神经和星形胶质细胞功能障碍与胚胎成纤维细胞分化恩杜夫斯4^飞/飞鼠标

细胞培养方法

如前所述，分别从3-5日龄幼鼠和17-18日龄胚胎等皮质中分离出初级等皮质星形胶质细胞和等皮质神经元[25,26]. 简单地说，组织收集在不含镁的HBSS（Hanks缓冲盐水溶液）中²⁺和钙²⁺（Gibco），并在0.6%（w/v）胰蛋白酶和2.78 mM葡萄糖中消化[30分钟，37°C，5%（v/v）CO₂]. 在用含有100单位/ml DNAse I（Invitrogen）的1 mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂（Invit罗gen）中和胰蛋白酶后，细胞被机械分离并在含有mg的HBSS中稀释²⁺和钙²⁺将分离的星形胶质细胞在含有25mM葡萄糖的DMEM（文本中缩写为“葡萄糖”培养基；Thermo-scientific）中稀释，并补充10%（v/v）FCS，并将其置于预涂有50μg/ml poly的烧瓶中D类-赖氨酸。在汇合处，将星形胶质细胞培养物在200 rpm、37°C下摇晃14-16 h，以去除污染细胞类型。分离的神经元在补充了B-27（Invitrogen）的NBM（神经基础培养基；Invitrogen）中稀释，292 mg/lL（左）-谷氨酰胺，并在烧瓶中镀上50μg/ml聚乙烯D类-赖氨酸或预先涂有50μg/ml聚乙烯的盖玻片D类-赖氨酸和10μg/ml层粘连蛋白。通过免疫细胞化学（补充材料和方法部分和补充图S1）评估神经元和星形胶质细胞培养物的纯度。

从受精后12.5-14.5天的胚胎中分离出初级MEF。切除头部和内脏器官后，对组织进行机械破坏，随后用0.125%胰蛋白酶消化（30分钟，37°C，5%CO₂). 然后，将细胞机械分离、造粒，并将其置于涂有0.1%明胶的培养瓶中的葡萄糖培养基中。

细胞保持在37°C和5%CO₂在加湿的房间里。所有细胞隔离缓冲液（HBSS）和培养基均含有60.3 mg/l青霉素和100 mg/l链霉素。线粒体DNA缺陷（ρ°）和对照（ρ⁺)鼠标LM（TK⁻)单元格[27]用50μg/ml尿苷维持在葡萄糖培养基（如上所述）上。如前所述，星形胶质细胞和MEF在含有5 mM半乳糖（文中缩写为“半乳糖”培养基；Gibco）的DMEM中交替培养，补充10%透析的FCS和292 mg/lL（左）-谷氨酰胺。

线粒体分离

如前所述，从原代细胞中分离出线粒体[28].

CI和CS（柠檬酸合酶）活性

如前所述，在30°C条件下，测定原代细胞培养物中CI和CS活性与总蛋白的关系[29]. 简单地说，细胞在缓冲液（200 mM甘露醇、70 mM蔗糖、5 mM HEPES游离酸、1 mM EGTA、pH 7.2）中用Teflon-glass均质器和台式钻机以1000 rpm的速度进行均质。碎片在600时通过低速旋转被清除克对于CI活性测量，样品在含有辅酶Q的缓冲液中稀释₁在鱼藤酮存在或不存在的情况下，NADH、氰化钾和抗霉素A。在分光光度计中测量CI的活性，作为在340nm下3分钟内NADH氧化的鱼藤酮敏感速率。对于CS活性测量，样品在含有5,5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）、草酰乙酸和乙酰辅酶A的缓冲液中稀释。用分光光度计在412 nm处监测3 min以上硫代硝基苯甲酸盐阴离子生成速率。

蛋白质印迹分析

将原代细胞颗粒溶解在含有蛋白酶抑制剂（Roche）的RIPA缓冲液中[50 mM Tris/HCl、150 mM NaCl、1%（v/v）Triton X-100、1%（w/v）Na脱氧胆酸盐、0.1%（w/v）SDS、1 mM EDTA，pH至7.4]，在LDS（十二烷基硫酸锂）样品缓冲液（Invitrogen）中稀释，热变性（10分钟，60°C）并在10%Novex双三凝胶（Invitrogen）上分离。将凝胶转移到0.45μm PVDF膜（Millipore）上进行免疫修饰。用抗NDUFS4（MitoSciences，MS104）或抗SDHA（Molecular Probes，A-11142）探测膜。

BN-页码

将细胞颗粒溶解在1%洋地黄素或1%Triton X-100中，并使用BN-PAGE分离蛋白质复合物[30]. 简单地说，在4–10或4–13%BN-PAGE凝胶（Invitrogen）上，每个通道分离50–80μg全细胞裂解物。将凝胶转移到PVDF膜（Millipore）上进行免疫修饰。用针对CI亚单位NDUFA9的抗体探测膜[31]、CII亚单位SDHA（Invitrogen）或复合III亚单位Core1（Invit罗gen）。

ATP合成分析

如前所述，在原代细胞培养物和分离线粒体的技术副本中测量ATP合成速率[32]. 简言之，10μg细胞或2μg分离的线粒体在含有40–80μg/ml洋地黄素（仅限全细胞）和有/无抑制剂底物的ATP合成缓冲液中稀释10倍[琥珀酸（10 mM）；丙二酸（1 mM），谷氨酸（10 M M）；丙酮酸（10 m2）；苹果酸（10 m3）；鱼藤酮（2.5μM）]并在37°C下培养20分钟。用冰上的高氯酸停止反应，用氢氧化钾和MOPS中和反应。使用基于荧光素酶的分析（Roche，11699695001）在微孔板阅读器（BMG Labtech，FLUOstar OPTIMA）中测定样品中的ATP浓度。速率报告为琥珀酸盐+鱼藤酮测量值的比率。

膜电位测量

细胞培养在96个黑色板（2×10）中⁴原代星形胶质细胞和MEF的细胞/孔，5×10⁴ρ°和ρ的电池/孔⁺LM（油箱⁻)细胞），并用含有75 nM四甲基罗丹明甲酯（TMRM；Sigma）和2μg/ml Hoechst-33258（Sigma₂). 随后，在ΔΨ_米（线粒体膜电位）在至少三个孔中测定为TMRM与Hoechst荧光的比值（BMG Labtech，FLUOstar OPTIMA）。用CI抑制剂鱼藤酮（2.5μM）或原核FCCP（羰基氰化物）处理的细胞第页-三氟甲氧基苯腙）；西格玛；20μM）作为对照。

或者，ΔΨ_米通过显微镜在玻璃底培养皿（WPI，FD-35-100）中培养的细胞中测定。细胞在含镁的HBSS中培养²⁺和钙²⁺含37.5 nM TMRM（30分钟，37°C，5%CO₂). 在37°C的DeltaVision OMX V3成像系统（Applied Precision）上，使用TRITC（四甲基罗丹明β-异硫氰酸盐）过滤器组（带油浸物镜（Olympus，IX71），并配备CoolSNAP HQ）对细胞进行可视化²相机（光度学）。初始成像后，将20μM FCCP或2.5μM鱼藤酮添加到培养皿中，并重新捕获感兴趣的区域。对图像进行去卷积、裁剪和最大强度投影（Applied Precision，SoftWoRx v5.5）。在每盘培养皿中选择超过60个细胞的富含线粒体的核周区域，并在FCCP或鱼藤酮应用前后测定平均TMRM荧光。

超氧化物（O₂^•−)检测

细胞培养在96个黑色板（2×10）中⁴细胞/孔），并用含有10μg/ml DHE（二氢乙硫酸氢钠；Sigma）和2μg/ml Hoechst-33258（40分钟，37°C，5%CO）的培养基培养₂). 细胞在PBS中清洗₂^•−在至少三口井中测定的产量为DHE与Hoechst荧光的比值（BMG Labtech，FLUOstar OPTIMA）。用CI抑制剂鱼藤酮（2.5μM）处理的细胞作为对照。

H（H）₂O（运行）₂侦查

H的比率₂O（运行）₂产量是按照前面描述的进行测量的[33]使用荧光探针Amplex Red在5μg分离的线粒体中添加底物和抑制剂组合，详见正文[琥珀酸（10 mM）；丙二酸（1 mM）、谷氨酸（10 M M）；丙酮酸（10 m2）；苹果酸（10 m3）；鱼藤酮（2.5μM）]。H（H）₂O（运行）₂在20分钟内对产量进行荧光测量（BMG Labtech，FLUOstar OPTIMA）。

细胞死亡分析

如前所述，用50μM H处理细胞₂O（运行）₂在培养基中培养6h。用胰蛋白酶收集细胞，并稀释至2×10⁵annexin-V结合缓冲液中的细胞数/ml（10 mM Hepes，140 mM NaCl，2.5 mM CaCl₂pH至7.4）。将500μl的等分试样与5μl膜联蛋白-V（Invitrogen）和1μg/ml PI（碘化丙啶，Sigma）在室温下共孵育10分钟，然后通过流式细胞仪（Becton Dickinson，LSR II流式细胞仪）和FITC-A和PI-488-695/40-A激光器进行分析。使用正向和侧向散射参数（De Novo，FCS express V4）区分活细胞和死细胞。健康细胞被认为是膜联蛋白V和PI双重阴性，凋亡细胞为膜联蛋白-V阳性，坏死细胞为膜连蛋白-V和PI双重阳性。选通策略如补充图S2（A）和S2（B）所示。

CI在恩杜夫斯4^飞/飞细胞系

接下来我们研究了CI在原代细胞系中的组装状态。与之前的报告一致，我们使用BN-PAGE观察到缺少NDUFS4的CI形成≈830 kDA的残缺组装中间产物（CI），当细胞溶解在Triton X-100中以分离单个OXPHOS复合物时，其数量会减少(图2A： +/+，奇数车道；恩杜夫斯4^飞/飞，甚至车道）[12,15,16,34]. 这与所有原代细胞的培养条件无关(图2A） ●●●●。此外，当恩杜夫斯4^飞/飞细胞颗粒溶解在温和的去污剂洋地黄中，以保持与其他OXPHOS复合物的超分子相互作用(图2B和​和2D：2D： +/+，奇数车道；恩杜夫斯4^飞/飞超复合物以较小的分子量出现，对应于含有受损CI的超复合物。同样，这与所有原代细胞的培养条件无关(图2B和​和22D） ●●●●。

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图2

呼吸道复合物的BN-PAGE分析恩杜夫斯4^飞/飞细胞系

源自+/+和恩杜夫斯4^飞/飞用葡萄糖或半乳糖培养基（原代MEF，原代星形胶质细胞）或NBM（原代神经元）培养的小鼠在含有1%Triton X-100（A和C）或1%洋地黄素的缓冲液中溶解(B类,D类)和由BN-PAGE分离的蛋白质复合物。将凝胶转移到膜上，并用靶向CI亚单位NDUFA9的抗体进行免疫修饰(A类,B类)，或靶向CIII亚基核心1(C类,D类). CII亚单位SDHA用作负荷控制。n个=1–3.为了清晰起见，图像已进行了数字裁剪。CI–IV，复合物I–IV；Ci，在无NDUFS4的情况下形成的残缺Ci。

此外，成熟复合物III（CIII）的水平₂)在所有细胞和所有检测的培养条件下都是相似的(图2C） ●●●●。然而，大量的游离CIII₂超复合体中的非束缚态似乎增加了恩杜夫斯4^飞/飞单元格(图2D） 与含有残缺CI的超复杂物种丰度减少一致。

这些数据表明，CI本身和含有残缺CI的超复合体的组装在所有初级细胞中的洗涤剂溶解细胞颗粒中受到同样的破坏恩杜夫斯4^飞/飞细胞类型和培养条件。因此，这些数据并没有进一步揭示疾病组织特异性本质背后的机制，也没有表明MEF和星形胶质细胞对半乳糖的适应性变化，以应对细胞ATP生成对OXPHOS的更大依赖。

ΔΨ_米选择性受损恩杜夫斯4^{fky/fk（英尺/英尺）年}主要MEF

如上所述，所有患者的CI活性和装配均严重受损恩杜夫斯4^飞/飞研究了原始细胞类型。考虑到CI对IMM质子泵的整体性，可以预计这可能会影响ΔΨ_米此外，半乳糖培养细胞会增加对OXPHOS的依赖性，这可能会进一步影响ΔΨ_米尽管如此，在基础条件下，ΔΨ_米仅在年严重受损恩杜夫斯4^飞/飞主要MEF(图3A和​和3B），三B） 而在星形胶质细胞中表现正常(图3C和​和3D）三D） 和神经元(图3E和​和3F）。三F） ●●●●。更具体地说，ΔΨ_米处于静止状态恩杜夫斯4^飞/飞葡萄糖培养基上的初级MEF去极化（电中性更强；图3A；75%的+/+），并在半乳糖培养基上出现进一步去极化(图3B类；+/+的60%）。作为对照实验，我们发现ΔΨ_米在应用CI抑制剂鱼藤酮或原核细胞FCCP后，在所有培养条件下，所有类型的细胞都同样去极化(图3A–三F） ●●●●。此外，使用不具备功能性OXPHOS系统的小鼠成纤维细胞ρ°细胞验证了方法学方法[27]. 在静止的ρ°单元中，ΔΨ_米当用两个平板阅读器测量时，明显去极化（补充图S3A；ρ的62%⁺)和显微镜（补充图S3B和S3C；ρ的48%⁺)与之前在类似细胞中的观察结果一致[35,36].

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图3

ΔΨ分析_米在里面恩杜夫斯4^飞/飞细胞系

ΔΨ_米通过线粒体中TMRM的积累进行测量，并相对于+/+（白条）和恩杜夫斯4^飞/飞（灰条）小鼠，用葡萄糖维持(A类,C类)或半乳糖(B类,D类)中等。ΔΨ_米如图所示，用CI抑制剂鱼藤酮或原粒FCCP降低，或用CV抑制剂寡霉素调节。ΔΨ_米通过显微镜对初级神经元进行评估(E类)通过测量阳离子染料TMRM在富含线粒体的核周区的积累，用鱼藤酮进行预培养和后培养。使用≥2个细胞培养物分析每个培养皿中超过60个细胞。显示了中初级神经元的代表性图像(F类)与FCCP孵育前和孵育后。误差线=S.E.M。，n个≥3 (A类–D类),P（P）由双尾未配对生成的值t吨测验。CI和CV、复合物I和V；ΔΨ_米线粒体膜电位。

然而，初级MEF和星形胶质细胞对应用CV（复合V）抑制剂寡霉素的反应不同。抑制CV会阻止电子流回线粒体基质，从而导致ΔΨ的超极化（更负电性）_米当OXPHOS正在运行时。在葡萄糖培养基上培养的原代MEF中(图3A） ，寡霉素对ΔΨ无影响_米但它使ΔΨ超极化_米当细胞在半乳糖上培养时(图3B） ●●●●。相反，在原代星形胶质细胞中，ΔΨ_米不考虑培养基，应用寡霉素后去极化(图3C和​和3D）。三D） ●●●●。但这种现象并不是基因型特异性的，可以反映寡霉素对原代星形胶质细胞的毒性。

依赖CI的ATP合成能力在恩杜夫斯4^飞/飞原代星形胶质细胞和神经元，但仅在半乳糖培养的原代MEF中受损

ΔΨ_米用于驱动许多线粒体过程。其中最关键的一个，被认为是线粒体的核心功能，是通过CV合成ATP[37]. 在这种情况下，我们试图确定透性化中CI依赖型ATP合成的最大容量恩杜夫斯4^飞/飞原代细胞在最佳底物条件下。这些测量是在洋地黄素渗透的情况下获得的恩杜夫斯4^飞/飞原代细胞具有CI依赖性底物谷氨酸+苹果酸或丙酮酸+苹果酸酯，有或没有CI抑制剂鱼藤酮。所有比率都是相对于用琥珀酸盐+鱼藤酮测定的CII依赖性比率得出的，因为这些比率不应受到CI缺乏的影响。重要的是，在CII-依赖型ATP合成率的基因型之间没有检测到统计上的显著差异(表1).

在恩杜夫斯4^飞/飞主要MEF，CI依赖的ATP合成速率与葡萄糖培养基上的对照几乎没有区别(图4A和​和4E；4E；82–105%（+/+），但半乳糖降低(图4C；+/+的55–60%）。相反，在恩杜夫斯4^飞/飞谷氨酸+苹果酸降低了原代星形胶质细胞的CI依赖率(图4B中，​B、 4D（四维）4D和​和4F；4F；67–79%（葡萄糖+/+）和77%（半乳糖+/+），但丙酮酸+苹果酸正常，与培养基无关(图4B中，​B、 4D（四维）4D和​和4F）。4F） ●●●●。在恩杜夫斯4^飞/飞所有CI依赖性底物都会降低初级神经元ATP合成速率(图4G；+/+的63–74%）。为了证实底物的特异性，我们确定在存在CI抑制剂鱼藤酮的情况下，ATP合成的CI依赖性速率几乎完全消除恩杜夫斯4^飞/飞所有培养条件下的原代细胞类型(图4A–4G） ●●●●。

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图4

ATP合成速率恩杜夫斯4^飞/飞细胞系，相对于用琥珀酸+鱼藤酮（S+R）测定的CII依赖率表达

在渗透性细胞或从MEF分离的线粒体和葡萄糖维持的星形胶质细胞中测量ATP合成的CII-（S）和CI-依赖性（G+M，P+M）速率(A类,B类,E类,F类)或半乳糖(C类,D类)和神经元维持在NBM培养基上(G公司)来自+/+（白色条）和恩杜夫斯4^飞/飞（灰色条）老鼠。如有指示，添加鱼藤酮以抑制CI。误差条=S.E.M.复制品：S(n个≥3); G+M公司(n个≥3); G+M+R(n个≥2); P+M公司(n个≥3); 和P+M+R(n个≥2).P（P）由双尾未配对生成的值t吨测验。CI，复合物I；G、 谷氨酸；M、 苹果酸；P、 丙酮酸；R、 鱼藤酮；S、 琥珀酸盐。

我们还注意到渗透性初级神经元(图4G） 与渗透性MEF或星形胶质细胞相比，单用琥珀酸盐合成ATP的速率相对于琥珀酸+鱼藤酮的速率更低（<1）(图4A–4D） ●●●●。此外，该相对比率在+/+比恩杜夫斯4^飞/飞神经元(图4G；0.60对0.74）。此外，在+/+MEF和星形胶质细胞分离的线粒体中观察到<1的相对比率，但没有恩杜夫斯4^飞/飞单元格(图4E和​和4F）。4F） ●●●●。这些数据共同表明，RET（反向电子转移）可能发生在所有被检测的原代细胞类型中。术语RET描述了由CII产生的泛喹诺酮将电子提供给反向CI反应而不是正向CIII反应的过程[38]. RET被CI的鱼藤酮抑制所阻断。数据还表明，RET在恩杜夫斯4^飞/飞初级细胞，最突出的是神经元。这可能是因为CI缺陷阻断了CI的正向和反向电子传递。此外，这些观察结果表明，在我们的渗透性细胞中，少量不存在于孤立线粒体中的残余CI依赖性底物可能会人为地增加ATP合成的CII依赖性速率。事实上，虽然在没有提供底物的情况下，ATP合成的一般速率非常低（补充图S4A-S4G），但与分离的线粒体和神经元相比，在透化细胞中观察到的速率略高。作为对照，我们确定所有细胞类型中依赖CII的ATP合成速率对CII抑制剂丙二酸盐敏感（补充图S4A–S4G；相对于琥珀酸+鱼藤酮的速率<1）。

活性氧生成速率在恩杜夫斯4^飞/飞主要MEF

CI功能障碍不仅影响ΔΨ_米以及相关的ATP合成，但也可能与ROS生成增加有关。活性氧如果不被细胞迅速解毒，则有可能对细胞结构造成氧化损伤，包括DNA、蛋白质和脂质[39,40]. 因此，我们试图量化O的数量₂^•−生产单位：恩杜夫斯4^飞/飞原代MEF和星形胶质细胞在葡萄糖或半乳糖培养基上培养，使用O₂^•−特定探针DHE。此外，CI和CII-依赖H₂O（运行）₂使用Amplex Red对MEF分离的线粒体和生长在葡萄糖培养基上的星形胶质细胞的产量进行了测量。由于样品可用性的限制，我们无法进行O的可比测量₂^•−和H₂O（运行）₂生产恩杜夫斯4^飞/飞初级神经元。

与对照细胞相比，恩杜夫斯4^飞/飞主要MEF产生的O量增加₂^•−在葡萄糖培养基上休息(图5A；150%+/+），但不在半乳糖培养基上(图5B） ●●●●。相比之下，O的比率₂^•−静态生产恩杜夫斯4^飞/飞原代星形胶质细胞在任一葡萄糖上培养(图5D） 或半乳糖(图5E） 培养基和对照组无法区分。鱼藤酮治疗刺激O₂^•−在所有细胞类型中，与基因型或培养条件无关(图5A、，​A、 5B、，5B中，​B、 5天5D和​和5E）。5E） ●●●●。然而，鱼藤酮依赖性增加O₂^•−两者的产量均较低恩杜夫斯4^飞/飞主要MEF(图5C） 和星形胶质细胞(图5F） 与+/+相比，不考虑文化媒体。

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图5

O（运行）₂^•−和H₂O（运行）₂生产恩杜夫斯4^飞/飞细胞系

O的速率₂^•−生成量通过DHE的细胞积累进行测量，并与原始MEF和来自+/+（白条）和恩杜夫斯4^飞/飞（灰条）小鼠，用葡萄糖维持(A类,D类)，或半乳糖(B类,E类)中等。O的速率₂^•−如图所示，用CI抑制剂鱼藤酮调节产量。O的比率₂^•−从鱼藤酮处理细胞到非处理细胞（+鱼藤酮/-鱼藤酮）的产量在(C类)和(F类). H的比率₂O（运行）₂用Amplex Red测量葡萄糖生长的初级MEF的分离线粒体和+/+和恩杜夫斯4^飞/飞老鼠(G公司,H（H）)结果显示为琥珀酸盐+鱼藤酮（左年-轴）或谷氨酸+苹果酸（右侧年-轴）。为了保持统计能力，只对基因型之间进行了比较，但将琥珀酸与鱼藤酮或不与鱼藤酮进行比较的组之间除外，因为这种差异特别令人感兴趣(G公司,H（H）). 误差线=S.E.M。，n个≥3,P（P）由双尾未配对生成的值t吨测试。

相反，H的比率₂O（运行）₂其产量相当于分离的线粒体中的对照恩杜夫斯4^飞/飞MEF公司(图5G） 和星形胶质细胞(图5H） 同时含有CI-（谷氨酸+苹果酸）和CII-依赖底物（琥珀酸）。此外，鱼藤酮诱导H₂O（运行）₂与CI相关的产量在+/+和恩杜夫斯4^飞/飞原发性MEF和星形胶质细胞(图5G和​和5H）。5H） ●●●●。但值得注意的是，H的CII依赖性比率₂O（运行）₂MEF和星形胶质细胞线粒体在与CI-抑制剂鱼藤酮孵育时的产量均低于未孵育的情况。此外，尽管不显著，但这一趋势在这两个领域似乎都更加明显恩杜夫斯4^飞/飞MEF和星形胶质细胞与对照组比较。这进一步表明RET在我们的原代细胞中发生，并且该过程在恩杜夫斯4^飞/飞细胞。

我们衷心感谢Tomris Mustafa（Florey神经科学和心理健康研究所）对神经元和星形胶质细胞培养程序的帮助，以及Ian Trounce（澳大利亚眼科研究中心）和Doug Wallace（美国费城儿童医院线粒体和表观基因组医学中心）为ρ°细胞的馈赠。我们还感谢Matthew Burton（澳大利亚默多克儿童研究所）在执行和分析流式细胞术和活细胞成像收集的数据方面提供的帮助。