谷氨酰胺氧化在线粒体丙酮酸转运受损期间维持TCA循环和细胞存活

线粒体代谢足以形成不依赖葡萄糖的柠檬酸盐

线粒体和细胞质中都存在一些可能使谷氨酰胺转化为乙酰辅酶A的酶反应。为了测试线粒体是否包含柠檬酸盐形成途径所需的所有反应，从SFxL细胞中纯化线粒体(图2A). 这些制剂与呼吸基质一起使用时消耗氧气(图2B). 与[U一起培养时-¹³C] 谷氨酰胺和未标记的丙酮酸，线粒体迅速形成柠檬酸m+4，表明谷氨酰胺依赖性缺乏(图2C). 用[3替换未标记的丙酮酸-¹³C] 丙酮酸降低柠檬酸盐m+4，增加柠檬酸盐m+5，表明丙酮酸被用作乙酰辅酶a的来源。从培养基中去除丙酮酸将柠檬酸盐从m+4转移到m+6，表明谷氨酰胺衍生乙酰辅酶A的形成(图2C). 残留柠檬酸盐m+4表明存在未标记的乙酰辅酶A；这并不奇怪，因为线粒体中含有质谱检测到的未标记乳酸和苹果酸，并且没有试图抑制脂肪酸氧化。总的来说，数据表明，分离的线粒体足以在丙酮酸存在下使依赖谷氨酰胺的补体产生柠檬酸。在没有丙酮酸的情况下，线粒体包含从谷氨酰胺中产生柠檬酸盐所必需的全部六种碳。

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图2

分离的线粒体将谷氨酰胺转化为柠檬酸

（A） 全细胞裂解物（细胞）的Western blot和SFxL细胞分离线粒体（线粒体）或胞浆的制备。缩写：AIF，凋亡诱导因子；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶；谷氨酸脱氢酶；ACL，ATP柠檬酸裂解酶。

（B） 典型线粒体样品中的耗氧量。显示了添加ADP/GDP前后的利率。

（C） 用[U培养30分钟的线粒体产生柠檬酸的质量同位素-¹³C] 谷氨酰胺和含或不含丙酮酸。

抑制线粒体丙酮酸转运诱导谷氨酰胺依赖性乙酰辅酶A的形成

接下来，我们测试了阻止丙酮酸进入充满葡萄糖细胞中的线粒体是否模拟了葡萄糖提取的效果。α-氰基-β-（1-苯基吲哚-3-基）丙烯酸酯（UK5099）抑制线粒体丙酮酸转运(Halestrap，1976年). UK5099导致[U-¹³C] 葡萄糖(图3A). 柠檬酸m+0持续存在，柠檬酸m+2的时间依赖性积累延迟，与线粒体丙酮酸输入受损一致(图S1A). UK5099还改变了依赖谷氨酰胺的柠檬酸标记，导致[U-¹³C] 谷氨酰胺(图3A). 8小时后，柠檬酸盐m+6的分数含量增加了UK5099(图3B). m+4部分减少，但在几个小时内保持在池的约20%，表明未标记的乙酰辅酶A的贡献(图3B). 虽然UK5099抑制了柠檬酸总丰度，但增加了柠檬酸m+6的绝对丰度(图3C). α-氰基-4-羟基肉桂酸盐（CHC）是一种单羧酸盐转运抑制剂，也抑制线粒体丙酮酸盐转运，对柠檬酸盐标记有类似的作用(图3D和图S1B). 虽然CHC也抑制乳酸分泌，正如其对单羧酸转运体-1（MCT1）的影响所预期的那样，但UK5099没有改变乳酸分泌，表明其在这些剂量下的代谢作用与MPC功能有关(图S1C). 我们还检测了来自同一患者的肺腺癌细胞（HCC4017）和非转化支气管上皮细胞（HBEC30）(Kim等人，2013年). 在转化细胞和非转化细胞中，UK5099提高了[U-¹³C] 谷氨酰胺(图S1D). 该药物对786-O肾癌细胞也有类似的作用，其中冯·希佩尔-林道(甚高频)肿瘤抑制剂导致慢性假缺氧状态，其特征是抑制葡萄糖氧化和增强还原羧基化(Metallo等人，2012年) (图S1E).

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图3

阻断线粒体丙酮酸转运激活谷氨酰胺依赖的柠檬酸盐形成

（A） UK5099对[U柠檬酸盐标记的剂量依赖性影响-¹³C] 葡萄糖和[U-¹³C] SFxL细胞中的谷氨酰胺。

（B） 柠檬酸盐标记的时间进程-¹³C] 含或不含200μM UK5099的谷氨酰胺。

（C） [U培养细胞中总柠檬酸和柠檬酸m+6的丰度-¹³C] 含或不含200μM UK5099的谷氨酰胺。

（D） 在[U中培养6小时的细胞中柠檬酸的质量同位素-¹³C] 含或不含10 mM CHC或200μM UK5099的谷氨酰胺。

（E） [U培养6小时后沉默ME2对柠檬酸m+6的影响-¹³C] 谷氨酰胺。柠檬酸同位素的相对丰度是通过将质谱法测得的柠檬酸总丰度与每个样品的细胞蛋白进行归一化，然后乘以每个同位素的丰度分数来确定的。

（F） 沉默MPC1或MPC2对[U培养6小时后柠檬酸盐m+6形成的影响-¹³C] 谷氨酰胺。

（G） 不同MPC1基因型人原代成纤维细胞在[U培养后的柠檬酸同位素-¹³C] 谷氨酰胺。

数据是三种独立文化的平均值和标准差。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

另请参见图S1.

接下来，我们试图了解TCA循环中间体如何在线粒体中转化为丙酮酸盐，从而使谷氨酰胺依赖性形成乙酰辅酶A。这可能涉及苹果酸酶（将苹果酸脱羧为丙酮酸）或线粒体磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）（将OAA转化为PEP）。后者似乎不太可能发生，因为PEP转化为丙酮酸被认为主要发生在胞浆中。然而，苹果酸酶（ME2或ME3）的线粒体亚型可以产生丙酮酸脱氢酶（PDH）的局部丙酮酸池。据报道，当葡萄糖限制时，ME2向TCA循环提供丙酮酸(Pongratz等人，2007年)，并且沉默ME2改变了肺癌细胞中TCA循环的代谢和生长(Ren等人，2014年). ME3 mRNA和蛋白在SFxL细胞中几乎检测不到。然而，沉默ME2使柠檬酸盐m+6的分数含量从[U-¹³C] UK5099治疗期间的谷氨酰胺，表明ME2参与了谷氨酰胺代谢途径(图3E).

最近报道了人类线粒体丙酮酸载体（MPC）的分子组成(Bricker等人，2012年;Herzig等人，2012年). 该载体由至少两个亚单位MPC1和MPC2组成，这两个亚基都是丙酮酸最大转运所必需的。基因编码的人类MPC1突变brp44升在乳酸酸中毒和神经发育异常患者中发现(Bricker等人，2012年;Brivet等人，2003年). 为了确定该载体的活性是否影响谷氨酰胺代谢，使用siRNA沉默MPC1和MPC2。抑制蛋白还原葡萄糖依赖性柠檬酸盐标记(图S1F)并从[U提高柠檬酸盐m+6-¹³C] 谷氨酰胺(图3F). 我们还测试了纯合子导致的中度或重度MPC1缺乏患者的原代成纤维细胞巴西卢比44LI突变（分别为L79H或R97W）。与健康对照组的成纤维细胞相比，MPC1缺乏患者的细胞显示出较高的柠檬酸m+6丰度分数（[U-¹³C] 谷氨酰胺(图3G).

超极化抑制MPC的动力学分析¹³C类

为了获得UK5099对丙酮酸代谢影响的动态视图，用超极化[1培养细胞-¹³C] 丙酮酸。这使得代谢活动可以通过核磁共振以非常精细的时间分辨率进行监测(Golman等人，2006年). 用二甲基亚砜或UK5099处理细胞，并在超极化核磁共振管中培养[1-¹³C] 丙酮酸。为了最大限度地检测代谢产物，我们使用了一个降低核磁共振系统电子噪声的低温探针。在对照细胞中，两分钟后获得的光谱显示超极化转移¹³C从丙酮酸到乳酸和丙氨酸，这是葡萄糖代谢的两种厌氧产物(图4A). 这些活动需要丙酮酸导入细胞，并分别遇到乳酸脱氢酶（LDH）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）。控制光谱还包含一个来自H的峰值[¹³C] O（运行）_三⁻，反映线粒体中PDH的活性(图4A)(Yang等人，2014年). 这三种产物分别出现在各个光谱中，可以观察到每个信号的时间演变(图4B). 累计¹³从[1导出的C信号-¹³C] 乳酸盐，[1-¹³C] 丙氨酸和H[¹³C] O（运行）_三⁻表示为总数的一小部分¹³随时间变化的C信号(图4C). 用UK5099处理的细胞没有乳酸标记的显著改变，表明UK5099.不能防止超极化[1-¹³C] 丙酮酸进入细胞或用作LDH底物(图4B、C). 然而，两者都[1-¹³C] 丙氨酸和H[¹³C] 哦_三⁻被UK5099几乎完全淘汰(图4B、C). H的消除[¹³C] O（运行）_三⁻这是意料之中的，因为PDH存在于线粒体基质中。另一方面，ALT可以存在于两个隔室中。尽管ALT不需要氧气，但数据表明，大多数ALT活性需要线粒体丙酮酸导入这些细胞。事实上，UK5099抑制了细胞内丙氨酸的丰度和分泌(图4D). 在从细胞内池中分析的其他氨基酸中，天冬氨酸水平提高了大约四倍，其他氨基酸没有改变(图S2).

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图4

阻断线粒体丙酮酸转运代谢效应的动力学分析

（A） 的总和¹³SFxL细胞超极化暴露2分钟后获得的C光谱-¹³C] 丙酮酸。共振为[1-¹³C] 丙酮酸（Pyr1），[1的水合物-¹³C] 丙酮酸（Pyr1-氢化物），[1-¹³C] 乳酸（Lac1），[1-¹³C] 丙氨酸（Ala1）和H[¹³C] O（运行）_三⁻（碳酸氢盐）。

（B） 对照细胞和UK5099处理细胞中Lac1、Ala1和碳酸氢盐出现的时间演变。

（C） 相对¹³Lac1、Ala1和碳酸氢盐的C NMR信号。每个信号在整个采集过程中求和，并表示为总数的一部分¹³C信号。

（D） 对照细胞和UK5099处理细胞中细胞内和分泌丙氨酸的数量。

数据是三种独立文化的平均值和标准差。*，p<0.05；***，p＜0.001。

另请参见图S2.

抑制线粒体丙酮酸输入诱导谷氨酰胺依赖性脂质合成

葡萄糖为脂肪酸合成提供碳。通常情况下，这是通过线粒体丙酮酸的输入，然后PDH依赖性转化为乙酰辅酶A，与OAA缩合生成柠檬酸盐，柠檬酸盐输出到细胞溶质中，然后裂解生成细胞溶质乙酰辅酶A-脂肪酸合成的底物。因此，抑制MPC应减少葡萄糖对脂肪生成的贡献。SFxL细胞在含有[U-¹³C] 葡萄糖和未标记的谷氨酰胺或未标记的葡萄糖和[U-¹³C] 谷氨酰胺。提取脂质并通过GC/MS分析，以确定每种底物对脂肪酸棕榈酸酯的贡献。无论是否存在UK5099，来自这两种营养素的碳都被转移到棕榈酸酯中(图5A). 然而，UK5099改变了葡萄糖和谷氨酰胺的相对贡献。在没有UK5099的情况下，葡萄糖和谷氨酰胺总计占用于生产棕榈酸酯的乙酰辅酶A的90%以上，其中葡萄糖占70%，谷氨酰胺小于30%(图5B). UK5099逆转了这种模式，因此谷氨酰胺衍生碳更加突出(图5B). 为了确定谷氨酰胺衍生脂肪酸的合成是否通过氧化或还原代谢进行，SFxL细胞在[5-¹³C] 谷氨酰胺或[3-¹³C] 谷氨酰胺（含或不含UK5099）和脂质的分析方法如下¹³C NMR以确定¹³脂肪酸中含有C。这种位置特异性定义了标签通过哪些途径到达脂肪酸，[5-¹³C] 谷氨酰胺和[3-¹³C] 谷氨酰胺主要报告还原代谢和氧化代谢。尽管脂肪酸被[5-¹³C] 谷氨酰胺，UK5099治疗后没有增强(图S3). 相比之下，[3中的标签-¹³C] 谷氨酰胺显著增加，表明氧化乙酰辅酶A的形成是UK5099诱导的谷氨酰胺依赖性脂肪酸标记增强的主要原因。

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图5

抑制线粒体丙酮酸转运增强谷氨酰胺对脂肪酸合成的贡献

（A） 从[U培养细胞中提取的棕榈酸酯的质量同位素-¹³C] 葡萄糖或[U-¹³C] 谷氨酰胺，含或不含200μM UK5099。为了简单起见，只显示了均匀标记的同位素（m+2、m+4等）。

（B） 由葡萄糖或谷氨酰胺衍生的产脂乙酰辅酶A的分数，含或不含200μM UK5099。

数据是三种独立培养物的平均值和SD。***，p<0.001。

另请参见图S3.

线粒体丙酮酸输入抑制谷氨酸脱氢酶

考虑到UK5099处理后丙氨酸合成受到抑制，我们测试了阻断线粒体丙酮酸输入是否会影响谷氨酸转化为AKG的方式(图6A). UK5099适度增加谷氨酰胺消耗并抑制谷氨酸分泌，而氨分泌几乎翻了一番(图6B). 因为这些细胞释放的氨90%以上来自谷氨酰胺(DeBerardinis等人，2007年;Yang等人，2009年)这些变化表明GDH活性增强，以氨的形式释放谷氨酰胺的氨基（α）氮，以补充谷氨酰胺酶已经释放的大量氨基（γ）氮(图6A). 在丙氨酸合成减少的情况下，激活GDH将有利于生成AKG。为了测试这种可能性，对照SFxL细胞与[α-¹⁵N] 谷氨酰胺。在这个方案中，[α-¹⁵N] 谷氨酰胺转化为[α-¹⁵N] 谷氨酸，然后是[α-¹⁵N] 谷氨酸通过转氨酶或GDH转化为AKG。标记的铵(¹⁵全日空航空公司₄⁺)GDH的释放可以通过GC/MS间接监测(Brosnan等人，2001年). 基本利率¹⁵全日空航空公司₄⁺产生量低，并且被shRNAs进一步抑制总账1，编码GDH的基因(图6C). The rate of¹⁵全日空航空公司₄⁺释放速度远远超过¹⁵N-丙氨酸释放(图6C). 在UK5099在场的情况下，发布¹⁵N-丙氨酸急剧下降¹⁵全日空航空公司₄⁺释放量几乎增加了两倍，表明线粒体ALT向GDH的代谢转变。这种作用在表达总账1shRNA(图6C). UK5099也增强了¹⁵全日空航空公司₄⁺释放[α-¹⁵N] HBEC30和HCC4017细胞中的谷氨酰胺(图S4A).

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图6

线粒体丙酮酸转运受阻诱导谷氨酸脱氢酶

（A） 谷氨酸转化为AKG的两种途径。蓝色和绿色符号分别是谷氨酰胺的酰胺（γ）和氨基（α）氮素。缩写：GLS，谷氨酰胺酶；ALT/AST、丙氨酸氨基转移酶/天冬氨酸氨基转移酶；谷氨酸脱氢酶。

（B） 谷氨酰胺（Gln）、谷氨酸（Glu）和氨（NH）的利用和分泌₄⁺)采用SFxL细胞，含或不含200μM UK5099。

（C） 分泌¹⁵N-丙氨酸和¹⁵全日空航空公司₄⁺从[α-¹⁵N] 表达对照shRNA（shCtrl）的SFxL细胞中的谷氨酰胺或两种直接对抗shRNA的其中一种总账1（shGLUD1-A和shGLUD1-B）。

（D）左侧，在用200μM UK5099处理期间AMPK（S172）和乙酰辅酶A羧化酶（ACC，S79）的磷酸化。赖特，添加车辆或200μM UK5099后24小时ATP的稳态水平。

（E） 培养在[U-¹³C] 含或不含200μM UK5099的谷氨酰胺。

数据是三种独立文化的平均值和标准差。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

另请参见图S4.

GDH对线粒体能量状态作出反应，因为ATP和GTP抑制GDH，ADP激活GDH(Li等人，2012年;Wanders等人，1983年). 为了测试UK5099是否改变了生物能量学，我们评估了ATP和能量传感器AMP-activated protein kinase（AMPK）的激活。UK5099降低了ATP水平，增强了AMPK及其靶乙酰辅酶a羧化酶-1的磷酸化，这两者都表明能量状态受损(图6D). 与AMPK信号的改变状态一致，UK5099治疗也增强了脂肪酸氧化(图S4B).

我们还测试了GDH是否有助于谷氨酰胺依赖性柠檬酸盐的形成。控制和总账1-沉默的SFxL细胞在含有未标记葡萄糖和[U-¹³C] 谷氨酰胺。如果没有UK5099总账1shRNA影响柠檬酸盐标记(图S4C). 然而，当用UK5099处理时，柠檬酸盐m+6的大量增加被总账1shRNA(图6E)表明GDH参与了癌细胞从谷氨酰胺中产生乙酰辅酶A和柠檬酸盐。

细胞培养、细胞生长和活力

用逆转录病毒载体感染SF188胶质瘤细胞以表达人Bcl-xL（pBabe-Hygro-Bcl-xL），生成SFxL细胞。将SF188、SFxL、Hela、A549、786-O、Huh-7和人成纤维细胞保存在含有10%胎牛血清的DMEM中。HBEC30和HCC4017细胞在ACL4培养基中培养(Kim等人，2013年). 为了监测细胞增殖，将细胞以5000个/孔的速度接种在48周的平板中。第二天，用0.5 ml含有50μM UK5099或DMSO（最终0.1%v/v）的培养基补充细胞。72小时后，向每个孔中添加水（0.25 ml），并在−80°C下冷冻2小时。然后将细胞加热至室温，并在TNE缓冲液中添加0.5 ml 0.1μg/ml Hoechst 33258（2 M NaCl，10 mM Tris-HCl pH 7.4，1 mM EDTA）。使用平板阅读器测量荧光。为了测量细胞的存活率，细胞被台盼蓝染色并用血细胞仪计数。或者，0.5×10⁶用PBS/4%BSA清洗细胞，并用FITC-结合Annexin-V抗体和碘化丙啶（PI）在0.4 ml染色缓冲液（10 mM HEPES，140 mM NaCl，2.5 mM CaCl）中染色₂用流式细胞术检测Annexin-V阳性细胞和PI阳性细胞。

RNA干扰

SFxL衍生子线表达总账1shRNAs在前面有描述(Yang等人，2009年). 短干扰RNA（siRNA）寡核苷酸MPC1,MPC2、，和甲基当量2从Dharmacon Inc.获得非靶向siRNA，在水中重组至20μM，并使用效应基因（Qiagen）转染。72小时后，使用6-cm培养皿中80-90%的融合细胞进行western blot和稳定同位素示踪分析。

代谢分析和稳定同位素示踪

使用电化学分析仪（BioProfile Basic-4分析仪，NOVA）测量葡萄糖、谷氨酰胺和谷氨酸。用酶法（Megazyme）测定氨含量。氨基酸通过HPLC测定（日立L8900）。通过将代谢物丰度的绝对变化归一化为细胞数量和时间来确定消耗/分泌率。TCA循环中间产物的稳定同位素示踪(Cheng等人，2011年)和氨(Yang等人，2009年)如前所述进行。To化验¹³在棕榈酸酯中富集C，细胞在含有[U-¹³C] 葡萄糖或[U-¹³C] 谷氨酰胺48小时，然后在0.4 ml 0.1%triton X-100中溶解。在甲醇：氯仿：水（2:1:1.4，v/v/v）中提取脂质。有机相在42°C下在氮气下蒸发，并在100°C下于2 ml甲醇：甲苯（4:1，v/v）中反酯化，其中含有0.01%的丁基羟基甲苯和15μl乙酰氯，持续1小时。样品冷却，5 ml 6%K₂一氧化碳_三已添加。使用与安捷伦5975质量选择检测器联网的安捷伦6970气相色谱仪分析甲苯相。将从m+0到m+16的每种棕榈酸酯质量同位素转换为总库的百分比。通过回归模型计算脂肪生成乙酰辅酶a的分数富集。使用[U测量脂肪酸氧化-¹⁴C] 棕榈酸酯(Fediuc等人，2006年).

脂质核磁共振

SFxL细胞在150mm培养皿中培养至80%融合。该培养基含有25 mM葡萄糖和4 mM未标记谷氨酰胺[3-¹³C] 谷氨酰胺或[5-¹³C] 谷氨酰胺，含或不含200μM UK5099。24小时后，通过胰蛋白酶法收集每个条件下2个培养皿中的细胞，用PBS洗涤并重新悬浮在1ml 0.1%Triton X-100中。按照说明提取脂质(布莱和戴尔，1959年)在氮气下干燥，在180μl 90/10的CDCl混合物中重新配制_三/中国₂氯₂并装入3mm核磁共振管中。核磁共振在配备10-mm¹H（H）/¹³C双低温探头在15 K下工作。样品温度保持在27°C。这个¹³用双能级宽带质子去耦和NOE增强记录了C谱。获得的碳光谱如下：脉冲翻转角度，60°；重复时间，2s；在36 kHz的频谱宽度上，132768个点的采集时间为1.84 s。总Tr为3.84秒。氯代二氯甲烷_三77ppm的信号被用作化学位移基准。每个实验获得的总扫描数为4096。使用ACD NMR软件（加利福尼亚州多伦多ACD实验室）分析光谱。

ATP分析

电池（5×10⁵)将其接种到6厘米的培养皿中并使其粘附。大约24小时后，用含有DMSO或UK5099（200μM）的2 mL完整DMEM替换培养基。再过24小时，在裂解缓冲液（10 mM Tris pH 7.5，100 mM NaCl，1 mM EDTA，0.01%Triton X-100）中对细胞进行裂解。将该裂解液按1:40稀释，并将25μl等分样品与75μl反应溶液混合，以进行ATP测量（Invitrogen A22066）。

分离线粒体

线粒体的制备基本上如所述(Pongratz等人，2009年)在4°C下，从八个150 mm的培养皿开始，培养皿中含有80–90%的融合SFxL细胞。新鲜线粒体颗粒在0.5 ml分析缓冲液（130 mM KCl、10 mM MOPS、1 mM MnCl）中重新配制₂、2 mM磷酸钾、0.5 mM ADP、0.5 mMGDP、2 mMMgCl₂，4毫米[U-¹³C] 谷氨酰胺和0.2 mM丙酮酸或[3-¹³C] 丙酮酸）。O（运行）₂使用氧气监测仪水套氧电极（Hansatech）测定消耗量。通过培养线粒体进行同位素示踪¹³30°C下含C的介质，在加热块中以500 rpm搅拌。30分钟后，用0.5 ml甲醇终止培养。

蛋白质斑点

蛋白质裂解物在RIPA缓冲液中制备，并使用BCA蛋白质分析（Thermo Scientific）进行定量。蛋白质在4–20%的SDS-PAGE凝胶上分离，转移到PVDF膜上，并用抗GDH（Novus Biologicals）、β-actin、ME2（Sigma）、calnexin（Stressgen）、AIF（Santa Cruz Biotechnology）、GAPDH（Millipore）、ACL、总AMPK、磷酸-AMPK、磷酸-ACC（Cell Signaling）、MPC1（Abcam）和MPC2（Sigma）的抗体进行检测。

超极化¹³C-NMR波谱和数据分析

如前所述(Harrison等人，2012年)，将细胞重悬于含有或不含有UK5099的新鲜培养基中，并保持在37°C。1.4 M[1超极化-¹³C] 如前所述，丙酮酸钠在牛津HyperSense偏振器（英国牛津仪器公司）中进行(Lumata等人，2012年). 使用4mL过热PBS通过自动过程溶解极化样品。溶解后8秒内，在烧杯中收集约4ml超极化液体（pH~7）。使用Bruker CryoProbe（Bruker Biospin，Billerica，MA）在14.1 T下立即进行核磁共振实验。200μl等分的超极化[1-¹³C] 丙酮酸被放置在5毫米核磁共振管的底部。将5000万悬浮SFxL细胞插入磁铁后，使用注射器将其注入核磁共振管，最终浓度为6 mM超极化[1-¹³C] 1 ml丙酮酸。采集排队，并且¹³使用重复时间为2秒的18度检查射频脉冲获得C谱。核磁共振数据使用ACD 1D核磁共振处理器（加拿大多伦多高级化学开发公司）和Igor Pro版本6（Wavemetrics Inc.，OR）进行分析。

我们感谢Aron Jaffe对论文的批判性评价。Kumar Pichmani协助进行了涉及低温探针的超极化实验，Takashi Tsukamoto提供了BPTES。这项工作得到了N.I.H.（CA157996和RR02584）和德克萨斯州癌症预防和研究所（RP140021-P3和RP130272）的支持。C.T.H.得到了N.I.H.培训基金（5T32GM007062-38）的支持，A.T.W.得到了104万安娜基金会和儿童癌症研究基金的支持，M.A.C.得到了米兰翁贝托·维罗内西基金会的支持。