天门冬氨酸在调节细胞对谷氨酰胺消耗的适应性中起关键作用

基于RNAi的筛选以识别功能丧失导致谷氨酰胺耗竭抵抗的介体

为了确定将谷氨酰胺缺乏信号转导给BAX/BAK和caspase依赖性凋亡的阳性调节物，我们在SF188细胞中对人类可药物基因组文库中的9102个基因进行了基于siRNA的高通量筛选(图2A). 每个基因有4个siRNA双链，每个孔有2个siRNA。为了建立筛选阳性对照，我们耗尽了MYC，这是导致SF188细胞谷氨酰胺成瘾的驱动突变(Wise等人，2008年)，或带有siRNA的BAX(图S1A). 尽管谷氨酰胺停药后MYC-或BAX耗竭对死亡的保护程度相似(图S1B)，MYC的siRNA缺失显著抑制完全培养基中的细胞增殖(图S1C). 屏幕在重复之间具有很高的再现性(图2B). 所有阳性对照siRNA均显示出显著的细胞死亡保护作用，整个文库的平均值等于阴性对照(图S1D). 基于平均z评分和再现性，我们通过对每个基因使用≥3个新siRNAs筛选出119个候选点击。使用大于µ的严格阈值_巴克斯-2σ_巴克斯，柠檬酸合成酶（CS）是所有3个siRNA确认的唯一命中(图2C和第1版E).

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图2

高通量RNAi筛选确定柠檬酸合成酶（CS）siRNA是谷氨酰胺提取诱导凋亡的抑制剂

（A） MYC-扩增SF188人胶质母细胞瘤细胞系筛选策略示意图。每个板的右下角是阳性和阴性对照物的位置。

（B） 重复执行的主屏幕的稳健z分数的散点图。蓝色：不含谷氨酰胺的总库siRNA；绿色：阴性对照siRNA或无无谷氨酰胺的siRNA；黄色：不含谷氨酰胺的针对MYC或BAX的阳性对照siRNA；红色：谷氨酰胺干扰小干扰RNA阳性对照。“−”或“+”Q表示谷氨酰胺状态。虚线：每个数据的实际值与回归值之差的标准偏差（σ）的±2倍。

（C） 第二次筛选119名候选人。有关断点截止的定义，请参见扩展的实验程序。

另请参见图S1.

抑制TCA循环中的糖酵解通量保护谷氨酰胺耗竭诱导的细胞凋亡

柠檬酸合成酶是一种TCA循环酶，催化草酰乙酸（OAA）和乙酰辅酶a形成柠檬酸。免疫荧光染色和亚细胞分馏证实其线粒体定位(图3A). CS的siRNA缺失显著降低蛋白质水平和酶活性(图3B). 在缺乏谷氨酰胺的情况下，CS敲除显著增加了活细胞的百分比和总数(图3C和3D). 与MYC敲除不同，CS的siRNA敲除仅适度抑制完全DMEM中的细胞增殖(图3E). 在缺乏谷氨酰胺的情况下，CS的siRNA减少并不能恢复细胞增殖，这与BAX的siRNA抑制或BCL-X的过度表达类似_L（左）(图S2A和S2B). 为了排除siRNA的离靶效应，我们将小鼠CS基因或载体控制（pCDH）导入SF188细胞。小鼠CS过度表达并不影响细胞在完全DMEM中的生长和存活（数据未显示），但使SF188细胞对谷氨酰胺缺乏敏感，并完全逆转了靶向人类CS的siRNA的保护作用(图3F). CS敲除的作用并非仅限于SF188细胞，因为CS在Kelly和NBLS、两种神经母细胞瘤细胞系和SV40转化的MEF中的RNAi也能保护细胞免受谷氨酰胺缺乏诱导的凋亡(图S2C和S2D). 为了测试草酰乙酸的摄入是否对谷氨酰胺消耗诱导的凋亡至关重要，我们通过siRNA抑制丙酮酸脱氢酶（PDH），从而消耗CS消耗草酰乙酸所需的线粒体乙酰辅酶A。谷氨酰胺停药后PDH现象复制CS抑制细胞凋亡的siRNA(图3G).

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图3

CS功能丧失保护细胞免受谷氨酰胺提取诱导的凋亡

（A） SF188细胞用mitoTracker红（红色）染色，然后固定并用CS抗体（绿色）染色。采用DAPI（蓝色）进行细胞核染色。分离出SF188细胞的胞浆和重膜部分。通过western blotting证实CS的分布，VDAC和α-微管蛋白作为线粒体和细胞溶质标记物。

（B） 对SF188细胞中CS的siRNA抑制48小时会降低蛋白质水平和酶活性。

用对照或CS siRNA转染（C，D）SF188细胞2天，再剥夺谷氨酰胺48小时。通过Annexin V和PI染色测定存活率。在谷氨酰胺耗尽4天后，再添加谷氨酰胺2天后，用结晶紫染色法测量活细胞总数。

（E） 在含有谷氨酰胺的DMEM培养基中用对照、CS或MYC siRNA转染SF188细胞，记录转染后第2天到第5天的细胞数量。

（F） 将含有组成性表达的小鼠CS（mCS）或空载体（pCDH）的SF188细胞转染对照或人CS siRNA 2天，然后剥夺谷氨酰胺48小时。通过膜联蛋白V和PI染色测量存活率，并通过蛋白质印迹测量总CS的表达。p值通过Student的双尾t检验确定。

（G） 用对照或丙酮酸脱氢酶亚单位α（PDHα）siRNA转染SF188细胞2天，然后剥夺谷氨酰胺48小时。通过Annexin V和PI染色测定存活率。

中的数据图3（B、C、E、F和G）表示为平均值+/-S.D.，n=3。另请参见图S2.

CS对草酰乙酸导向天门冬氨酸和天门冬酰胺生物合成的抑制作用

以前，我们和其他人认为谷氨酰胺通过维持α-酮戊二酸（α-KG）的线粒体供应促进细胞存活(Wise等人，2008年;Yueva等人，2007年). CS敲除在谷氨酰胺停药后防止细胞死亡的能力表明，维持TCA循环流量并不是谷氨酰胺代谢抑制凋亡的主要机制。与此一致，谷氨酰胺停药后16小时，NAD/NADH比率和细胞ATP池均未发生改变(图4A和4B). 只有当我们去除SF188细胞中组成性过表达的BCL-X时，才能观察到ATP水平的下降_L（左）谷氨酰胺持续时间更长(图S3A). 作为对照，当葡萄糖缺失时，抗霉素a对呼吸链的抑制或解偶联试剂FCCP对质子梯度的破坏会导致细胞内ATP的快速减少(图S3A). 据报道，谷氨酰胺也是mTOR激活的阳性调节物和自噬的抑制剂(Nicklin等人，2009年). 为了检测CS敲低是否影响mTOR信号传导和/或自噬，我们通过蛋白质印迹评估了mTOR下游信号传导、p70S6K、S6和4EBP1磷酸化和LC3结合。停用谷氨酰胺后，对照组和CS敲除组之间没有差异(图S3B). CS-siRNA处理的细胞自噬也没有明显增加。

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图4

CS敲除将草酰乙酸（OAA）重定向到天冬氨酸和天冬酰胺合成

（A，B）SF188细胞被剥夺谷氨酰胺16小时。测定活细胞中NAD、NADH和ATP的总水平，并将其归一化为细胞数。数据显示为平均值+/-S.D.，n=3。

（C） 用对照或CS siRNA转染SF188细胞2天，然后在含有（+Q）或不含（−Q）谷氨酰胺的DMEM培养基中培养16小时。细胞内柠檬酸盐、α-酮戊二酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、苹果酸盐和天冬氨酸/天冬酰胺通过LC-MS进行定量，并归一化为细胞蛋白质含量。数据表示为平均+/-S.D.，n=3，p值通过Student的双尾t检验确定。

（D） 示意图显示，CS敲除将OAA重定向到天冬氨酸和天冬酰胺生物合成。缩写：Glc，葡萄糖；丙酮酸；Ac-CoA，乙酰-CoA；谷氨酰胺；谷氨酸；Cit，柠檬酸盐；α-KG，α-酮戊二酸；琥珀酸；富马酸；苹果酸；草酰乙酸；天冬氨酸；天冬酰胺。

另请参见图S3.

为了证实谷氨酰胺的去除和CS的敲除对TCA循环中间产物的水平有其预期影响，我们对TCA周期中间产物和天冬氨酸/天冬酰胺这两种可从TCA循环中间体衍生的非必需氨基酸的细胞内化合物进行了液相色谱-质谱（LC-MS）分析，在谷氨酰胺存在或不存在的情况下具有或不具有CS敲低。谷氨酰胺的提取大大耗尽了所有测定的TCA循环中间产物以及天冬氨酸/天冬酰胺水平。在存在谷氨酰胺的情况下，CS敲除显著抑制细胞柠檬酸水平，证实CS是柠檬酸盐池的主要酶(图4C). 相反，两种氨基酸的结合水平从头开始来自草酰乙酸(图4D)当小干扰RNA靶向CS时，天冬氨酸和天冬酰胺显著增加(图4C). 当CS在谷氨酰胺存在下被抑制时，其他TCA循环中间产物没有显著变化。然而，当谷氨酰胺缺乏时，富马酸、苹果酸和天冬氨酸/天冬酰胺的水平部分恢复(图4C). 这在一定程度上反映了柠檬酸合酶对TCA循环中间产物的消耗减少。然而，使用¹³C6-葡萄糖也显示M+3标记的天冬氨酸显著增加（从7.6±13相对单位/标准增加到480±81相对单位/标，p<0.01），表明丙酮酸羧化酶活性也在这些TCA循环中间产物的增加中起作用。早期的TCA循环中间产物可能没有恢复，因为与TCA循环中的后期反应不同，琥珀酸脱氢酶催化的反应是不可逆的。与乙酰辅酶A被草酰乙酸通过CS的催化反应消耗一致，CS的siRNA消耗也增加了乙酰辅酶A的细胞库(图S3C).

上述数据表明，CS基因敲除可能导致OAA从TCA循环转向天冬氨酸和天冬酰胺生物合成。为了证明OAA从TCA循环转移到天冬氨酸生物合成，我们进行了¹³用对照或CS siRNA进行C5-谷氨酰胺追踪实验，以测量天冬氨酸的标记。当CS耗尽时，M+4物种的标记显著增加(图S3D)，证明OAA转向天冬氨酸生物合成。

天门冬氨酸可恢复活力，但不能恢复恢复、其他非必需氨基酸或增殖

为了评估谷氨酰胺缺乏后天冬氨酸和天冬酰胺生物合成增加是否有助于抑制细胞凋亡，我们测试了添加到培养基中的天冬酰胺的效果，发现天冬酰胺阻断了谷氨酰胺提取诱导的细胞凋亡(图5A). 滴定实验表明，天冬酰胺以剂量依赖的方式阻止细胞凋亡，0.2 mM天冬酰胺足以支持长期谷氨酰胺饥饿期间的存活(图5B). 添加天门冬氨酸并不能缓解长期谷氨酰胺饥饿期间ATP水平的下降(图S4A)表明ATP水平下降不是细胞死亡的原因。此外，天冬酰胺对存活的拯救是针对非必需氨基酸谷氨酰胺的消耗。外源性天冬酰胺对必需氨基酸（包括亮氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸）耗竭引起的细胞死亡没有影响(图S4B)或通过葡萄糖消耗或DNA拓扑异构酶抑制(图S4C). 添加天冬酰胺可完全抑制谷氨酰胺分泌细胞的死亡，但不能恢复增殖(图5C). 与CS基因敲除类似，天冬酰胺可以挽救Kelly、NBLS和SV40转化MEF的存活，以应对谷氨酰胺缺乏(图S4D). 为了区分细胞存活拯救是否依赖于天冬酰胺或天冬酰胺的代谢，我们通过气相色谱-质谱（GC-MS）分析测试了外源性天冬酰胺被脱氨基以补充TCA循环的程度。相比之下，α-KG在促进细胞存活方面与天冬酰胺一样有效(图5A)，天冬酰胺替代未能恢复任何TCA循环中间产物(图5D). 为了测试天冬酰胺是否被用于合成其他非必需氨基酸，我们通过LC-MS定量了这些条件下其他非必需氨基酸的水平。在这里，我们只分析了丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）的水平，因为它们不存在于DMEM中，因此必须合成从头开始来自谷氨酰胺（Gln）。与TCA循环中间产物类似，我们既没有观察到丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的任何恢复，也没有观察到天冬酰胺添加对谷氨酰胺本身的任何恢复(图5E和图S4E). 一直以来，用丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸替代并不能抑制细胞凋亡以及天冬酰胺(图5F). 作为阳性对照，我们发现α-KG也可以拯救谷氨酰胺缺乏的细胞(图5A). 与天冬酰胺相比，α-KG还提高了TCA循环中间产物和非必需氨基酸的水平，并恢复了细胞增殖，尽管细胞倍增时间延长了(图5C、5D和5E).

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图5

在缺乏谷氨酰胺的情况下，细胞外天冬酰胺完全恢复活力，但不能恢复TCA循环中间产物、其他非必需氨基酸或增殖

（A） SF188细胞在DMEM中培养48小时，修饰如下：+Gln，−Gln，–Gln+αKG（5 mM）和–Gln+Asn（4 mM）。通过Annexin V和PI染色测定存活率。数据显示为平均值+/-S.D.，n=3。

（B） SF188细胞在不含谷氨酰胺的DMEM中，在不同浓度的天冬酰胺存在下培养4天。通过Annexin V和PI染色测定存活率。数据显示为平均值+/-S.D.，n=3。

（C） SF188细胞在DMEM中以以下修饰生长：+Q，−Q+N（4 mM）和−Q+αKG（5 mM）3天，并记录细胞数量。数据显示为平均+/-S.D.，n=3。p值通过Student的双尾t检验确定。

（D） 在与面板（A）相同的条件下培养SF188细胞16小时。细胞内柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸和富马酸通过GC-MS定量，并归一化为细胞蛋白质含量。数据显示为平均值+S.D.，n=3。

（E） SF188细胞在与面板（A）相同的条件下培养16小时。细胞内丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）和谷氨酰胺（Gln）水平通过LC-MS进行量化，并归一化为细胞总体积。数据显示为平均值+S.D.，n=3。

（F） SF188细胞在不含谷氨酰胺（−Q）的DMEM中培养，分别添加0.2 mM丙氨酸（−Q+A）、谷氨酸（−Q+E）、脯氨酸（−Q+P）、天冬氨酸（−Q+D）或天冬酰胺（−Q++）。在更换培养基后2天，通过Annexin V阳性染色确定凋亡诱导百分率，然后减去凋亡率的基础水平（细胞在含有谷氨酰胺的完整DMEM中生长）。数据显示为平均值+S.D.，n=3。

另请参见图S4.

天冬酰胺合成酶是谷氨酰胺依赖性生存所必需的

上述证据表明，天冬酰胺在抑制细胞凋亡中起着关键作用。通过使用L-天冬酰胺酶作为儿童/青少年造血肿瘤的治疗方法，天冬酰胺对某些肿瘤细胞类型的生存的重要性已经得到证实。造血细胞缺乏从谷氨酰胺合成天冬酰胺的能力，因此依赖外源性天冬酰胺维持其生存能力(Haskell和Canellos，1969年). 相反，实体肿瘤表达天冬酰胺合成酶（ASNS），并从谷氨酰胺合成天冬酰胺。为了解决谷氨酰胺的抗凋亡功能是否取决于天冬酰胺合成酶维持天冬酰胺依赖于谷氨酰胺的生物合成的能力这一问题，我们使用siRNA耗尽天冬酰胺合酶，该酶将谷氨酰胺的γ氨基转移到天冬氨酸，从而生成天冬酰胺。即使在谷氨酰胺存在的情况下，ASNS敲除也会导致严重的细胞凋亡(图6A和6B). 在这些条件下，添加细胞外天冬酰胺可完全恢复细胞存活和增殖(图6B和6C).

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图6

天冬酰胺合成酶（ASNS）的表达是谷氨酰胺依赖性生存所必需的，与人脑胶质瘤预后不良相关

（A） 用靶向ASNS或对照的siRNA转染SF188细胞2天。蛋白印迹证实ASNS的敲除。

（B） 用对照或ASNS siRNA转染SF188细胞48小时，然后在含有或不含有细胞外天冬酰胺（4mM）的谷氨酰胺的DMEM中培养。从转染后第2天到第5天，通过台盼蓝染色测定细胞死亡。数据显示为平均值+/-S.D.，n=3。

（C） 用对照或ASNS siRNA转染SF188细胞，并在与实验组（B）相同的条件下培养。通过台盼蓝排除法记录转染后第2天到第5天的活细胞数。数据显示为平均值+/-S.D.，n=3。

（D） 采用免疫组织化学方法对正常脑组织或胶质瘤患者肿瘤组织进行ASNS染色。显示了每种类型的代表性图像，包括正常大脑、I级（毛细胞性星形细胞瘤，PA）、II级（弥漫性星形细胞细胞瘤，DA）、III级（间变性星形细胞瘤（AA）和IV级（胶质母细胞瘤，GBM）。提供了GBM样品ASNS染色的放大区域，显示染色的细胞质分布。箭头表示肿瘤内的血管组织没有染色。

（E） 基于每个图像像素单位的ASNS染色强度针对每个类别进行量化和总结。数据显示为平均值+S.E.M.、正常大脑（n=3）、PA（n=30）、DA（n=5）、AA（n=10）、GBM（n=31）。关于每一类的定义，请参阅扩展实验程序。所有p值均通过Student的双尾t检验确定。

另请参见图S5.

天冬氨酸合成酶在胶质瘤和神经母细胞瘤中的表达与预后不良的相关性

数据表明，天冬酰胺合成酶（ASNS）可能通过维持细胞活性在肿瘤细胞的积累和进展中发挥重要作用。为了深入了解ASNS的表达是否与实体瘤患者的预后相关，我们对一组原发性人脑胶质瘤和神经母细胞瘤组织进行了ASNS免疫组织化学染色。ASNS在正常脑组织中未表达，在低度毛细胞性星形细胞瘤（I级）和弥漫性星形细胞细胞瘤（II级）中呈边缘表达；然而，在高度间变性星形细胞瘤（III级）和胶质母细胞瘤（IV级）中，ASNS的表达显著增加（IV级和I级之间p<0.001，IV级和II级之间p<0.01，III级和I级别之间p<0.05）(图6D和6E). 同样，ASNS在预后良好的正常肾上腺皮质和神经母细胞瘤患者中表达较低(图S5A和S5B). 在预后不良的神经母细胞瘤中，ASNS表达显著增高（p<0.05）(图S5A和S5B). 此外，神经母细胞瘤中ASNS的表达与分化程度呈负相关（p<0.05），与MYC扩增呈正相关（p<0.05）。(图S5C和S5D).

siRNA转染和Western印迹

有关siRNA的详细信息，请参阅“扩展实验程序”。按照制造商的说明，在Opti-MEM®还原血清培养基（31985070，Life Technologies）中用siRNA与Lipofectamine RNAiMAX（13778075，Life Technologies）混合反向转染SF188细胞。转染后两天，制备蛋白提取物，并在NuPAGE Bis-Tris凝胶（生命科技）上分离等量的总蛋白，转移到硝化纤维素膜上，并与单个初级抗体进行孵育（扩展实验程序）。

细胞凋亡和细胞增殖测定

所有谷氨酰胺饥饿或培养基改变实验均在转染或培养2天后进行。用于凋亡分析，2×10⁵收集活细胞和死细胞，用Annexin V-FITC和碘化丙啶（51-65874X，51-66211E，BD Biosciences）染色，并用FACS Calibur使用FL1和FL3通道进行分析。对于增殖分析，收集附着细胞并使用Multisizer 4颗粒分析仪（Beckman Coulter）进行计数。

我们感谢汤普森实验室的成员，特别是叶江斌，对手稿进行了批判性讨论并提出了建议。我们还感谢MSKCC的流式细胞术和分子细胞学核心设施在流式细胞仪和成像数据方面的帮助。HTS核心设施由威廉·H·古德温先生和爱丽丝·古德温夫人、联邦癌症研究基金会、MSKCC的ETC、莉莲·S·威尔斯基金会以及NIH/NCI癌症中心支持拨款P30 CA008748提供支持。J.Z得到了白血病和淋巴瘤协会的支持。J.F得到了HHMI国际学生研究奖学金的支持。S.V由NIH K08 CA181475支持。这项工作也得到了NIH R01 CA105463、Abramson家庭癌症研究所和纪念斯隆-凯特琳癌症中心的部分资助。