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癌症研究。作者手稿；PMC 2016年2月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
癌症研究，2015年2月1日；75(3): 544–553.
数字对象标识：10.1158/0008-5472.CAN-14-2211
预防性维修识别码：项目经理4316379
NIHMSID公司：NIHMS650553标准
PMID：25644265

人类胰腺癌肿瘤缺乏营养，肿瘤细胞积极清除细胞外蛋白

Jurre J.Kamphorst先生,1,§* 米歇尔·诺法尔,1,* 科西莫公社,2,* 肖恩·哈克特,1 文云路,1 埃尔达·格拉博卡,2 马修·范德·海登,三，4 乔治·米勒,5 杰弗里·德雷宾,6 Dafna Bar-Sagi公司,2 克雷格·汤普森,7和约书亚·D·拉比诺维茨1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

葡萄糖和氨基酸是支持细胞生长的关键营养素。氨基酸是作为单体输入的，但由致癌KRAS诱导的另一种途径涉及通过大胞饮作用摄取细胞外蛋白，并随后作为氨基酸来源对这些蛋白进行溶酶体降解。在这项研究中，我们检测了胰腺导管腺癌（PDAC）的代谢，PDAC是一种由KRAS驱动的、血供不良的致命恶性肿瘤。对人类PDAC和良性邻近组织的代谢组学比较显示，肿瘤组织的葡萄糖、糖酵解高级中间体、磷酸肌酸以及谷氨酰胺和丝氨酸这两种主要代谢底物含量较低。令人惊讶的是，PDAC积累了必需的氨基酸。这种积累可能是由于细胞外蛋白质通过大量胞饮作用降解，以满足谷氨酰胺的需求，而谷氨酰胺又会产生过量的大多数其他氨基酸。与此假设一致，在原发性人类PDAC标本中观察到活跃的大胞饮现象。此外，在存在生理白蛋白的情况下，我们发现培养的小鼠PDAC细胞在缺乏单一必需氨基酸的培养基中无限期生长，并在缺乏游离氨基酸的情况下复制一次。在这些条件下生长的特点是谷氨酰胺消耗和必需氨基酸积累同时进行。总之，我们的研究结果表明，清除细胞外蛋白是PDAC营养吸收的重要方式。

介绍

胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的癌症之一(1). 几乎所有PDAC病例都涉及激活KRAS突变(2). 除了促进生长外，KRAS还诱导代谢变化，包括葡萄糖摄取增加、糖酵解通量增加以及葡萄糖转化为己糖胺和5-磷酸核糖(三). 与其他驱动致癌基因如PI3K相比，PI3K在整个代谢过程中广泛增加葡萄糖流量(4)，致癌RAS通过丙酮酸脱氢酶损害葡萄糖进入TCA循环的流量(5,6). 相反，RAS驱动的细胞严重依赖谷氨酰胺作为TCA碳源，谷氨酰胺通过TCA循环分解代谢，苹果酸酶在胰腺癌细胞中必不可少(7). 因此，与其他癌细胞相比，RAS驱动的癌细胞对葡萄糖的依赖性相对较小(8).

从葡萄糖以外的底物生成大量ATP需要氧气，而由于灌注不良，氧气在肿瘤中的可用性通常受到限制。事实上，PDAC肿瘤以血管化不良和间质压力高为特征，通常是缺氧性的(9,10). 考虑到肿瘤生长的高代谢需求，低灌注可能不仅会限制氧气，而且会限制包括葡萄糖和游离氨基酸在内的营养素。鉴于谷氨酰胺作为可用氮和TCA循环碳的来源具有特殊的重要性，谷氨酰胺可能是肿瘤生长的限制性营养素。与此一致的是，20世纪40年代和50年代对小鼠肿瘤模型的研究发现，肿瘤中的游离谷氨酰胺比相应的正常组织低(11,12).

大胞饮作用是一种通过膜转运蛋白替代传统单体氨基酸吸收的潜在方法，该过程由突变的KRAS激活(13,14). 大胞饮作用涉及大量摄取细胞外成分，包括随后可在溶酶体中消化成游离氨基酸的蛋白质。有趣的是，在细胞培养中，向RAS驱动的细胞喂食白蛋白可以使其在低谷氨酰胺中存活和增殖，而这种存活和增殖依赖于大胞饮作用(14). 据报道，白蛋白在肿瘤中积聚，可能是由于血管渗漏和淋巴缺乏的综合作用(15). 因此，从概念上讲，肿瘤血管的血浆蛋白泄漏可能为癌细胞提供营养来源。然而，这种情况在人类肿瘤中实际发生的程度尚不清楚。也没有证据表明这种清除是否足以提供谷氨酰胺以外的大量氨基酸。

这里我们研究PDAC中的蛋白质清除。对新鲜分离的人类PDAC肿瘤标本进行代谢组学分析（与良性邻近组织相比），发现肿瘤中葡萄糖、糖酵解上层中间产物、谷氨酰胺和丝氨酸含量较低。PDAC肿瘤也积累了主要用于蛋白质合成的氨基酸。虽然单体氨基酸的摄取或合成预计会产生与总需求量平衡的每个氨基酸，但蛋白质分解代谢反而会产生与其在分解蛋白质中丰度成比例的氨基酸。与那些仅用于或主要用于蛋白质合成的氨基酸相比，那些被多种合成代谢过程消耗的氨基酸（如谷氨酰胺）将相应地耗尽。因此，在人类PDAC中观察到的氨基酸消耗和积累模式表明依赖于蛋白质清除。与此一致，我们发现原始人类PDAC标本显示出增强的大胞饮作用。此外，我们发现培养的胰腺癌细胞可以通过蛋白质清除获得足够的氨基酸，以白蛋白作为唯一的氨基酸来源生长，并且这种生长模式与谷氨酰胺消耗和必需氨基酸积累有关。

材料和方法

细胞培养和氨基酸脱落实验

KRPC电池由S.Lowe（MSKCC）提供(16). 在原位注射具有内源性KRAS的小鼠胰腺祖细胞后，从小鼠肿瘤中收获这些细胞G12D系列，它们被额外设计成具有MYC表达和沉默（shRNA-介导）p53。细胞系在含有25 mM葡萄糖和4 mM谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Mediatech）中常规传代，并补充10%（vol/vol）胎牛血清（FBS，HyClone）、25 IU/mL青霉素和25μg/mL链霉素（MP Biomedicals），在80%的汇合处分裂。对于氨基酸脱落实验，通过添加葡萄糖（25 mM）、盐、维生素、酚红和氨基酸，从粉末（Cellgro，目录号10-017-CV）中制备无丙酮酸DMEM，氨基酸除外。对于单氨基酸脱落实验，细胞在10%的汇合处被镀在DMEM中。24小时后，将细胞切换到补充有5%透析FBS（Thermo）的脱落DMEM。该培养基进一步添加0或5%细胞培养级牛血清白蛋白（BSA）（Sigma），该蛋白不含脂肪酸。为了检测无氨基酸DMEM中的生长情况，在添加5%牛血清白蛋白的无亮氨酸DMEM培养基中传代的细胞在20%的汇流处进行培养。24天后，将培养基更换为含有5%BSA的无氨基酸DMEM。根据需要更换培养基。

成像和细胞计数

为了进行成像，将细胞固定在10%TCA中15分钟，并使用由Q-Capture Pro软件（QImaging）操作的尼康Eclipse TE2000-U显微镜获得图像。生长在补充有BSA的无亮氨酸培养基中的KRPC细胞以10%的融合率接种，24小时后切换到新鲜的无亮色培养基中。细胞增殖通过使用计数自动细胞计数器（Invitrogen）测定细胞数量或通过测定细胞总数来评估，使用填充细胞体积管（PCV，Techno Plastic Products）填充细胞体积。

稳定同位素示踪实验

中等，完全13C-和15N标记的葡萄糖和氨基酸，或者等同于DMEM，是从单个成分中重新组合而成的(13C、，15N-DMEM）。该培养基含有未标记的碳酸氢钠和维生素，并补充有5%的透析FBS和1%v/v的青霉素链霉素（MP生物医学）。在该培养基中加倍5次后，以低细胞密度接种细胞并切换到指定的13C、，15N标记介质。24小时后，提取代谢物并通过LC-MS进行分析。KRPC细胞在无氨基酸培养基中的生长取决于在无亮氨酸培养基中预生长。因此，细胞在13C、，15N-DMEM然后切换到无亮氨酸13C、，15N-DMEM公司。在该培养基中重复2-3次后，细胞被切换到（i）完全13C、，15含5%BSA和（ii）无氨基酸的N-DMEM13C、，15含5%BSA的N-DMEM。细胞在完全培养基中培养24小时，然后提取代谢物。在提取代谢物之前，在无氨基酸培养基中培养细胞48小时，24小时后更换培养基。

从培养细胞中提取代谢物

为了分析细胞内氨基酸，抽吸培养基，并用室温PBS冲洗平板三次。终止代谢，并在−80°C 80:20甲醇：水提取溶液中提取代谢产物。在−80°C下15分钟后，刮平平板，并将细胞提取物转移到15 mL锥形管中。将细胞悬浮液旋涡化，在3000 g下离心5 min，保留上清液，并用-80°C 80:20甲醇：水萃取溶液重新萃取细胞碎片。将所得悬浮液离心，并将上清液与第一次提取的上清液结合。将所得溶液在氮气流下干燥，并重悬于HPLC级水中。将20μL加入80μL甲醇中，再加入10μL三乙胺和2μL氯甲酸苄酯，室温孵育30 min，衍生化，从而提高氨基酸的测量灵敏度。

组织收集和代谢物提取程序

接受胰腺肿瘤手术切除的患者同意收集和分析其切除的组织。胰腺部分切除术后，分离出约100 mg肿瘤和邻近组织，并立即在液氮中冷冻，胰腺导管腺癌的诊断经组织学证实。样品在干冰上隔夜运送到普林斯顿大学，并储存在液氮中，直到分析。

对同一患者的肿瘤和良性邻近组织进行平行制备和分析。称量样品，然后在液氮温度下用不锈钢球搅拌粉碎（CryoMill，Retsch，25 Hz，搅拌3分钟）。通过旋涡将粉碎的组织与2 ml−80°C 80:20甲醇：水混合，并拆分为两个1 ml重复样品，将其放置在−80℃下提取5 min。对每个样品进行离心分离，以分离可溶性提取物，用1 mL 80:20甲醇：水在0°C下再提取两次不溶性物质5分钟，然后再次通过离心分离上清液。合并三轮提取的上清液，在氮气下干燥，并在LC-MS级水中重新配制（每25 mg初始组织重量1 mL水）。

液相色谱-质谱（LC-MS）分析

细胞培养和组织样品通过三个独立的LC-MS系统进行分析：（i）Stand-alone orbitrap MS（Exactive，Thermo Scientific，San Jose，CA）以100000分辨率负全扫描模式运行，并与C18超高效反相离子对液相色谱联用(17)，（ii）在与C18高效反相离子对液相色谱法耦合的负多反应监测模式下运行的三重四极杆质谱仪（TSQ Quantum Discovery Max，Thermo Scientific），以及（iii）三重四极杆质谱仪在与HILIC色谱耦合的正多反应监测模式下运行(18). 使用内部软件，通过准确质量（<5 ppm偏差，精确）或特征碎片产品（三重四分之一），结合与验证标准的保留时间匹配来鉴定代谢物(19). 通过对大多数样品进行2倍稀释并观察到峰强度降低2倍，验证了响应的线性。对于组织样本的子集，氨基酸浓度使用13C-标记氨基酸标准。为了量化培养细胞中的氨基酸库大小，代谢物强度通过填充细胞体积（PCV）标准化。使用改进的HILIC方法测量细胞培养亮氨酸(20).

体外大量胞饮试验

从手术切除获得的新鲜PDAC肿瘤组织被切成约3 mm立方形状的薄片。将组织浸入含有1–2 mg/mL TMR-右旋糖酐的无血清DMEM中，并在37°C下培养20–30分钟。组织在PBS中冲洗两次，并立即在OCT化合物中冷冻。如前所述进行组织处理和图像分析(21).

组织代谢组数据的规范化和处理

对离子计数进行标准化，以校正样品间总代谢物丰度的差异，以及整体仪器响应因子中的任何样品间漂移。归一化因子(γ我)对每次LC-MS运行进行计算我.计算γ我，每个已知代谢物峰值P惯性矩LC-MS运行中我被量化，并与峰值的中值进行比较米所有样本，μ米。缩放因子根据方程式1:

γ我=中值的(P（P）米我μ米)
(1)

离子计数进行了相应修正：P（P）米我∗=P（P）米我γ我.

归一化离子计数矩阵为对数2转换并平均重复次数。在多个仪器上测量代谢物时，将结果取平均值。

肿瘤/良性邻近组织代谢物差异的显著性检测

为了确定代谢物子集在癌组织中是否系统地高于或低于良性邻近胰腺组织，使用配对t检验计算p值，其中零分布由bootstrapping生成(22). 该方法被选为一种更保守的替代方法，用于确定t分布的测试显著性，因为参数t分布方法假设对数表晶石丰度均为正态分布。这种假设对许多代谢物无效。

对于给定的代谢物米，测量单位n个患者，肿瘤代谢物丰度（C惯性矩)将同一患者的良性组织代谢产物丰度（B惯性矩). 这些丰度惯性矩，C惯性矩]，共同标准化，因此它们的平均值为0，标准偏差为1。配对之间的系统性差异可以通过配对t检验统计来捕捉(方程2).

t吨米=∑我=1n个(B类米我-C类米我)n个∑我=1n个(B类米我-C类米我)2n个-1n个
(2)

为了生成经验零分布的样本，我们需要生成数据，其中良性和癌症样本之间的系统差异已被删除，然后使用剩余的差异来确定我们多久会看到如此大的系统差异（t米)这是偶然的。为了生成这个空数据，从良性丰度中删除成对差异(等式3a)，修改后的丰度重新居中(等式3b)然后将这些残差校正为通过消除成对差异消除的1自由度(等式3c)，根据Efron和Tibshirani(22).

B类米我∗=B类米我-∑我=1n个(B类米我-C类米我)n个
（3a）
M（M）米=意思是[B类米我∗,C类米我]
（3b）
B类米我第页=(B类米我∗-M（M）米)n个n个-1C类米我第页=(C类米我-M（M）米)n个n个-1
（3c）

对于每个bootstrap样本（使用了500000个样本），随机抽取n名患者（进行替换）和这些患者的成对零数据（取自B类米第页和C类米第页)成形的B类米我b条和C类米我b条.因为B类米第页和C类米第页，这些空值的t统计(等式4)可以用来近似零假设下预期的t-统计量的分布。

t吨米第页b条=∑我=1n个(B类米我b条-C类米我b条)n个∑我=1n个(B类米我b条-C类米我b条)2n个-1n个
(4)

代谢物的p值米可以通过确定t统计量比观察到的统计量（t）更极端的频率来计算米)将在无效假设下预期(等式5).

第页米=1-∑第页对∣t吨米∣>∣t吨米第页b条∣对
(5)

错误发现率（FDR）计算

根据Storey和Tibshirani（2003）的程序对多重假设检验进行修正(23). 简言之，如果良性组织和肿瘤之间没有系统性差异的代谢物（即所有代谢物均为真阴性），那么所有代谢品的p值预期分布在[0,1]上是一致的。如果某些代谢物确实存在系统性差异，则相关的p值直方图将是真正正的p值（向零倾斜）和统一的真负值的混合物。此直方图允许我们估计数据集中真实负片的比例：πo（o）.然后我们可以找到p值截止点，q个，对应于所需的FDR，通过取预期误报数的比率(πo（o）mq（平方米）)小于的p值数量q个p值小于q值的代谢物被视为发现物。

结果

人PDAC肿瘤的代谢组学分析

对49例PDAC肿瘤和良性邻近组织进行手术切除(图1A). 为了尽量减少组织采集过程中的代谢变化，首选的技术是冷冻切片就地使用液氮冷却Wollenberger钳(24,25). 这样的就地冷冻切片可能会损害临床结果，例如，通过阻止正确识别肿瘤边缘。因此，我们取而代之的是切除标本，选择手术方法保持灌注直到切除前。此后，将肿瘤和良性邻近组织样品在液氮中快速淬火并储存在≤−70°C的温度下。在整个样本水平上进行代谢组分析，没有区分上皮和间质肿瘤成分。并行提取成对的样品，并通过三种互补的LC-MS方法进行分析，这些方法能够对大多数样品中的127种水溶性代谢物进行定量(17).

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人PDAC与良性邻近胰腺组织的代谢组学比较

（A） 实验程序示意图：PDAC和良性邻近组织n个=49名患者在胰腺切除术中收集，冷冻于液氮中，研磨，提取，并通过LC-MS进行代谢物分析。（B）肿瘤和配对良性邻近组织之间的代谢物水平存在显著差异（假发现率<0.05）。Y轴是肿瘤与良性邻近组织中代谢物浓度的比值。垂直线代表49名患者的范围、方框四分位范围和水平线中位数。（C） 必需氨基酸积累潜在机制示意图：蛋白质分解代谢产生的氨基酸与蛋白质中的氨基酸比例相同；那些被广泛用于制造新蛋白质以外的目的的蛋白质被消耗殆尽，而其他的则积累起来。

在检测的127种代谢物中，57种在肿瘤和良性邻近组织的配对分析中显示出明显不同的水平(图1B). 肿瘤中消耗最严重的代谢物是谷氨酰胺、胞苷（其氨基来自谷氨酰胺）、胍基乙酸（磷酸肌酸的前体，也下降了）、葡萄糖和几种来自葡萄糖的磷酸化化合物（葡萄糖-6-磷酸、七磷酸七己酮糖和甘油-3-磷酸）。肿瘤中增加最强烈的代谢物是DNA基胸腺嘧啶和几种疏水性必需氨基酸（缬氨酸、异亮氨酸/亮氨酸和色氨酸）。色氨酸降解产物犬尿氨酸，具有免疫抑制活性(26)，在肿瘤中也强烈升高。

在中枢碳代谢中，肿瘤中的葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸都降低，大多数TCA循环化合物也是如此。相反，3-碳糖酵解中间体磷酸二羟基丙酮和3-磷酸甘油酸和乳酸都略有增加。总的来说，这些观察结果与肿瘤中有氧糖酵解倾向增加，但葡萄糖利用率降低相一致。

作为一类，这二十种蛋白原性氨基酸在肿瘤和良性邻近组织之间表现出特别强烈的变化，其中一些氨基酸在肿瘤中强烈增加，另一些则强烈减少。肿瘤中的“非必需”氨基酸有耗尽的倾向，而“必需”氨基酸积累到更高的水平（比较图1B). 然而，这一趋势并不是绝对的。最重要的是，谷氨酰胺是消耗最多的氨基酸（使用13C标记的内部标准，表S1)，谷氨酸（与谷氨酰胺的单胺部分不同）略有增加。这使我们考虑到这样一种假设，即观察到的氨基酸消耗和积累模式可能并不反映氨基酸的重要性，而是反映合成代谢途径中个体氨基酸消耗的速率。具体来说，谷氨酰胺和丝氨酸这两种消耗量最大的氨基酸分别作为胺和单碳供体发挥着关键的合成代谢作用。此外，丝氨酸是脂质头组的关键前体，CDP-胆碱和CDP-乙醇胺在肿瘤中均升高。相反，PDAC中主要用于蛋白质合成的氨基酸水平增加。

肿瘤中氨基酸水平的这种模式与蛋白质分解代谢获得的氨基酸一致，以促进合成代谢(图1C) (14). 虽然摄取或合成单体氨基酸可以产生适当数量的每种氨基酸，但蛋白质分解代谢反而会产生与蛋白质丰度成比例的所有氨基酸。相对于那些单独或主要用于蛋白质合成的氨基酸，那些被多种合成代谢过程消耗的氨基酸（如谷氨酰胺）相应地变得耗尽。

PDAC肿瘤中的大胞饮现象

大胞饮作用介导Ras-driven癌细胞和小鼠肿瘤对细胞外蛋白的内吞(14). 因此，为了检测这种蛋白质内化机制在人类PDAC肿瘤组织中是否有效，将新采集的人类肿瘤标本与高分子量四甲基罗丹明-结合葡聚糖（TMR-dextran）培养，TMR-dex聚糖是一种已建立的大松果体标记物，通过组织切片的荧光显微镜评估TMR-右旋糖酐的细胞内摄取。CK19-阳性肿瘤细胞中检测到TMR-阳性大松果体(图2). 在CK19阴性的肿瘤组织中也检测到TMR-右旋糖酐染色，其定量较低，但仍很明显，可能包括接受EMT的基质细胞和PDAC细胞（因此失去CK19）(图S1). 相反，在正常邻近组织中检测到少量大松果体(图S2). 虽然观察到一些肿瘤内变异性，但在五个分析的PDAC肿瘤样本中，每一个样本都明显存在刺激性大胞饮现象。这些数据表明，大胞饮症是人类胰腺肿瘤的一个特征，胰腺癌细胞有能力从肿瘤细胞外环境中吸收液体及其成分。

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人胰腺癌细胞出现大胞饮现象

（A） 代表性人类胰腺肿瘤组织的苏木精-伊红（H&E）染色。比例尺为100μm。（B和C）安体外用TMR-右旋糖酐作为大松果体（红色）标记物的大松果细胞摄取试验表明，CK19-阳性胰腺癌细胞（绿色）显示出高水平的大松果体。DAPI染色（蓝色）识别细胞核。在CK19染色的基础上描绘（B）中的细胞边界（红色轮廓）。（C）中所示的图像表示（B）中方框区域的放大倍数较高。对于（B）和（C），比例尺分别为20μm和5μm。所示图像为Z轴叠加投影，代表五个独立的肿瘤。

在缺乏游离氨基酸的情况下，白蛋白支持培养的肿瘤细胞生长

先前的研究表明，大胞饮作用使KRAS激活的细胞在补充有白蛋白的低谷氨酰胺介质中增殖(14). 然而，蛋白质清除能在多大程度上提供足够数量的其他氨基酸以支持细胞增殖尚不清楚。为了解决这个问题，我们在缺乏一种或多种必需氨基酸并补充生理水平白蛋白的培养基中培养KRAS驱动的胰腺细胞。含有致癌KRAS的小鼠源性胰腺癌细胞G12D系列和沉默的p53（KRPC细胞）(16)将生长在完全培养基中的培养基切换为无亮氨酸培养基，（i）不添加牛血清白蛋白（BSA）或（ii）添加典型循环浓度的BSA（50 g/L或5%）。正如预期的那样，如果不添加BSA，KRPC细胞就无法在无亮氨酸培养基中存活。相反，当切换到添加BSA的无亮氨酸介质时，亮氨酸去除最初会导致广泛的细胞死亡，但存活细胞会无限增殖（个月），加倍时间约为24小时(图3A-B,第3章). 在该培养基中培养24小时后，这些细胞中的细胞内亮氨酸浓度为约12.5 pmol/uL细胞体积，大约比在完全培养基中生长的相同细胞低100倍，但比在没有亮氨酸和BSA的培养基中的细胞高两倍(图3C). KRPC细胞在缺乏赖氨酸或苯丙氨酸的情况下也能无限增殖(图S4).

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当补充生理水平的血清蛋白时，反式胰腺细胞能够在缺乏必需氨基酸的培养基中生长

（A，B）无亮氨酸培养基中培养的KRPC细胞图像。细胞在50 g/L BSA存在下存活和增殖。（B）细胞计数来自（A）。（C） 用LC-MS测定在富含亮氨酸和无亮氨酸培养基中生长的KRPC细胞中的细胞内亮氨酸浓度。（D，E）在无氨基酸培养基中培养的KRPC细胞以血清蛋白作为其唯一氨基酸来源生长。对于B–D，数据为平均值±SE，n个≥ 3.

KRPC细胞在无亮氨酸培养基中生长的一个简单解释是，血清或其他添加剂中的微量亮氨酸污染足以支持细胞生长。为了排除这种可能性，我们在未添加BSA的无亮氨酸培养基中添加了12μM亮氨酸。LC-MS测量表明，虽然这种添加亮氨酸的培养基比添加了BSA的没有亮氨酸的介质含有更多的游离亮氨酸(图S5)，不支持细胞生长。因此，KRPC细胞在添加白蛋白的无亮氨酸培养基中持续增殖并不是由于亮氨酸污染。

鉴于KRPC细胞可以使用完整的蛋白质作为其亮氨酸、赖氨酸或苯丙氨酸的唯一来源，我们想知道这些细胞是否可以在不含任何游离氨基酸的补充BSA的培养基中增殖。我们将生长在无亮氨酸培养基中的KRPC细胞切换到无氨基酸培养基，（i）不补充BSA或（ii）补充5%BSA。虽然不补充BSA的无氨基酸培养基不支持细胞存活，但切换到补充BSA的无氨基酸培养基的细胞生长到汇合，五天内翻一番(图3D-E). 因此，KRAS驱动的癌细胞在体外比PDAC肿瘤细胞生长更快体内仅通过清除和随后的细胞外蛋白分解代谢。

血清蛋白分解代谢的同位素示踪

Ras-mutant细胞在缺乏必需氨基酸的情况下增殖的能力表明，血清蛋白分解代谢可能对其氨基酸库有很大贡献。为了定量测量这一贡献，我们开发了一种基于同位素示踪的方法，能够分别定量（i）最初作为单体的氨基酸和（ii）通过血清蛋白分解代谢获得的氨基酸。我们制备了生长培养基，其中天然葡萄糖和所有氨基酸被均匀替换13C-和15标准DMEM浓度下的N-标记葡萄糖和氨基酸(13C、，15N-DMEM）。KRPC细胞在该培养基中培养5倍，从而在结果群体中主要标记细胞蛋白。然后，将细胞转移到13C、，15N培养基相当于DMEM，但游离氨基酸的浓度为其DMEM浓度的10%(13C、，15N-DMEM，10%AA）。这些氨基酸浓度更接近于生理条件（例如，人类PDAC谷氨酰胺平均浓度为700μM(表S1)，10%的DMEM谷氨酰胺浓度为400μM）。这种培养基的使用对于检测来自蛋白质分解代谢的未标记氨基酸很重要，否则这些氨基酸的浓度会被整个DMEM中的高氨基酸浓度所淹没。细胞在该培养基中培养24小时，并提取代谢物并进行质谱分析(图4A).

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稳定同位素示踪揭示了蛋白质清除对氨基酸库的重要贡献

（A） 同位素示踪实验示意图，可对血清蛋白衍生的氨基酸和最初作为单体的氨基酸进行单独量化。（B，C）KRPC细胞中细胞外蛋白对细胞内（B）和细胞外（C）氨基酸库的部分贡献。（D，E）Bafilomycin A1是溶酶体酸化抑制剂，以剂量依赖的方式减少细胞内（D）和细胞外（E）血清蛋白衍生氨基酸库。对于B–E，数据为的平均值±SEn个≥ 3.

在未添加白蛋白的细胞中，未标记的细胞内必需氨基酸少于12%，细胞外必需氨基酸少于5%。这些观察到的未标记氨基酸可能主要来源于可用血清蛋白的分解代谢（细胞在5%胎牛血清中培养）。添加白蛋白显著增加了未标记（即血清蛋白衍生）胞内氨基酸的观察水平(图4B). 此外，培养基中还观察到大量未标记的氨基酸，这表明细胞内和细胞外氨基酸库的快速交换(图4C). 在MIA-PaCa-2和E3人胰腺癌细胞中也观察到白蛋白对细胞内氨基酸库的贡献(图S6). 因此，我们能够直接追踪培养的PDAC细胞中蛋白质分解代谢产生的氨基酸。

接下来，我们试图验证这样一个假设，即血清蛋白的分解代谢发生在溶酶体中，方法是用巴非霉素A1处理KRPC细胞，巴非霉素A1通过抑制H型空泡而损害溶酶体功能+-ATP酶(27). 巴非霉素A1处理KRPC细胞导致血清蛋白分解代谢产生的氨基酸的剂量依赖性减少(图4D，E). 大胞饮症典型抑制剂EIPA治疗(14)也导致KRPC细胞中血清蛋白衍生氨基酸的减少(图S7). 综上所述，这些数据表明，即使在没有氨基酸剥夺的情况下，细胞外蛋白的溶酶体降解也会大大增加PDAC氨基酸库。

血清蛋白大胞饮症喂养细胞的氨基酸模式

接下来，我们使用同位素追踪策略来确认在添加了5%BSA的无氨基酸培养基中生长的细胞从未标记的细胞外蛋白中获得了大部分氨基酸。除了由葡萄糖合成的丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸（与胰腺癌微环境相反，葡萄糖在培养基中含量丰富）之外，所有氨基酸大部分都没有标记，即来源于细胞外蛋白(图5A). 此外，这些细胞中的氨基酸氮主要来源于细胞外蛋白(图S8).

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依靠蛋白质清除进行氨基酸同化的细胞严格积累蛋白质生成氨基酸

KRPC细胞在富含氨基酸或无氨基酸的培养基中生长，并补充生理水平的白蛋白。（A） 血清蛋白衍生碳对细胞内氨基酸库的部分贡献。（B，C）相对细胞内氨基酸丰度。（D，E）氨基酸在培养基中的净吸收或排泄。数据为的平均值±SEn个≥ 3.

接下来，我们询问了在补充有生理白蛋白的无氨基酸培养基中生长的细胞和在标准DMEM中生长的电池之间氨基酸浓度的差异。培养24小时后，在补充白蛋白的无氨基酸培养基中生长导致细胞内谷氨酰胺的强烈消耗(图5B). 然而，矛盾的是，我们观察到必需氨基酸的积累水平相当于或在某些情况下高于在富培养基中生长的细胞中的水平(图5C). 此外，大量的游离氨基酸被排泄到培养基中(图5D、E). 由于肿瘤代谢组学分析无法区分癌细胞内和细胞外氨基酸库，我们无法确定是否发生氨基酸排泄体内此外，可能是由于实际肿瘤和该细胞培养模型（例如葡萄糖、游离氨基酸、白蛋白和其他蛋白质）之间的营养物质可用性差异，或肿瘤中基质的大量存在，PDAC肿瘤中的氨基酸浓度变化与在补充白蛋白的无氨基酸培养基中生长的细胞没有直接对应关系。然而，这些数据证实，通过清除细胞外蛋白喂养的生长可导致谷氨酰胺消耗和必需氨基酸积累。

讨论

癌症的定义是细胞不受控制的分裂和生长。为了促进这一点，癌细胞需要营养物质来产生必要的能量和细胞构件。通常认为，癌症主要依赖葡萄糖和谷氨酰胺作为其营养来源。对葡萄糖的依赖性在许多癌症中确实存在，FDG-PET的临床价值可能是最好的证明，它使用葡萄糖类似物对肿瘤进行成像和分期(28). 然而，也有例外，PDAC就是一个显著的例子：不到25%的肿瘤明显呈FDG-PET阳性，高达35%的肿瘤不接受背景以上的FDG(29). 这可能是由于PDAC特有的高间质压和结缔组织增生导致的血液灌注受限所致(30). 尽管游离葡萄糖和谷氨酰胺的可用性有限，但PDAC的攻击性是众所周知的，这表明其他营养素可能在促进PDAC生长方面发挥重要作用。

这些替代营养素是什么？我们最近报道了KRAS转化细胞通过大胞饮作用摄取细胞外蛋白的能力(14)以及利用血脂支持生长(31). PDAC细胞重新利用这些细胞外蛋白和脂类中的氨基酸和脂肪酸来支持生长，就像它们也依赖细胞内物质通过自噬循环以生存代谢应激一样(32,33). 肿瘤血管和淋巴管的渗漏会导致白蛋白和其他血清蛋白在肿瘤间质中积聚。清除蛋白质和脂类减少了对从头开始生物合成，从而需要葡萄糖和游离谷氨酰胺衍生的碳、还原当量（NADH、NADPH）和ATP。

由于一些关键的代谢途径是氧依赖性的（TCA循环、脂肪酸去饱和），绕过它们会促进缺氧条件下的生长。致癌Ras，即使在营养和氧气充足的情况下，也能减少氧气消耗，增加大胞饮作用和脂质清除(5,6,31). 因此，Ras使细胞在包括缺氧在内的代谢恶劣条件下存活和生长。

在此，我们对原发性人类PDAC肿瘤的代谢状态进行了深入分析。PDAC肿瘤组织是异质性的，其特征不仅是肿瘤细胞的存在，还包括癌相关的成纤维细胞、免疫细胞和细胞外基质。我们的分析无法区分这些分区的代谢贡献。相反，它们代表了肿瘤组织作为一个整体的代谢状态。使用这种方法，我们发现相对于良性邻近组织，PDAC肿瘤的葡萄糖和谷氨酰胺含量始终较低。我们进一步发现，如果肿瘤在很大程度上依赖于蛋白质清除，氨基酸水平的模式将与发生的情况相一致(图1C)氨基酸在蛋白质合成以外的其他目的（核苷酸和脂质合成等）的不同利用使得氨基酸主要用于蛋白质合成，而用于其他目的的氨基酸（谷氨酰胺、丝氨酸、丙氨酸）消耗殆尽。

通过在缺乏一种或所有游离必需氨基酸的情况下培养细胞，我们能够证明细胞外蛋白清除能力，以提供氨基酸来支持生长。有趣的是，在缺乏游离亮氨酸、赖氨酸或苯丙氨酸（均含有相对丰富的白蛋白；图S9)，并在缺乏所有游离氨基酸的情况下短暂出现。此外，在缺乏所有氨基酸的情况下，BSA清除足以产生选定必需氨基酸的胞内水平升高。

清除能力的增强使细胞能够获得大量的细胞构建块和能量资源：假设血浆蛋白总浓度为75 g/L，血浆蛋白的氨基酸含量约为游离氨基酸的200倍。因此，虽然灌注不良可能会限制所有营养物质通过肿瘤的流动，但在这种流动限制中，血浆蛋白作为氨基酸来源的相对重要性可能会增加。此外，血浆蛋白也是一种主要的潜在能源，超过了葡萄糖中可用能量的75倍。同样，从各种血脂中清除脂肪酸的能力，而不仅仅是游离脂肪酸，使可用脂肪酸增加至少4倍(31).

虽然由于间质压力高，PDAC的血流量通常较低，但肿瘤血管是渗漏的。结合肿瘤淋巴缺乏的事实，这可能导致血浆蛋白积聚(15). 有鉴于此，最近一种蛋白药物结合蛋白-β-β-γ-β-α-β-δ（nab-β-β-clitaxel，Abraxane）在PDAC中的临床成功尤其诱人(34)，并保证对代谢清除以及如何利用代谢清除进行进一步研究。

补充材料

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2

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致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health Grants）P50GM071508（J.D.R）、1R01CA16359-01A1（J.D.R.）和1R01CA 055360（D.B.S.）以及《勇敢面对癌症》（Stand To Cancer）的支持。J.J.K是癌症研究研究员希望基金（HFCR-11-03-01）。我们感谢纽约大学医学院生物资源中心，该中心得到了劳拉和艾萨克·帕尔穆特癌症中心癌症中心支持拨款P30CA016087的部分支持。它也得到了美国国立卫生研究院转化科学促进中心（NCATS）UL 1 TR000038的部分支持。纽约大学医学院的组织病理学核心得到了美国国立卫生研究院的部分支持（拨款5 P30CA016087-32）。Troma-III是一种识别CK19的抗体，由R.Kemler提供，并由NICHD赞助的发育研究杂交瘤银行提供。我们感谢托马斯·申克（Thomas Shenk）实验室对显微镜技术的支持，感谢伊恩·刘易斯（Ian Lewis）和西蒙·科博尔德（Simon Cobbold）的有益讨论，感谢斯科特·洛（Scott Lowe）善意地提供KRPC细胞。

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