责设计和监督方案的研究和开发，可在NEJM.org网站赞助商负责收集和维护数据。手稿的初稿由作者编写，随后的编辑协助费用由赞助商支付。所有作者都决定将手稿提交出版，并保证报告数据的准确性和完整性以及对协议的遵守。
生物标记物评估
在霍奇金淋巴瘤组织切片上进行荧光原位杂交（FISH），以评估染色体9p24.1上的拷贝数。细菌人工染色体探针（CHORI；网址：www.chori.org)RP11-599H2O，映射到9p24.1，包括CD274型（编码PD-L1，用Spectrum Orange标记）和RP11-635N21，也映射到9p24.1，包括PDCD1LG2型（编码PD-L2，用光谱绿标记），共杂交。对照着丝粒探针，Spectrum Aqua-标记CEP9公司（雅培分子）映射到9p11-q11，根据制造商的建议进行杂交。通过核形态学特征鉴定出恶性Reed–Sternberg细胞，并对所有此类细胞进行分析。靶控探针比率至少为3:1的细胞核被归类为扩增细胞核，探针比率大于1:1但小于3:1的核被归类为相对拷贝增益，探针比率为1:1但每个探针有两个以上拷贝的核被分类为染色体9p的多体。通过自动染色系统（BOND-III，Leica Biosystems）进行免疫组织化学染色，使用PD-L1（405.9A11）和PAX5（24/Pax-5，BD Biosciences）的双染色技术，以及PD-L2（366C.9E5）和磷酸化STAT3（pSTAT3；D3A7，Cell Signaling Technology）的双染技术。方法详见补充附录.
统计分析
所有接受至少一剂尼沃单抗的患者都被纳入安全性和疗效分析。该数据库于2014年6月16日被锁定。使用监管活动医学词典，版本17.0，并制成表格。
每个研究点的主要研究者使用修订的恶性淋巴瘤反应标准评估疗效18（请参见补充附录). 最佳总体反应是指第一次给药日期与随后治疗前最后一次疗效评估之间的最佳反应。客观缓解率被定义为最佳总体缓解为部分或完全缓解的患者总数的比例。如果治疗前肿瘤测量值大于1.5 cm，则完全缓解被定义为肿瘤最大直径缩小至1.5 cm或以下，或之前累及的最大直径1.1至1.5 cm的淋巴结缩小至1 cm或以下或缩小超过75%，PET扫描结果为阴性（参见补充附录).
无进展生存期被定义为从第一次服用研究药物之日到第一次疾病进展之日或死亡之日的时间。使用Kaplan–Meier方法评估无进展生存率。反应时间定义为从第一次给药日期到第一次反应日期的时间。反应持续时间被定义为第一次反应日期与第一次进展日期或死亡日期之间的时间。每个患者肿瘤负担随时间变化的百分比图以图形形式呈现。
结果
患者
自2012年8月开始登记以来，共有23名复发或难治性霍奇金淋巴瘤患者被纳入该研究。结果报告截止2014年6月16日。患者的基线特征见中位年龄为35岁（20至54岁），17名患者（74%）ECOG表现状态评分为1。所有患者都经过了广泛的预处理，87%的患者之前接受过三种或三种以上的治疗方案；78%的患者之前接受过布伦妥昔单抗vedotin（以下简称布伦妥西单抗）治疗，78%的病人接受过自体干细胞移植。17%的患者发现了累及骨、肺、骨盆、腹膜或胸膜的结外疾病。除一例外，所有患者均为结节硬化型霍奇金淋巴瘤；剩下的病人有混合细胞。最常见的一线化疗是ABVD（阿霉素、博来霉素、长春花碱和达卡巴嗪），共有20名患者（87%）服用。
表1
基线检查时23名患者的特征
| 特性 | 价值 |
|---|
| 年龄-年 | |
| 中值的 | 35 |
| 范围 | 20–54 |
| 男性-数量（%） | 12 (52) |
| 种族编号（%）☆ | |
| 白色 | 20 (87) |
| 黑色 | 2 (9) |
| 其他 | 1 (4) |
| ECOG性能状态得分-数量（%）† | |
| 0 | 6 (26) |
| 1 | 17（74） |
| 组织学发现-数量（%） | |
| 结节性硬化 | 22 (96) |
| 混合细胞数 | 1 (4) |
| 既往系统治疗次数-次（%） | |
| 2或3 | 8 (35) |
| 4或5 | 7 (30) |
| ≥6 | 8 (35) |
| 以前的治疗次数（%） | |
| 布伦图西马布-维多汀 | 18 (78) |
| 自体干细胞移植 | 18 (78) |
| 放射治疗科 | 19 (83) |
| 结外受累-数量（%）‡ | 4（17） |
安全
在23名患者中，有22名（96%）报告了任何级别的不良事件。12名患者（52%）发生3级或4级不良事件。根据研究人员认为与研究药物相关或无关列出的3级、4级或5级不良事件包括在补充附录表S1。至少5%的患者发生的药物相关不良事件列于总体而言，18名患者（78%）报告了药物相关不良事件。最常见的是皮疹（22%）和血小板计数下降（17%）。据报道，5名患者（22%）发生与药物相关的3级不良事件，包括骨髓增生异常综合征、胰腺炎、肺炎、口腔炎、结肠炎、胃肠道炎症、血小板减少、脂肪酶水平升高、淋巴细胞水平降低和白细胞减少。没有药物相关的4级或5级不良事件。三名患者各有一次严重的药物相关不良事件（三级胰腺炎、三级骨髓增生异常综合征和二级淋巴结疼痛）(). 骨髓增生异常综合征患者此前接受过六次全身化疗、放射治疗和自体干细胞移植，但此前未接受苯达莫司汀治疗。没有与治疗相关的死亡。
表2
23例患者的药物相关不良事件☆
| 事件 | 任何等级 | 3级 |
|---|
| 患者数量（%） |
|---|
| 任何不良事件 | 18 (78) | 5 (22) |
| ≥5%的患者报告与药物相关的不良事件 | | |
| 皮疹 | 5 (22) | 0 |
| 血小板计数下降 | 4 (17) | 0 |
| 疲劳 | 3 (13) | 0 |
| 高温 | 3 (13) | 0 |
| 腹泻 | 3 (13) | 0 |
| 纳西 | 3 (13) | 0 |
| 瘙痒 | 3 (13) | 0 |
| 咳嗽 | 2 (9) | 0 |
| 甲状腺功能减退 | 2 (9) | 0 |
| 淋巴细胞计数下降 | 2 (9) | 1 (4) |
| 低磷酸盐血症 | 2 (9) | 0 |
| 高钙血症 | 2 (9) | 0 |
| 脂肪酶水平升高 | 2 (9) | 1 (4) |
| 口炎 | 2（9） | 1 (4) |
| 与药物相关的严重不良事件 | | |
| 骨髓增生异常综合征 | 1 (4) | 1 (4) |
| 淋巴结疼痛 | 1 (4) | 0 |
| 胰腺炎 | 1 (4) | 1 (4) |
在停止治疗的12名患者（52%）中，有2名患者（9%）出现毒性反应（1名患者出现骨髓增生异常综合征和血小板减少症，1名患者发生胰腺炎），4名患者（17%）在治疗期间出现进展性疾病，6名患者（26%）选择接受异基因干细胞移植（5名患者）或自体干细胞移植（in1）。除2名停止治疗的患者外，所有患者的不良事件都是可逆的。截至2014年6月16日，共有11名患者（48%）继续参与该研究。
患者接受的nivolumab剂量中位数为16（范围为6至37），在中位数为36周的治疗持续时间（范围为13至77）内进行给药，其中15名患者（65%）接受了90%或以上的预期总剂量。九名患者（39%）至少有一次剂量延迟（五次延迟是因为非血液学药物相关的不良事件，五次延期是因为与治疗无关的感染，一次延迟是由于恶劣天气）。所有延迟剂量的患者都能够重新开始治疗。两名患者（9%）因1级超敏反应而中断输液。
临床活动
有效率为87%（95%可信区间[CI]，66-97），完全缓解4例（17%），部分缓解16例（70%），稳定疾病3例（13%）(). 在4名完全缓解的患者中，有3名之前没有接受过布伦妥昔单抗治疗。结果也根据三个亚组进行总结：先前自体干细胞移植和布伦妥昔单抗治疗失败的患者，布伦妥西单抗治疗无效但在布伦妥希单抗治疗前未进行自体干细胞植入的患者，以及未接受布伦妥西单抗治疗的患者(). 在15例自体干细胞移植和布伦妥昔单抗治疗后复发的患者中，有效率为87%（95%可信区间为60-98）。在这些患者中，1例（7%）完全缓解，12例（80%）部分缓解，2例（13%）病情稳定。对于在布伦妥昔单抗治疗前未进行自体干细胞移植的3名患者，有效率为100%（95%可信区间为29-100），所有3名患者都有部分反应。在5名未接受布伦妥昔单抗治疗的患者中，有效率为80%（95%可信区间，28-99），其中3名患者（60%）有完全缓解，1名患者（20%）有部分缓解，1例患者（20%的患者）病情稳定。
表3
尼沃单抗治疗患者的临床活动。☆
| 变量 | 所有患者（N=23） | 干细胞移植和Brentuximab均失败（N=15） | 无干细胞移植和布伦图西单抗失败（N=3） | 无布仑妥昔单抗治疗（N=5）† |
|---|
| 最佳总体响应-数量（%） | | | | |
| 完整的响应 | 4（17） | 1 (7) | 0 | 3 (60) |
| 部分响应 | 16 (70) | 12 (80) | 3 (100) | 1 (20) |
| 稳定疾病 | 3 (13) | 2 (13) | 0 | 1 (20) |
| 进行性疾病 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 客观回应 | | | | |
| 患者人数 | 20 | 13 | 三 | 4 |
| 患者百分比（95%置信区间） | 87 (66–97) | 87 (60–98) | 100 (29–100) | 80 (28–99) |
| 24周时无进展生存-%（95%置信区间）‡ | 86 (62–95) | 85 (52–96) | 数控§ | 80 (20–97) |
| 总体存活率-周 | | | | |
| 中值的 | 尼泊尔卢比 | 尼泊尔卢比 | 尼泊尔卢比 | 尼泊尔卢比 |
| 数据截止时的范围¶ | 21–75 | 21–75 | 32–55 | 30–50 |
在20名完全或部分缓解的患者中，12名患者（60%）在8周内出现首次缓解（范围为3至39周）(). 24周无进展生存率为86%（95%CI，62-95）。截至本文撰写之时，6名患者选择在总体反应最佳时进行干细胞移植，11名患者继续有反应(). 总体生存率中位数尚未达到。随访时间中位数为40周（范围为0至75周）。
奈伏单抗治疗霍奇金淋巴瘤患者的反应特征及肿瘤负荷变化A组显示了20名对nivolumab治疗有反应的研究患者的反应开始时间和持续时间。每个条的颜色表示该患者之前的自体干细胞移植（ASCT）或布伦妥昔单抗治疗是否失败。条形图的长度显示了患者出现完全反应或部分反应的时间，以及反应的持续时间。六名患者在对尼沃单抗有反应后选择中止研究，进行干细胞移植。在撰写本文时，11名患者仍有反应（箭头表示）。B组显示所有23名研究患者的肿瘤负担较基线减少的百分比。两名患者符合完全缓解标准，但肿瘤负担没有100%降低。一名部分缓解的患者肿瘤负担减少了99%，但正电子发射断层扫描结果呈阳性。
显示了每个患者从基线检查时肿瘤负担的最大减少。整个队列的无进展生存率如所示补充附录中的图S1.
PD-1配体位点分析及表达
在有可用肿瘤样本的10名患者亚组中，PDL1（PDL1）和PDL2（PDL2）使用固定肿瘤活检标本和三探针FISH分析评估Reed–Sternberg细胞的拷贝数(PDL1（PDL1）[CD274型],PDL2（PDL2）[PDCD1LG2系列]和控制着丝粒探针）(). 在通过FISH分析的所有肿瘤中，肿瘤细胞有3到15个拷贝PDL1（PDL1）和PDL2（PDL2）以9p染色体的扩增、相对拷贝增加或多体性为特征的模式(、和补充附录中的表S2和图S2). 在所有样本中，通过其特征形态学特征和PAX5染色鉴定的Reed–Sternberg细胞表达PD-L1和PD-L2蛋白(、和补充附录中的表S3和图S2). 肿瘤细胞的核pSTAT3也呈阳性，表明JAK-STAT信号传导活跃(、和补充附录中的表S3和图S2). 现有霍奇金淋巴瘤活检标本中浸润的T细胞主要表达低水平的PD-1受体(补充附录中的表S4和图S3). 总之，这些数据表明，本研究中所有可评估的霍奇金淋巴瘤患者的PD-1配体位点和相关蛋白表达均有数字变化。
遗传和免疫组织化学分析PDL1（PDL1）和PDL2（PDL2）霍奇金淋巴瘤患者的基因座、PD-L1和PD-L2蛋白表达及爱泼斯坦-巴尔病毒状态所示为PDL1（PDL1）和PDL2（PDL2）Reed–Sternberg细胞中的基因座和PD-L1和PD-L2蛋白表达。图A显示了用于荧光原位杂交（FISH）检测的细菌人工染色体克隆的位置和颜色标记第1页（红色）和PDL2（PDL2）（绿色）在染色体9p24.1上。从患者获得的代表性图像显示PDL1（PDL1）和PDL2（PDL2）（面板B，左侧），与三个着丝粒信号（浅绿色）相比，有六个绿-红（黄色重叠）信号（表示融合信号），或PDL1（PDL1）和PDL2（PDL2）放大（面板B，右侧），绿色–红色（黄色重叠）信号的数量是着丝粒信号（浅绿色）的三倍多。在C组中，PD-L1（上排）和PD-L2（下排）的表达通过棕色染色在与B组相同患者的Reed–Sternberg细胞中显示。箭头表示恶性细胞。PD-L1与PAX5一起评估，以识别PAX5阳性细胞（上排显示为红色）。PD-L2与磷酸化信号转导子和转录激活子3（pSTAT3）相关，这反映了Janus激酶–STAT的激活（下一行以红色显示）。比例尺代表50μm.面板D显示了研究患者中PD-L1和PD-L2蛋白的表达以及与爱泼斯坦-巴尔病毒编码信使RNA（EBER）相关的状态，这些患者可以进行评估。所有被纳入分析的患者都有增加拷贝数的结构基础PDL1（PDL1）和PDL2（PDL2）在染色体9p24.1上，包括9p的额外拷贝（多染色体9p）PDL1（PDL1）或第二阶段，或放大PDL1（PDL1）或PDL2（PDL2）(补充附录中的表S2和图S2). 通过FISH分析评估爱泼斯坦-巴尔病毒状态。HRS表示Hodgkin's Reed–Sternberg和IHC免疫组化。
讨论
在这项研究中，我们发现nivolumab介导的PD-1阻断对霍奇金淋巴瘤患者是一种高效的治疗方法，霍奇金淋巴瘤是一种具有PD-1配体过度表达遗传基础和明显但无效的炎症和免疫细胞浸润的疾病。在经过大量预处理的复发或难治性霍奇金淋巴瘤患者中，大多数患者在自体干细胞移植和布伦妥昔单抗治疗后复发，尼沃单抗的使用与总有效率87%和24周无进展生存率86%相关。不良事件主要为1级或2级。不良事件发生率与nivolumab在实体瘤患者中的试验相似。4自体干细胞移植后霍奇金淋巴瘤病情进展患者的治疗选择有限21-23复发后对布伦妥昔单抗的反应相对较短，24nivolumab介导的PD-1阻断可能是这些患者有希望的靶向治疗。
霍奇金淋巴瘤中频繁的染色体9p24.1扩增和相关的PD-1配体过度表达，以及受累淋巴结中明显但无效的炎症反应，为评估PD-1阻断对复发或难治性疾病患者的疗效提供了令人信服的理由。在本研究中，所有具有可用肿瘤标本的患者同时获得PDL1（PDL1）和PDL2（PDL2）基因座，PD-1配体表达增加，以及JAK-STAT信号传导活跃的证据。在这组患者中PDL1（PDL1）和PDL2（PDL2）高于先前报道的新诊断霍奇金淋巴瘤系列患者，14,25提示这种疾病特异性基因改变可能具有不良的预后意义。观察到EBV阳性率低（1/10），这与结节硬化型霍奇金淋巴瘤中EBV的低优势相一致。26
在从患者获得的现有活检样本中，肿瘤浸润性T细胞在标准免疫组织化学分析中主要表达低水平的PD-1。先前的研究表明，PD-1阻断可选择性增强PD-1表达水平低或中等而非高的CD8+T细胞的功能。27在最近的临床试验中，肿瘤滤过性T细胞上PD-1的水平与实体肿瘤上PD-L1的表达相比，对nivolumab治疗反应的预测明显不足，6与我们的结果一致的发现。
尼沃单抗治疗对反复或难治性霍奇金淋巴瘤患者的频繁临床反应以及PD-1配体位点的遗传改变，突出了PD-1免疫逃避途径的重要性以及遗传定义的对PD-1阻断的敏感性。
致谢
由Bristol-Myers Squibb提供支持，由美国国立卫生研究院向Freeman博士提供资助（U54CA163125和P01AI056299；R01CA161026向Shipp博士提供资助），并由Miller基金会向Shipp.博士提供资助。
安塞尔博士报告说，他获得了西雅图遗传学、Celldex Therapeutics、Millennium、Idera和Regeneron的资助；Lesokhin博士，接受Bristol-Myers Squibb的咨询费和资助；Halwani博士，获得西雅图遗传学、Millennium、Kyowa Hakko Kirin、AbbVie、Genentech和Bristol-Myers Squibb的资助；Freeman博士，从与PD-1、PD-L1和PD-L2通路相关的专利（美国6808710、美国6936704、美国7038013、美国7101550、美国7432059、美国7635757、美国7638492、美国7700301、美国7709214、美国8552154和美国8652465）中获得特许权使用费，这些专利授权给Bristol-Myers Squibb、Roche、Merck、EMD Serono、Boehringer Ingelheim、Amplimmune和Novartis；Rodig博士，获得Bristol-Myers Squibb和Ventana/Roche的资助，拥有与抗PD-L1单克隆抗体和片段相关的未决专利申请（US 61/895543）；朱女士、格罗索博士和金博士是百时美施贵宝的员工；Timmerman博士，获得Bristol-Myers Squibb的资助；Shipp博士，接受Bristol-Myers Squibb、Bayer、Gilead、Merck、Pharmacyclics和Janssen的顾问委员会服务费，并接受Bristol-Myers Sgibb、Sanofi-Aventis和Bayer的资助；和阿尔芒博士，从默克公司获得咨询费。
我们感谢参与本研究的患者、他们的家人以及临床教职员工；百翰女子医院病理科的Heather H.Sun和Heather Homer提供了重要的技术支持；克里斯蒂娜·哈特曼（Christina Hartman）、凯瑟琳·李尔斯（Katherine Lears）和玛丽亚·梅兹（Maria Mezes）、布里斯托尔·迈尔斯·施贵宝（Bristol-Myers Squibb）为研究设计做出了贡献；施普林格医疗保健公司科学传播部的Michelle Daniels和Christopher Radel提供医学写作和编辑支持。
