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实验肺研究。作者手稿；PMC 2015年3月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
Exp Lung Res.2015年3月；41(2): 93–102.
2014年12月16日在线发布。 数字对象标识：10.3109/01902148.2014.976298
预防性维修识别码：项目经理4336205
NIHMSID公司：尼姆斯644741
PMID：25514367

肺癌组织中DNA甲基化谱与表面活性蛋白A2基因的表达

梅丽莎·格雷格达医学博士。，1,2,*† 帕特里夏·西尔维拉，博士。，2,三，* 尼尔·J·托马斯医学博士。，1,2,4 苏珊·L·迪安杰洛，理学学士。，2和乔安娜·弗洛罗斯，博士。2,5
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充材料

摘要

对基因甲基化特征的了解有助于识别可能指导疾病诊断和有效治疗的生物标记物。人表面活性蛋白A（SP-A）在肺稳态和免疫中起着重要作用，由两个基因（SFTPA1和SFTPA2）编码。本研究的目的是确定肺癌组织中SFTPA2基因启动子区的差异甲基化CpG位点，并确定启动子甲基化谱与基因表达之间的相关性。为此，我们收集了28对癌性人类肺组织和邻近的非癌性肺组织：17个腺癌（AC）、9个鳞状细胞癌（SCC）和2个具有SCC特征的AC，并通过亚硫酸氢盐转换评估SFTPA2启动子区域的DNA甲基化。我们的结果发现，与NC组织相比，癌组织中SFTPA2基因的一个CpG位点的甲基化比率较高（0.36对0.11，p=0.001）。在评估AC样本时，我们还发现癌组织的甲基化率较高（0.43比0.10，p=0.02）。在鳞状细胞癌组，尽管癌组织的甲基化率较高（0.22比0.11），但这种差异在统计学上并不显著（p=0.35）。与邻近的NC组织相比，癌组织中SFTPA2 mRNA和总SP-A蛋白的表达显著降低（p<0.001），并且与AC样本中SFTPA2-CpG位点的高甲基化状态相关。这项初步研究的结果可能为SFTPA2作为肺癌诊断的生物标志物的未来应用提供了希望。

关键词：甲基化、SP-A、腺癌、鳞癌

介绍

表观遗传学是研究基因表达或细胞表型的可遗传变化，这些变化是由除基本序列变化以外的机制引起的。肺细胞的表观遗传学过程包括组蛋白修饰、基因启动子中CpG位点的甲基化和miRNA调节(1). 这些分子事件受到环境因素的影响，如饮食、空气污染、吸烟等，它们在基因表达调控中起着重要作用(2,三). 因此，表观遗传机制可能代表遗传、环境和疾病发展之间的联系(1,4).

基因启动子区CG对脱氧胞苷（C）处的DNA甲基化对mRNA表达有深刻影响。这一过程主要由DNA甲基转移酶（DNMT）调节，DNMT催化CpG位点C碱基上的甲基加成，从而产生5-甲基胞苷(5). 特别是，DNMT1和DNMT3被证明可以协同沉默人类癌细胞中的基因(6). 超甲基化已被证明在许多癌症中介导抑癌基因的基因沉默(7–9). 另一方面，DNA低甲基化也可以通过增强致癌基因的表达来影响癌症的发展。最近的研究表明，特定基因的高甲基化和低甲基化以及DNMT的过度表达是各种癌症发生的主要原因，尤其是在早期阶段(10,11). 总之，这些发现表明，早期检测基因启动子甲基化改变可能是一种强有力的诊断工具。此外，DNA甲基化状态的知识也可能完善疾病实体的病理生理学图像，并允许开发新的治疗方法(12–15).

一般来说，高表达的基因在启动子区域的甲基化含量低于非活性基因，而非活性基因的启动子通常是高甲基化的(12,16–18). 我们之前已经发现编码先天免疫分子（肺癌中的表面活性蛋白）的基因的DNA甲基化谱发生了改变(19). 我们得出结论，SFTPA1和SP-D启动子CpG位点的甲基化/去甲基化导致基因表达改变，这反过来可能有助于肺部炎症疾病和肺癌的发展(19).

SP-A是表面活性剂中含量最丰富的蛋白质，参与宿主防御和表面活性剂相关功能(20). SP-A在先天免疫中的作用主要通过其结合多种病原体的能力介导，增强肺泡巨噬细胞的吞噬和趋化性，诱导免疫细胞增殖，刺激促炎细胞因子的产生，以及调节活性氧物种的生成(21–23). 此外，SP-A还参与其他几种功能，包括在分娩中作为激素，以及维持细胞外形式的管状髓鞘的结构(24–26).

两个基因编码人类SP-A：SFTPA1（或SP-A1）和SFTPA2（或SP-A2）。SFTPA1和SFTPA2基因产物在结构和功能、吞噬活性和促炎细胞因子的产生方面都有所不同(27–30). 在基因组中，这些基因的转录方向相反，但显示出相同的基因组织。这两个基因的启动子区域虽然只有25%的序列组成相似，但都含有丰富的CpG位点，因此是研究DNA甲基化模式的理想区域(补充图1). CpG位点（或岛）是短链DNA，具有高胞嘧啶和鸟嘌呤含量（即CG含量），具有连接两个残基的磷酸二酯键。我们已经报道了肺癌组织中SFTPA1基因的两个CpG位点的甲基化状态与相邻的非癌（NC）肺组织相比的显著差异(19). 这些观察结果表明SFTPA1可能是一种潜在的生物标记物，可用于肺癌的诊断和治疗(8).

肺癌是癌症相关死亡的主要原因，临床上可分为两种类型：小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌的亚型包括腺癌（AC）、鳞癌（SCC）和大细胞癌。非小细胞肺癌占肺癌的85-90%，是侵袭性较小的亚型。因此，它的早期检测对挽救生命来说是最有希望的。非小细胞肺癌的DNA甲基化研究有很多(31–33). 然而，SFTPA2基因在NC和癌肺组织中的甲基化特征尚不明确。

本研究的假设是，人类肺部NC和癌症样本之间SFTPA2基因启动子的DNA甲基化状态存在差异，这些差异可能会影响转录，导致SFTPA2水平的改变。为了验证这个假设，我们测定了SFTPA2启动子处14个CpG位点的甲基化状态(图1)并研究了一组配对癌组织和癌旁NC肺组织中SFTPA2和DNMT（DNMT1和DNMT3）mRNA表达的相关性。我们发现：a）肺AC样本中SFTPA2启动子处的高甲基化CpG位点与SFTPA2 mRNA和SP-a蛋白表达的抑制相关，以及b）AC和SCC肿瘤样本中DNMT1和DNMT3的过度表达。我们的结果表明，SFTPA2甲基化是肺癌诊断的潜在生物标志物。

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本研究分析了SFTPA2启动子CpG位点

所研究区域和14个CpG位点的示意图如图所示（上图）。底部面板上显示的序列（664 bp）对应于SFTPA2转录起始位点上游核苷酸−1628和−2292之间的区域（NCBI参考序列：NG_013046.1）。

材料和方法

肺部样本

共从宾夕法尼亚州立好时肿瘤银行、宾夕法尼亚州立医学院病理学系和堪萨斯大学生物标本共享资源获取了45对癌性和邻近的NC肺组织。根据组织病理学分析，癌组织被确定为腺癌（n=25）、鳞状细胞癌（n=17）或具有鳞状细胞特征的腺癌（n=3）。所有方案均由宾夕法尼亚州立好时医学院机构审查委员会审查和批准。

DNA提取

按照制造商的方案，将肺组织均质化，并使用QIAmp DNA Mini Kit（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）纯化DNA。DNA质量和浓度均通过Nanodrop进行验证。

亚硫酸氢盐转化、聚合酶链反应（PCR）和测序

使用EZ DNA甲基化试剂盒（加利福尼亚州欧文市，Zymo Research），通过亚硫酸氢盐转化，对约200-500ng纯化DNA进行甲基化分析，并进行轻微修改。简而言之，在柱内脱硫和净化后，将柱旋转1分钟，然后干燥10分钟，然后继续洗脱。SFTPA2基因启动子区域（SFTPA2，基因ID:729238）664个核苷酸的扩增子，覆盖转录起始位点上游的核苷酸−2292/−1628(图1)用以下特异引物通过PCR扩增：MV1611（Sense，GGAGTTAGTGAGATGTGGATTTGA，涵盖转录起始位点上游的核苷酸−2292/−2266）和MV1613（Anti-Sense，GGTAGGAGAAGTGGTGTGGGTGTGTGTG，涵盖转录初始位点上游的核酸−1656/−1628）。PCR产物使用QIAquick DNA纯化试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚QIAQUIC）进行纯化，并在宾州好时分子遗传学核心设施进行测序分析之前在2%琼脂糖凝胶上进行检查。由于亚硫酸氢盐转换后测序质量低，我们只能从45对样本中的28个样本中获得数据：17对AC、9对SCC和2对具有SCC特征的AC。

甲基化分析

SFTPA2启动子扩增区所有14个CpG位点的甲基化状态(图1)通过使用Bioedit软件对转化产物进行序列分析确定。数据显示为甲基化等位基因与总等位基因的比率（甲基化+非甲基化的等位基因）(34).

基因表达分析

使用PureLink RNA迷你试剂盒（加利福尼亚州卡尔斯巴德生命科技公司）从癌组织和癌旁NC肺组织中提取总RNA。RNA浓度和质量均由宾夕法尼亚州立大学好时功能基因组学核心设施的生物分析仪2100测定。纯化后，只有25对肿瘤/非肿瘤对显示出可接受的RNA质量（RIN>7）：12个AC、12个SCC和1个具有SCC特征的AC。使用高容量cDNA逆转录试剂盒（加利福尼亚州卡尔斯巴德生命科技公司）对其中总共600 ng进行逆转录。SFTPA2、DNMT1和DNMT3的表达使用实时PCR和TaqMan分析（加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命技术公司）进行测量，并使用相对定量方法归一化为18s rRNA表达（人类Euk 18s rRNA-TaqMan分析，应用生物系统公司）(35).

蛋白质纯化和Western Blot

按照制造商的方案，使用RIPA缓冲液（Thermo，Rockford，IL）从8个癌组织（4个AC和4个SCC）和8个癌旁NC肺组织中提取蛋白质。蛋白质浓度通过BCA分析测定（Thermo、Rockford、IL），30μg用于Western Blot分析，抗体可识别SP-A1和SP-A2蛋白质(41)和亲环素B（马萨诸塞州剑桥Abcam）作为加载控制。

转录因子结合位点的预测

基于模式的在线软件补丁(36)用于预测SFTPA2启动子中的转录因子结合位点。针对因子结合进行的DNA序列检查与不同甲基化CpG位点周围的区域相对应。只包括人类标识符，不允许不匹配。

统计分析

采用配对t检验比较NC组和癌症组的甲基化比率。腺癌组和鳞癌组的数据也分别进行分析。通过t检验分析NC组和癌症组之间基因和蛋白表达的差异。当p<0.05时，考虑到统计学上的显著差异。

结果

肺腺癌中SFTPA2启动子的CpG位点高度甲基化

引物MV1611和MV1613（664个核苷酸）扩增的DNA产物包含14个CpG位点(图1). 通过亚硫酸氢盐转化分析了它们的甲基化率，结果如所示表1。由于亚硫酸氢盐转化后测序质量低，我们只能从45对样本中的28个样本中获得数据：17对AC、9对SCC和2对具有SCC特征的AC。在这些研究中，我们发现一个CpG位点（位点2，位于SFTPA2转录起始位点上游−2215）在癌组织中的甲基化比率（n=28）高于相邻的NC肺组织（0.36对0.11，p=0.001）。当仅评估AC组及其相应的相邻NC对照样本（n=17）时，我们发现癌组织样本的甲基化率高于同一患者的相邻NC肺组织（0.43 vs.0.1，p=0.02）(图2). 然而，尽管在SCC组（n=9）中，癌组织的甲基化率较高（0.22比0.11，NC组），但这种差异在统计学上并不显著（p=0.35）(图2).

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癌症及癌旁NC肺组织中CpG位点2的DNA甲基化比率

将所有肺癌组织（AC+SCC）与相邻的NC肺组织（p=0.001，n=28）进行比较，并将AC组与相邻NC肺组织进行比较（p=0.02，n=17），观察到统计差异。比较SCC和NC时，未观察到具有统计学意义的差异（p=0.35，n=9）。结果表示为平均值±SEM。

表1

肺癌组织与邻近非癌肺组织中SFTPA2基因启动子区CpG位点甲基化的比较

CpG站点职位*甲基化率（平均值±SD）p值
肿瘤正常
1−22570.99±0.061±00.33
2−22150.36±0.470.11±0.290.001
三−21470.90±0.280.90±0.281
4−21420.73±0.440.82±0.370.43
5−20990.32±0.430.24±0.410.65
6−207100.09±0.270.1
7−194600不适用
8−192500不适用
9−191900.04±0.190.33
10−189800不适用
11−189400不适用
12−187500不适用
13−18330.07±0.040.06±0.040.87
14−17940.10±0.280.12±0.320.83
*相对于SFTPA2转录起始位点（NCBI参考序列：NG_013046.1）

与邻近的NC组织相比，癌组织中SFTPA2 mRNA和蛋白表达水平显著降低

为了评估SFTPA2启动子超甲基化的影响，我们通过实时PCR测量了肿瘤和邻近NC组织子集（12个AC/NC对和12个SCC/NC对）中SFTPA2 mRNA的表达水平。图3显示肺癌（AC和SCC）与相邻NC样本中SFTPA2 mRNA的相对表达，标准化为18秒。与NC组织相比，癌组织中SFTPA2的表达显著降低（p<0.001）。此外，通过Western Blot在成对样本子集（4对AC/NC和4对SCC/NC）中测量的总SP-A蛋白水平也显著降低(图4).

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SFTPA2基因在NC与肺癌样本中的表达

通过实时PCR测定NC和肺癌组织中SFTPA2 mRNA的表达，并以平均值±SEM表示。AC（n=12）和SCC（n=1）癌症样本与NC相邻组织相比，SFTPA2表达水平显著降低（p<0.001）。

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NC与肺癌样本中的总SP-A蛋白表达

NC和肺癌组织中总SP-A和亲环素B（负荷控制）的Western Blot分析。所分析的8对（4对AC和4对SCC）中的4对NC/肿瘤（2对AC和2对SCC。

癌组织中DNMT1和DNMT3 mRNA水平与邻近NC组织相比升高

为了确定癌症样本中SFTPA2的高甲基化状态是否与DNA甲基化酶的增加相关，采用实时PCR检测DNMT1和DNMT3的表达，并将样本子集（12个AC/NC对和12个SCC/NC对）的表达标准化为18s。图5结果表明，与NC相比，癌症患者的DNMT1和DNMT3均显著增加（p<0.05）。在获得SFTPA2甲基化和DNMT表达数据的样本子集（9个AC和5个SCC）中，我们发现SFTPA2的减少与AC中DNMT1表达的增加相关，但与SCC中的增加无关。然而，鳞状细胞癌样本中DNMT3的表达也显著增加(补充表2).

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肺癌和NC组织中DNMT基因的表达

采用实时PCR检测NC和肺癌组织中DNMT1和DNMT3 mRNA的表达，并将其表达为平均值+SEM。AC（n=12）和SCC（n=1）肿瘤样本的DNMT1与DNMT3水平均显著升高（p<0.05）。

DNA甲基化导致转录因子的差异结合

使用基于模式的在线软件Patch(36)，我们在CpG位点2附近的DNA序列中确定了人类转录因子的调控序列(表2). 该软件在差异甲基化CpG位点周围的序列中确定了以下具有预测结合位点的转录因子：维生素D受体（VDR）、腺病毒增强因子结合因子/多瘤病毒增强因子激活剂3蛋白（E1AF/PEA3）、CCAAT增强因子结合蛋白β（C/EBPβ）、，固醇调节元件结合蛋白（SRE BP）、血清反应因子（SRF）、特异性蛋白1（SP1）、c-Ets-1转录因子、淋巴增强因子结合因子1（LEF-1）、甲状腺激素受体（T3R）和视黄醇X受体α（RXRα）(表2).

表2

转录因子与SFTPA2启动子的预测结合

职位*顺序结合因素**
−2224GGATG公司PEA3公司
−2223关贸总协定C/EBP测试版
SRE业务伙伴
战略参考框架
−2218中国交建SP1型
−2214CCGCA公司c-等-1
LEF-1型
−2210阿格加格T3R-α
RXR-阿尔法
视频数据记录器
*相对于SFTPA2转录起始位点
**腺病毒增强剂结合因子/多瘤病毒增强剂激活剂3蛋白（E1AF/PEA3）、CCAAT增强剂结合蛋白β（C/EBPβ）、固醇调节元件结合蛋白（SRE BP）、血清反应因子（SRF）、特异性蛋白1（SP1）、C-Ets-1转录因子、淋巴增强剂结合蛋白质1（LEF-1）、，甲状腺激素受体（T3R）和类视黄醇X受体α（RXRα）、维生素D受体（VDR），

讨论

肺癌是癌症相关死亡的主要原因，其死亡人数超过乳腺癌、前列腺癌和结肠癌的总和。目前，50%以上的肺癌患者在确诊后一年内死亡，治疗的效率高度依赖于早期诊断(37). 因此，识别新的肺癌诊断生物标记物可能有助于提高患者生存率。表观遗传变化，包括DNA甲基化，发生在许多癌症的发展过程中，这些变化导致基因表达的改变，从而导致癌症的发病机制。因此，识别表观遗传特征不仅有助于开发额外的诊断工具，而且有助于识别导致癌症进展的分子机制。

人SP-A在肺固有免疫和维持正常肺功能中起着重要作用。这两个SP-A基因的表达由许多细胞和分子因素介导，已有报道称SP-A1和SP-A2基因变异和/或表达与肺部疾病易感性的相关性(38–42). 据报道，肺疾病如特发性肺纤维化和新生儿呼吸窘迫综合征的表面活性蛋白A水平降低(43). 此外，SFTPA2的罕见杂合突变与肺纤维化和肺腺癌有关(44,45). 在之前的一项研究中，在肺癌样本中发现SFTPA1基因甲基化状态的差异(19). 在这里，我们研究了SFTPA2启动子CpG密集区的DNA甲基化，该启动子位于包含14个CpG位点的转录起始位点上游1600–2300 bp(图1). 该区域是根据初步序列分析中发现的CpG位点的高密度选择的。我们发现，与相邻的NC肺组织相比，这些CpG位点中的一个在AC肺样本中具有显著较高的甲基化比率，并且SCC组与NC组相比，甲基化程度较高，但并不显著(图2). 在这两种情况下，这种模式都与SFTPA2基因表达减少有关(图3和​和4）4)在9对AC/NC和5对SCC/NC样本中，获得了CpG位点2甲基化和SFTPA2 mRNA表达结果(补充表1). 基于这些发现，我们推测SFTPA2启动子的高甲基化和SFTPA2基因表达的减少可能导致致癌的一系列事件(46).

基因启动子的异常DNA甲基化以前曾在各种肺癌中观察到(10,13–15,47,48). 甲基化模式的维持由DNA甲基转移酶（DNMT1，DNMT3）控制，以应对各种侮辱和环境暴露(1,6,49). 因为以前在不同肿瘤和分期的癌细胞中发现过这种酶的过度表达(50–52)在我们的样本集中分析了DNMT1和DNMT3的表达。与之前的研究结果一致，在当前的研究中，AC和SCC样本的DNMT1和DNMT3表达均高于非癌组织(图5). 然而，在对相同样本进行甲基化和DNMT表达分析的子集中，DNMT1的表达仅在AC中显著升高，而DNMT3在AC和SCC中均升高(补充表1和2). 这表明SFTPA2启动子的高甲基化状态可能有助于AC和/或SCC的发病机制，也许还有其他肺癌，但肯定存在其他解释来解释目前的发现。

如上所述，SFTPA2启动子区域的超甲基化可能影响基本转录因子的结合，这些转录因子可以通过改变SFTPA2的表达来促进致癌(18). 为了验证这个假设，我们进行了生物信息学利用在线工具分析CpG位点2的DNA周围序列，预测转录因子结合位点，并确定至少10个因子的潜在结合位点(表2).图6显示了包含CpG位点2（SFTPA2转录起始位点上游−2200/−2230位置）的DNA区域中已识别转录因子的预测结合位点的图示。我们推测，可能控制肺癌中观察到的SFTPA2基因表达降低的机制之一是通过一个或多个转录因子与高甲基化CpG位点的结合受损介导的。未来的研究将侧重于描述这些相互作用，以及研究SFTPA2水平改变对肺癌患者肺功能的影响，包括表面活性剂缺乏依从性降低和免疫宿主功能障碍风险增加。

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转录因子与CpG位点2的预测结合

在线软件Patch预测SFTPA2启动子序列中转录因子的结合(www.gene-regulation.com/cgi-bin/pub/programs/patch/bin/patch.cgi). 该图显示了CpG位点2周围区域的预测（SFTPA2转录起始位点上游的位置−2200/−2230）。该框指示CpG站点2（−2215）的位置。

在高甲基化CpG位点周围区域鉴定的转录因子(表2)PEA3和VDR已被研究最多并与肺部恶性肿瘤相关(53–57). 虽然PEA3在肺癌细胞转移中起着关键作用，但肺癌中VDR表达的增加与AC患者生存率的提高有关(58,59). 此外，VDR和表面活性剂生理学之间的联系已在前面描述过。维生素D的天然代谢物三（1α，25-二羟基-3-表维他明D三)之前发现在刺激表面活性剂合成方面起着重要作用(57). 此外，VDR在新生儿表面活性蛋白的表达中起作用(60). 我们推测SFTPA2启动子区域的甲基化可以显著影响PEA3和/或VDR与该区域的结合(图6).

总之，我们在SFTPA2启动子中发现了肺癌的甲基化特征，它代表了肺癌诊断的潜在生物标志物。我们推测，在未来，将SFTPA2甲基化谱添加到腺癌诊断面板中可能会增加诊断特异性，并代表了当前诊断方法的一种新的辅助手段。此外，SFTPA2 DNA甲基化谱可作为监测疾病和免疫进展（即宿主防御）的潜在工具。关于肺癌的预防，了解个体的DNA甲基化状态可能有助于识别那些可能发展为腺癌和相关功能障碍或SFTPA2生成减少的高危人群。

总之，SFTPA2基因启动子的甲基化状态在人肺腺癌和邻近非癌肺组织样本之间存在显著差异。癌组织样本中SFTPA2基因启动子的高甲基化状态与SP-A基因表达降低有关。这些发现可能为SFTPA2作为肺癌诊断和/或治疗的生物标记物的未来应用带来希望。

补充材料

补充图1

补充图1：

使用在线软件CpG Island Searcher比较SFTPA2（上面板，NCBI参考序列：NG_013046.1）和SFTPA1（下面板，NCBI参考序列NG_021189.1）序列启动子区域（5000bp）中的CpG位点(http://cpgislands.usc.edu/) (61). 箭头之间显示了本研究的兴趣序列，其中包含一个CpG位点密集的区域，以蓝色显示（CpG岛1）。

单击此处查看。（15K，docx）

补充图2

单击此处查看。（16K，docx）

致谢

基金

这项研究得到了国立卫生研究院拨款HL-34788和巴苏米安信托拨款126717的支持。

作者感谢Sanmei Hu和David Stanford提供的技术支持，以及David Mu博士提供的宾夕法尼亚州病理科的肺样本。

脚注

利益声明

作者报告没有利益冲突。

工具书类

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