尼罗替尼联合三氧化二砷对慢性肌样白血病急变期患者原代白血病细胞增殖分化的影响

形态学检查

使用Wright-Giemsa染色，我们检查了ATO和尼罗替尼处理后的细胞形态。如图所示2对照细胞相对较大，细胞核/细胞质比也高于处理细胞。未经处理的对照细胞呈圆形或椭圆形，染色质在细胞核内分布松散且不均匀，细胞核大而清晰，细胞质呈蓝色。在ATO或尼罗替尼治疗后，细胞大小大大减小。此外，染色质浓缩，细胞核/细胞质比例降低，表明这些细胞处于早期或中期分化阶段。在ATO和尼罗替尼联合治疗组，细胞表现出早期的红细胞分化形态，少数细胞发生粒细胞分化。

在单独的窗口中打开

图2

ATO和尼罗替尼对细胞分化影响的形态学检查。用1μM ATO和5 nM尼罗替尼单独或联合处理细胞72小时。细胞用Wright-Giemsa染色，并在1000倍放大的光学显微镜下检查细胞形态。

ATO和尼罗替尼对血红蛋白含量的影响

使用联苯胺染色评估ATO或尼罗替尼处理后的细胞血红蛋白含量。ATO或尼罗替尼单独处理显著增加了苯偶定阳性细胞的百分比，尼罗替尼可更有效地上调苯偶定阴性细胞的数量（对照组为8.41%±0.75%；ATO，31.43%±1.15%；尼洛替尼，42.05%±1.69%；与对照组相比P<0.01）（图三). 虽然ATO和尼罗替尼联合治疗提高了苯偶定阳性细胞的百分率，但效果不如尼罗替尼单用治疗（ATO+尼罗替尼，34.96%±1.12%）。这些结果表明，ATO和尼罗替尼处理可以提高CML-BC血红蛋白含量。

在单独的窗口中打开

图3

ATO和尼罗替尼对血红蛋白含量的影响。用1μM ATO和5 nM尼罗替尼单独或联合处理细胞72小时。然后，用联苯胺对细胞样本进行染色。（A）计算联苯胺阳性细胞的百分比**与对照组相比，P<0.01。（B）联苯胺染色的代表性数据（放大200倍）。

ATO和尼罗替尼对细胞表面抗原表达的影响

接下来，我们使用流式细胞仪分析测定细胞表面抗原的表达，包括GPA、CD41、CD11b和CD14。如图所示4与ATO和尼罗替尼单独或联合孵育72小时可显著诱导GPA水平，即红系标记物。尼洛替尼对GPA表达的影响最大（对照组为17.85%±0.74%；ATO，73.36%±1.28%；尼洛替尼，86.34%±0.52%；ATO+Nilotinib，85.39%±1.32%；与对照组相比P<0.01）。尼罗替尼治疗组与ATO加尼罗替尼组GPA表达无显著性差异（P>0.05）。同样，ATO和尼罗替尼单独或联合使用可提高巨噬细胞和粒细胞系标志物CD41和CD11b的表达（P<0.05）。与单药治疗相比，联合治疗在上调CD41和CD11b水平方面更有效。药物治疗后单核细胞生物标志物CD14的表达与对照组相比无显著性差异（P>0.05）。这些结果表明，ATO和尼罗替尼治疗可以促进CML-BC细胞的红系分化。

在单独的窗口中打开

图4

ATO和尼洛替尼对细胞表面抗原表达的影响。A类：ATO和尼罗替尼单独或联合诱导的GPA水平（与对照组相比P<0.01）。B类/C类：单独或联合应用ATO和尼罗替尼均能提高CD41和CD11b的表达（P<0.05）。与单药治疗相比，联合治疗在上调CD41和CD11b水平方面更有效。D类药物治疗后CD14表达与对照组比较（P>0.05）。

细胞培养

CML-BC细胞来源于中国人民解放军第175医院的五名CML-BC患者。根据骨髓涂片和费城染色体分析诊断为CML-BC。使用淋巴细胞分离培养基，通过密度离心（500 g，20 min）分离骨髓单个核细胞。用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗中间层单核细胞样品三次，并用含有10%FBS和1%抗生素的培养基重新悬浮。将单细胞悬浮液调整到适当的密度，并以5-6个细胞/孔的密度播种到96个平板上。7–10天后在体外培养后，将单克隆井亚克隆。重复此程序三到五次，直到阳性率达到100%。

实验作业

细胞随机分为四组，每组三个孔。对照细胞用RPMI 1640培养基保存。在ATO和尼罗替尼组中，分别用1μM ATO和5 nM尼罗替尼来处理细胞。在ATO+尼罗替尼组中，细胞与1μM ATO+5 nM尼罗替尼孵育。

细胞增殖评估

为了评估细胞增殖，使用了3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）分析。细胞以3×10的密度接种到96个板上^三细胞/孔。接种后，用含有ATO、尼罗替尼或ATO加尼罗替尼可的200μL培养基处理细胞。对照细胞用相同体积的培养基培养。在37°C和5%CO中孵育24、48或72小时后₂培养箱中，向每个孔中添加20μL MTT（5 mg/mL）。在随后的4小时培养后，移除培养基，并向每个孔中添加150μL二甲基亚砜（DMSO），以重新悬浮MTT代谢产物。使用扫描微板分光光度计在570 nm处测量溶解的甲赞的吸光度。

染色法

通过离心收集细胞，然后制备细胞涂片。在甲醇-冰醋酸溶液中固定10分钟后，细胞用Wright-Giemsa染色1分钟，然后用PBS洗涤。细胞样品在空气中干燥，并在光学显微镜下检查细胞形态。

联苯胺染色

将总计0.5 mL细胞悬液与14μL联苯胺染料和0.15μL 30%过氧化氢混合。5分钟后，向混合物中添加0.15μL 5%亚硝基铁氢化钠。培养10-15分钟后，在相差显微镜（Motic AE30）下检查细胞。含有血红蛋白的蓝棕色细胞被鉴定为阳性细胞，而其他细胞被认定为阴性细胞。共计数300个细胞，阳性细胞的百分比由三个独立的实验计算得出。

细胞表面抗原

流式细胞仪分析细胞表面抗原的表达。简单地说，药物治疗三天后，以1500 rpm离心5分钟收集细胞。丢弃上清液，用冷PBS洗涤细胞两次。细胞数调整为0.1-1×10⁶细胞。对于每个实验组，将细胞样本分为两个试管，每个试管含有50μL的细胞样本。一个试管用于评估细胞表面抗原，另一个试管用作同型对照。为了评估特异性细胞表面抗原的表达，将细胞与靶抗原的一级抗体在4°C下孵育60分钟。在同型对照组中，用荧光标记的同型对照抗体在相同的培养条件下培养细胞。使用Partec CyFlow Space流式细胞仪（德国Partec GmbH）采集样本，并使用WinMDI 2.9版软件分析数据。

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析

药物治疗三天后，使用Trizol试剂从细胞中提取总RNA。根据第一链cDNA合成试剂盒的说明合成cDNA。对BTG1基因上游引物（5′-CTG CAG ACC TTC AGC CAG AG-3′）和下游引物（5′-GGGG TCA ACC CAG AGT GTG AG-3′）、TAL1基因上游引物（5′-TTC GTG AGC CCC ATC TTC AC-3′）和下游引物（5′-ACA GCC ACA GGC TTA GGA AG-3′）进行PCR扩增，β-actin基因上游引物（5′-CAC ACA GGG GAG GTG ATA GC-3′）和下游引物（5'-GAC CAA AAG CCT TCA TAC ATC TCA-3′）。PCR反应包括10μL PCR Master混合物、1μL上游和下游引物、4μL模板cDNA和6μL ddH₂O，总体积为20μL。PCR反应开始于94°C下初始变性2 min，然后94°C 28个循环30 s，55°C 30 s，70°C延伸步骤2 min。在1.5%琼脂糖中进行凝胶电泳后，用紫外透照法观察到溴化乙锭染色带。

蛋白质印迹

在药物治疗三天后，使用添加了苯甲基磺酰氟（PMSF）的裂解缓冲液从细胞中提取总蛋白。在12000 rpm离心5分钟后，收集上清液，并使用Bradford分析法测量蛋白质浓度。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离等量的蛋白质提取物，转移到PVDF膜上，封闭1h，然后在室温下与一级抗体孵育1h。主要抗体，包括抗BTG1（1:200稀释）、抗TAL1（1:2000稀释）和抗β-肌动蛋白（1:4000稀释）抗体，在Tris缓冲盐水加吐温-20（TBS-T）中稀释。用TBS-T清洗后，用二级抗体培养细胞膜1小时。使用ECL试剂盒（厦门卢龙生物科技有限公司，中国厦门）对免疫带进行可视化。内务蛋白β-肌动蛋白用作内部负荷控制。

本研究得到福建省自然科学基金（No.2014j01395）的资助。