大鼠中耳和内耳中银纳米粒子的显微CT显示及鼓室注射后的转运途径

摘要

介绍

银纳米粒子（Ag-NPs）在抗菌、抗病毒和抗真菌研究中显示出强大的活性，这归因于其抑制生物膜形成、破坏病毒结构和增强先天免疫反应等机制[1-5]. Radzig等人进行的研究支持这样的假设，即Ag-NP通过诱导活性氧物种的产生和氧化应激导致DNA损伤来发挥抗菌作用，这也可能参与抗病毒和抗真菌活性的机制[6]. Ag-NP在高级拉曼光谱的表面增强拉曼散射中也表现出优异的性能，在临床分子成像中具有广泛的应用潜力[7].

Ag-NP有可能通过鼓室给药治疗中耳炎和由此引起的感音神经性聋。慢性中耳炎以反复感染引起疼痛和化脓性耳漏为特征，仍然是一个严重的公共卫生问题，影响着发展中国家和发达国家0.5-30%的特定人口。文献中反复报道了感音神经性耳聋和前庭损伤的并发症[8-12]. 使用钆增强磁共振成像（MRI）在动物模型和梅尼埃病患者中均显示了继发于中耳感染的内淋巴积水[13，14]. 然而，抗生素并不总是有效的，因为出现了多药耐药菌株。最近，世界各地的慢性中耳炎患者中耳出现了生物膜形成的报道[15-18]. 通过一种完全不同的机制，Ag-NPs可以克服任何抗生素的所有缺点，并在耳科治疗中高效地消除微生物。一项关于使用含银纳米粒制剂治疗慢性化脓性中耳炎复发的临床研究鼓励了这种治疗策略。研究表明，Ag-NPs消除了疾病的临床症状和客观症状的阳性动力学，例如减少或终止病理性渗出物，刺激表皮化过程，在6个月的观察期内保持稳定[19]. 为了用复杂的设计说服这一新型治疗方法，中耳和内耳Ag-NPs的分布和途径的详细信息是必要的，但目前缺乏文献。

微型计算机断层扫描（CT）已用于动物中耳和内耳成像，并被认为是追踪内耳药物动力学的有用工具[20，21]. CT切片图像中的灰度与X射线衰减相对应，X射线衰减反映了X射线通过每个体素时散射或吸收的比例，并受成像材料的密度和成分的影响。因此，推测Ag NP会衰减X射线，并在显微CT图像中可见。在目前的工作中，首先进行了一项模型研究，以检查成像系统的剂量响应。接下来，一个体内通过向大鼠中耳腔注射不同浓度的Ag-NP悬浮液，并跟踪中耳和内耳Ag-NP的动力学，直到7天，在大鼠身上进行实验。

结果

Ag-NPs的表征及其与人工外淋巴液的潜在相互作用

本研究中使用的Ag-NP具有高度多面性，平均大小为21 ± 8纳米。粒子在大小和形状上是多分散的，如图所示1。透射电子显微镜（TEM）图像和颗粒的尺寸分布如图所示1a.X射线衍射（XRD）分析证实了颗粒的结晶性质（ICDD:004-0783）。悬浮在去离子水中的颗粒的平均流体动力学尺寸为117 ± 24 nm，zeta电位测量为−20 ± 9毫伏。对粒子进行的电感耦合等离子体测量显示，除银以外，其他物种的含量非常低，其中大部分是阳离子（图2). 由于使用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）将纳米粒子稳定在悬浮液中，因此进行XPS分析以表征纳米粒子的表面。粒子的无散射光谱显示有机碳含量很高，这显然是由于PVP用作封盖剂/表面活性剂。然而，增加溅射时间后，Ag 3d峰开始变得更强，这表明存在一种核-壳结构，其中核是金属银，壳由PVP有机涂层组成。人工外淋巴液孵育4小时对Ag-NP的大小分布没有显著影响（表1).

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图1

使用各种分析技术对PVP涂覆的Ag NP的表征结果。A）NP的透射电子显微镜（TEM）图像显示了PVP涂覆的AgNP在尺寸和形状上的多分散性。B）NP（n）的TEM粒度分布 = 200，平均值 = 21 ± 8纳米），C）Ag-NP的X射线衍射图表明存在金属银（ICDD 004–0783）。D-E）在没有任何溅射的情况下对Ag-NP进行XPS分析，表明存在大量有机杂质（PVP用作表面活性剂）。溅射光谱（E）确认有机成分仅存在于表面。F）使用动态光散射测量悬浮在去离子水中的NP的流体动力学尺寸。

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图2

电感耦合等离子体质谱显示Ag NP中发现的杂质水平。

表1

不同稀释度人工外淋巴液中4h AgNPs的粒径分布

浓度（稀释）	Z轴 意思是 （纳米）
x10个	106.9 ± 0.3
10万	102.9 ± 0.7
X1000个	100.2 ± 1
X10000个	100.7 ± 1.2

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银纳米粒子显微CT成像的灵敏度

微型CT的当前设置显示了37 mM浓度下Ag-NP的检测极限。在37–370.7 mM范围内，信号强度与溶解在H中的Ag-NPs浓度之间具有良好的线性关系₂O（图三). H中产生的Ag-NP信号强度之间存在显著相关性₂O和NaCl溶液，但H₂O提供的信号强度明显高于NaCl，标准值为1.04（p < 0.001，配对样本t检验）。

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图3

微型CT体模显示的信号强度和Ag-NP浓度之间的灵敏度和线性相关性。Ag-NP溶解在H中₂可变浓度（mM）下的O，并使用显微CT成像（A）通过除以空气的信号强度，对每个点的信号强度进行归一化，并估计与Ag-NP浓度的线性相关性（B）.A中的浓度：0 = H（H）₂O；1=，92.7 mM；三 = 185.4.4毫微米；三 = 278.0米；4 = 370.7米。AU：任意单位；五十： 线性；O： 观察到。

AgNPs在中耳和内耳的分布及途径

图中碘对照显微CT显示了大鼠耳蜗的异质性精细结构4优化后的大鼠耳显微CT成像方案分辨率为21.9μm，可利用中耳和内耳检测Ag-NP在两个隔室中的分布。经鼓室注射370.7 mM Ag-NP后4 h，纳米粒子沿中耳粘膜分布，扩散至咽鼓管，多余的Ag-NP流出外耳道。听骨链和镫骨动脉表面有丰富的Ag-NP积聚。Ag-NP显著分布在圆窗膜中，并持续移动到鼓阶间皮和镫上关节环形韧带上，镫下关节是中耳和前庭的交界处（图5). 24小时时，Ag-NP在圆窗膜和卵圆窗中表现出丰富的分布，并且在耳蜗内更为明显（图5). 在一只大鼠经鼓室注射37 mM后4 h，中耳粘膜中检测到Ag-NPs。37 mM注射后第7天，中耳和耳蜗均可见聚集的Ag-NP（图5). 耳朵不同部位的Ag-NPs估计浓度高于应用浓度，支持了Ag-NP在相应区域的聚集或积累（表2). 然而，在给药后4小时、24小时和7天的时间点，以1.85mM经鼓室注射Ag NP没有产生任何Ag NP的信号。在这些时间点，中耳腔没有检测到任何液体，表明没有渗透。

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图4

用碘对照显微CT显示大鼠内耳的异质性精细结构。BM：基底膜；CN：耳蜗神经；RM：Reissner膜；SA：镫骨动脉；SFP：镫骨底板；ST：鼓阶；SV：前庭阶；背心：前厅。比例尺 = 500微米。

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图5

显微CT显示鼓室注射后Ag-NP在耳内的分布。370.7 mM（A-E、G）或37.1 mM（H）的Ag-NP以50μl的体积注入。给药后4小时（370.7mM），AgNPs产生明亮的信号，出现在大泡、鼓膜（TM）、咽鼓管（ET）和包括锤骨（Ma）、砧骨（Inc）和镫骨（Sta）在内的听骨链中（A-C）在镫骨动脉（SA）中发现大量Ag-NP（C）24小时（370.7 mM）时，在耳蜗圆窗膜（RWM）、卵圆窗（OW）和鼓室内侧壁鳞片（STM）中检测到大量AgNPs分布（D、E、G）在第7天（37 mM），观察到中耳浸润（IF）和AgNP聚集（A-AgNPs）（H）。非治疗对照组（NC）耳中未检测到Ag-NP（F）.耳蜗：耳蜗；LPI：砧骨豆状突；SF：镫骨底板；ST：鼓阶。比例尺 = 5毫米（A），2毫米（B、F），1毫米（C-E）。A-F公司，H（H）：4x，像素大小21.8498；G： 10倍，像素大小1.7微米。

表2

μCT测量经鼓室注射AgNPs后AgNPs浓度（mM）在大鼠耳部不同部位的分布

AgNP con交付	时间	我	ME-flu公司	购物中心	股份有限公司	史泰博	史泰博	StapFoot公司	OW公司	风险加权平均法	旋塞阀	欧洲经济共同体
371	5小时	1270		547	677	500	769		1038		639	1177
371	4小时	1084		232	269	408	677		232
371	24小时			816	639	769		639	1177
371	24小时			677	593	723	1084	769	955	1177	593
37	4小时	139
37	1瓦	232	93
37	1瓦	185

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经鼓室注射AgNPs后，大鼠耳蜗不同部位的强度通过μCT成像的耳蜗外淋巴液强度进行标准化。使用y公式估算AgNPs的浓度 = 在体模研究中获得4.88x-4.86，其中“y”是浓度，“x”是归一化强度。AgNP-con：AgNP浓度；Coc：耳蜗；EEC：外耳道；公司：股份公司；ME：中耳mocusa；ME-flu：中耳液；商场：马勒斯；OW：椭圆形窗口；RWM：圆窗膜；镫骨：镫骨；镫骨动脉：镫骨动脉。

讨论

本研究证明，经鼓室注射后，通过显微CT可以在耳朵中看到PVP涂层的Ag-NP，并通过圆形和椭圆形窗口进入内耳。微CT检测到的耳部明亮信号可能是聚集的银纳米粒或接触细胞外液或细胞液形成的银化合物。Ag-NP在外耳道、中耳和内耳中遇到不同的细胞外环境。内耳中丰富的外淋巴液可能与Ag-NP相互作用，并在进入后立即形成化合物。然而，Ag-NP与人工外淋巴液的孵育在25小时内没有改变大小分布，这表明耳朵中的明亮信号代表Ag-NP。据报道，银可以作为双能乳腺X射线成像中的射线造影剂[22]. 然而，显微CT对Ag-NPs的检测灵敏度很低，检测极限为37 mM，这一浓度在大鼠耳中显示出毒性[23]. 这些结果不支持当前形式的Ag-NP将用作CT成像的对比剂。然而，临床可行性需要进一步研究。

核磁共振成像显示，在动物和人类的中耳到内耳的转运过程中，卵形窗通道最近被证明比圆形窗更有效[24，25]. Ag-NP进入内耳的途径清楚地显示为圆形和椭圆形窗口。这表明，除螯合胍外，卵形窗还可能具有广泛的物质运输谱。中耳给药后24小时，浓度为370.7 mM的Ag-NPs在圆窗膜和卵圆窗中积聚，并在鼓膜中富集，表明Ag-NPs~（3+）进入内耳是一个动态过程。耳朵不同部位Ag-NP的定量进一步支持了这一结论（表2). 以37.1 mM的浓度给药后，中耳中检测到明显的Ag-NP信号，这是当前设置的最低检测限，这可能是由于定量结果支持中耳中Ag-NP的积累或聚集所致（表2). 当给药浓度为37 mM的Ag-NPs时，内耳未检测到信号。这可能是由于显微CT可视化的低灵敏度造成的。我们的解释是，由于部分体积效应（体素的灰度值是体素中存在的所有材料的体积分数加权和），内耳组织表面上形成的Ag-NP层太薄，无法提高体素的值。先前的一项研究表明，大鼠在中耳给药37.1mM Ag NPs后出现听力损失，这表明一定量的Ag NPs（低于微型CT的检测阈值）应该已经进入内耳[23].

经鼓室注射后7天，Ag NP在中耳腔中的长期残留支持Ag NP是对抗中耳炎的潜在候选药物。尽管给药37.1 mM Ag-NP后7天内耳未检测到信号，但不排除Ag-NP进入内耳的可能性，因为在此浓度下暴露于Ag-NP的大鼠可检测到听力损失和病理变化[23]. 1.85 mM Ag-NPs既没有生成Ag-NPsmicro CT信号，也没有在中耳腔内浸润。无浸润表明1.85 mM的Ag-NPs对耳朵来说是一个安全的水平，这与我们的观察一致，即在此浓度下的Ag-NP既不会导致听力损失，也不会导致内耳细胞因子上调（未发表的数据）。重要的是，1.85 mM的Ag-NP足以抑制细菌感染期间生物膜的形成，而细菌感染只需要0.1-2 mM的银-NP[26].

此外，额外的Ag-NP通过咽鼓管分泌到鼻咽，并通过鼓膜渗透流至外耳道。咽鼓管功能障碍是中耳炎常见的并发症。Ag-NP在咽鼓管中的分布表明，Ag-NP可能对中耳炎的扩散有直接影响。据报道，树状大分子稳定的银纳米粒子与本研究中使用的银纳米粒大小相似，在X射线计算机断层扫描（CT）成像中有效，在水中、PBS缓冲液、胎牛血清中稳定，并且对pH和温度的变化具有抵抗力[27]. 根据目前的结果，树状大分子稳定的银纳米粒子有可能在未来用作外耳、中耳、内耳和咽鼓管的CT成像对比剂。

结论

显微CT显示中耳和内耳Ag-NPs的分布，并检测到中耳到内耳的梯度浓度。Ag-NP从中耳进入内耳的途径是圆形和椭圆形窗口。这项研究提供了影像学证据，证明中耳给药后Ag-NP能够以剂量依赖性的方式进入耳朵的各个区域，这与未来临床应用中设计给药浓度以避免不利的内耳效应有关。

材料和方法

致谢

缩写

脚注

参与者信息

邹静，电子邮件：if.atu@uoZ.gniJ.

马库斯·汉努拉，电子邮件：如果.tut@alunnah.sukram.

超级米斯拉，电子邮件：ku.ca.mahb@arsim.s.

郝峰，电子邮件：if.atu@gneF.oaH.

罗伯托·河内·拉布拉多，电子邮件：moc.acigolonan@伊纳.

Antti S Aula，电子邮件：如果.tut@alua.ittna.

Jari Hyttinen，电子邮件：如果.tut@nenittyh.iraj.

伊尔马里·皮约克，电子邮件：如果.atu@okkyyP.iramlI.

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