介绍
肝纤维化是胶原蛋白合成和降解不平衡导致胶原蛋白过度沉积的结果。肝损伤后，肝星状细胞（HSC），即肝脏中主要的胶原蛋白合成细胞，被激活并转分化为肌纤维母细胞样细胞，其增殖更快，并表现出更强的趋化性、存活率和胶原蛋白生成1这种转分化是由多种受体的激活触发的，例如PDGFR2，转化生长因子βR三、表皮生长因子受体4、VEGFR5，红外/胰岛素样生长因子1r6，Gi-偶联趋化因子/细胞因子受体（CCR）7和Toll样受体4（TLR4）8，其中两种（TGFβR和PDGFR）已被广泛研究并确定为主要的促纤维化受体2,三无论受体激活的类型如何，PI3K-Akt和SMAD信号级联这两个关键的纤维化前信号9必须加强，以启动和传播HSC活化和胶原合成。一旦激活，PI3K-Akt途径通过3种机制触发纤维化形成——1）通过失活Forkhead box蛋白O1（FoxO1），这是一种抑制HSC转分化和增殖的抗纤维化转录因子10，2）通过抑制凋亡11和3）通过进一步增强TGFβ-SMAD-胶原途径11虽然被广泛认为是一个关键的肝纤维化触发因子，但驱动PI3K-Akt通路无限制增强的精确的多受体介导机制仍然难以捉摸。
Profibrotic途径由环磷酸腺苷（cAMP）拮抗平衡，环磷酸腺苷是G蛋白信号级联的一种众所周知且保守的抗纤维化信号第二信使12已知cAMP在HSC中的积累可抑制趋化性、增殖和胶原合成，同时增加金属蛋白酶对胶原的清除13cAMP通过调节蛋白激酶a（PKA）-cAMP反应元件结合蛋白（CREB）依赖性通路，在转录水平上抑制TGFβ-SMAD信号14虽然cAMP被认为是一种关键的抗纤维化信号，但在肝纤维化过程中多个受体抑制cAMP水平的机制尚不清楚。
我们最近确定，GIV，亦称Gα-相互作用的囊泡相关蛋白是一种多模式信号转导子和三聚体Gi的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF），它调节不同类别受体下游的关键信号事件，例如生长因子受体酪氨酸激酶（RTKs），例如EGFR、IGF1R、VEGFR和InsR15-18和趋化性G蛋白偶联受体（GPCR）样LPAR116,19,20在RTK和GPCR的下游工作，GIV作为一个共同的平台，增强PI3K-Akt信号并减少cAMP的产生，所有这些都是通过激活Gi16GIV在多种生物过程中调节信号传导，包括上皮伤口愈合、巨噬细胞趋化、发育、自噬、血管生成、血管修复和肿瘤转移（参考文献21).
由于GIV调节的信号通路也是纤维化网络的主要组成部分，因此我们在这里研究GIV是否在肝纤维化期间HSC的激活中发挥作用。我们发现GIV通过协调重塑多个受体下游的成纤维信号网络（增强促纤维信号和抑制抗纤维信号）触发HSC激活，所有这些都通过Gαi的激活。由于GIV驱动的基本信号通路在折磨其他器官的纤维原性疾病中很常见，因此获得的见解将影响对各种纤维病相关疾病的理解、方法和范式。
结果
肝纤维化损伤后GIV表达上调
我们之前发现GIV的表达在上皮伤口愈合过程中上调22因为慢性损伤引起的肝纤维化模拟了伤口愈合过程23，我们询问慢性丙型肝炎（肝硬化的主要病因）患者在慢性肝损伤过程中GIV表达水平是否发生改变24我们发现，在正常肝脏中几乎检测不到全长GIV mRNA，但在轻度至中度纤维化的肝脏中增加了约50倍（Ishak评分1-4），在肝硬化的肝脏中提高了约175倍（Ishak评分5,6）()表明GIV mRNA表达随着肝纤维化程度的增加而增加。当我们分析两个公认的慢性肝损伤动物模型的肝脏样本时25即手术性胆管结扎（BDL）和慢性四氯化碳注射（CCl）4)我们发现，在正常小鼠肝脏（假手术组和溶媒对照组）中几乎检测不到GIV mRNA，但在进行性纤维化期间，对这两种类型的损伤作出反应时，其mRNA增加了约15-45倍(). 接下来，我们分析了BDL或CCl的总肝裂解物4-用识别全长GIV（CT-Ab）C末端的抗体进行免疫印迹以检测GIV蛋白表达的治疗小鼠26GIV仅在两种研究模型的损伤后检测到，随着纤维化的进行而增加(，补充图1A)，并且这种表达与PI3K-Akt途径的激活增加相关，如Akt磷酸化所确定的()免疫组织化学（IHC）在BDL或CCl后的小鼠肝脏中也检测到了GIV4-受伤()以及各种慢性损伤所致肝纤维化患者的肝活检(). 损伤肝脏中的染色模式与全长GIV仅在非实质细胞即间质细胞中的限制性表达一致，而占肝脏总细胞质量约85%的肝细胞，无论损伤程度如何，均不表达全长GIV。这些发现表明：1）正常肝脏中几乎没有或几乎没有全长GIV的表达（既非mRNA也非蛋白）；2） GIV在各种慢性损伤后持续诱导表达；3） GIV mRNA的丰度随着纤维化的进行而增加；4） mRNA的增加伴随着GIV蛋白的翻译；GIV蛋白表达增加与受损肝脏中Akt活化增加相关。
慢性纤维源性损伤后肝脏GIV表达增加(A类)采用半定量PCR（顶部）和定量PCR（底部）分析正常人和HCV感染不同程度纤维化患者肝脏中的GIV mRNA水平。显示了半定量PCR的代表性结果和显示GIV mRNA折叠诱导的散点图。水平条=平均值。n=动物数量。
(B、 C类)分析BDL或假手术小鼠肝脏中GIV mRNA的水平(B类)，或慢性注射CCl4或车辆控制(C类)按中的qPCRA类结果显示，与假手术和车辆治疗对照组相比，折叠变化。误差线表示平均值±S.D.n=动物数量。采用双尾Student t检验评估统计显著性。
(D、 E类)BDL或假手术小鼠的总肝裂解物(D类)慢性注射CCl4或车辆控制(E类)通过免疫印迹（IB）分析全长GIV、磷酸化Akt（pAkt）和总Akt。
(F类)BDL或CCl小鼠的FFPE肝切片4通过IHC分析损伤及其各自对照组的全长GIV蛋白（CT-Ab）的表达。顶部面板中的方框区域在底部面板中被放大。放大倍数=10倍。
(克)对来自正常受试者或患有各种慢性肝损伤的患者的FFPE肝切片进行GIV分析，如E类图像代表了每类中分析的4-11个肝脏。顶部面板中的方框区域在底部面板中被放大。放大倍数=10倍。
与慢性损伤不同，当对各种急性肝损伤进行微阵列分析GIV的表达谱时，我们发现GIV表达在某些情况下升高，但并非所有情况下都升高(补充图1B-E). 急性病毒性肝炎患者GIV mRNA表达上调(补充图1B、C)，在一些患者中具有发展为慢性和肝纤维化的潜力，而在急性酒精性肝炎或部分肝切除急性损伤的小鼠模型中没有观察到这种上调(补充图1D、E)这两种疾病可以治愈而不发生纤维化27这些发现表明，GIV的表达是在某些而非所有肝脏损伤中诱导的，GIV表达的持续上调主要局限于肝脏的慢性损伤。
激活的HSC中GIV表达上调
为了确定肝内哪种非实质性细胞类型有助于观察到的GIV增加，我们对BDL治疗组和对照组小鼠进行了肝细胞分馏，并分析了GIV mRNA表达的分离细胞类型。与我们的IHC染色模式一致，我们发现，无论损伤程度如何，肝细胞都没有可检测到的全长GIV转录物(). 在从对照肝脏分离的所有其他细胞中检测到低水平的GIV mRNA，BDL后显著增加。HSCs和Kupffer细胞（KCs；肝脏常驻巨噬细胞），在慢性肝损伤时驱动肝纤维化28，伤后明显增加。我们关注GIV在HSC中表达的作用有两个突出的原因：1）它们在肝纤维化过程中产生约80%的胶原，2）它们是导致肝纤维化的其他细胞（例如KC和窦内皮细胞（EC））产生的细胞因子和生长因子的最终共同靶点28,29当我们定量评估BDL或CCl后分离HSC中GIV mRNA时4我们发现，与我们在整个肝脏中的结果相似，在两种慢性损伤模型的进行性纤维化过程中，全长GIV的表达上调了约2-4倍().
HSC损伤后全长GIV mRNA和蛋白表达增加(A类)通过RT-PCR分析来自接受BDL或假手术的小鼠肝脏的分离细胞组分的GIV和GAPDH mRNA水平。
(B、 C类)从接受BDL或假手术的小鼠肝脏中分离出的原代HSC(B类)或注射CCl4或车辆控制(C类)通过qPCR分析GIV mRNA。结果显示，与假手术和车辆治疗对照组相比，折叠变化。误差线表示平均值±S.D.n=动物数量。采用双尾Student t检验评估统计显著性。
(D类)注射CCl慢性治疗的Col-GFP小鼠半薄肝切片4或载体对照组进行GIV（红色）、胶原蛋白（绿色）、α-SMA（紫色）和DAPI/DNA（蓝色）染色，并用共聚焦显微镜进行分析。箭头=α-SMA pos、Col pos、GIV pos（即HSC）；恒星=α-SMA阴性，GIV阳性，可能是KC和正弦EC。比例尺=10μm。
为了进一步证实GIV蛋白是否在慢性肝损伤后的HSC中表达，我们分析了取自对照组和CCI组肝脏的半薄切片中全长GIV的原位表达4-免疫荧光治疗Col-GFP小鼠。我们使用表达由α1（I）胶原启动子驱动的GFP的Col-GFP转基因小鼠30因为，在这些小鼠中，GFP是整个肝脏提取物和分离的原代HSC中胶原蛋白表达的替代标记物30如预期，GFP（胶原蛋白）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），a真诚地活动HSC标记31仅在受伤后检测到。GIV在对照肝中未检测到，但在活化的HSC中检测到，这是通过与α-SMA共定位测定的(). GIV的表达与α-SMA阳性HSC中胶原（GFP）的表达相关（箭头)表明损伤后GIV蛋白的表达与HSC活化和胶原合成相一致。在α-SMA阴性细胞中也检测到较低水平的GIV，这些细胞可能是内皮细胞或KCs（). 总之，这些结果表明，GIV mRNA在HSC损伤后上调，GIV蛋白在HSC激活后翻译。
在HSC激活期间，GIV的表达先于胶原蛋白的合成
接下来，我们研究了从Col-GFP小鼠分离的HSC中GIV表达、HSC激活（由α-SMA表达确定）和胶原生成之间的时间相关性。在塑料培养皿上激活HSC，并通过胶原蛋白（GFP）合成的丰度监测其形态变化，这些变化是转分化的特征(补充图2). 如预期的那样，在第1天，非活性HSC含有富含视黄酯的脂滴，不表达胶原蛋白，然而，约50%的胶原蛋白阴性细胞已经表达GIV(). 在第3天、第5天和第7天，所有HSC中的GIV和胶原蛋白表达均显著增加。值得注意的是，没有胶原阳性的HSC不表达GIV，这表明GIV的表达总是先于胶原的表达。mRNA水平分析证实GIV的诱导表达先于胶原和α-SMA的表达()HSC激活期间；GIV在第1天胶原表达达到峰值，α-SMA在第3天达到峰值。这些结果表明HSC激活体外GIV的上调可能是HSC激活和胶原合成之前的上游事件。
在培养激活的HSC中，GIV mRNA和蛋白的表达先于激活和胶原的生成(A类)从Col-GFP小鼠肝脏分离的原代HSC在未涂覆的塑料培养皿上培养活化7天。在不同时间点固定细胞，并对GIV（红色）和DAPI/DNA（蓝色）进行染色。GFP信号作为替代标记物检测胶原生成。显示了不同日期的典型图像。比例尺=10μm。
(B-E公司)从Col-GFP小鼠肝脏分离的原代HSC在无涂层塑料皿中培养活化7天。GIV公司(B类)、胶原蛋白(C类)和α-SMA(D类)在不同时间点用qPCR检测mRNA水平。(E类)GIV、胶原蛋白和α-SMA在乳腺癌中的表达模式B-D公司绘制为相互重叠的线图。GIV表达先于α-SMA和胶原的峰值表达。结果显示为与第0天相比每个目标转录本的折叠变化。
激活HSC需要GIV
HSC活化以关键表型为特征，如增殖增强、细胞迁移、肌动蛋白重塑、抗凋亡和胶原生成1接下来，我们询问这些表型中的一些或大多数是否需要GIV，从而激活HSC。首先，我们分析了GIV在培养的人Lx2 HSC细胞系中的表达、定位和特性，该细胞系已被广泛表征并被广泛接受为研究纤维生成途径的模型系统31我们发现Lx2细胞以~250 kDa全长蛋白的形式表达GIV()定位于高尔基体和PM-相关肌动蛋白床(补充图3A)，如前所示19,32。在原代小鼠HSC中也观察到类似的定位(补充图3A). 与对照细胞相比，GIV耗尽的细胞（约85-90%的有效性；)显示肌动蛋白应激纤维较少()，细胞迁移受损(,补充图3B)，并抑制有丝分裂，这由磷甾酮H3的核积累决定(,补充图3C)以及BrDU摄入(,补充图3D). 这些结果表明GIV是HSC细胞迁移、增殖和细胞骨架重塑所必需的。
GIV是HSC肌动蛋白重塑、增殖、迁移、存活和胶原生成所必需的(A类)用对照（Scr）或G cvcIV siRNA处理Lx2细胞，通过免疫印迹（IB）分析裂解产物中的GIV缺失。
(B类)将对照组（Scr）和GIV siRNA处理的Lx2细胞固定并染色，以检测Phalloidin（红色）和DAPI/DNA（蓝色），并通过共焦显微镜观察。比例尺=20μm。
(C类)对照组（Scr）或GIV siRNA处理的Lx2细胞通过伤口区域的连续成像分析其迁移和闭合划痕的能力（参见补充图3B). 结果以伤口闭合百分比表示。
(D、 E类)Lx2细胞，如C类通过免疫荧光和共焦显微镜（参见补充图3C、D). 结果以染色阳性细胞百分比表示。
(F、 G公司)对对照（Scr）或GIV siRNA处理的Lx2细胞进行BAX分析(F类)和Bcl-2(克)qPCR检测mRNA。结果显示为与各自的Scr处理控件相比的折叠变化。
(H、 我)分析对照组（Scr）或GIV siRNA处理的Lx2细胞裂解的Caspase 3(我)免疫荧光和DNA片段TUNEL染色(H（H）). 条形图显示Y轴上Caspase 3（I）裂解或DNA片段（H；TUNEL）的%细胞。
(J型)用对照（Scr）或GIV siRNA处理Lx2细胞，或转染siRNA-resistant GIV-WT或GIV-FA，如图所示，饥饿后用TGF-β1处理。通过qPCR测定胶原α1mRNA，结果显示为与饥饿对照相比的倍数变化（Y轴）。
(K、 L（左）)用表达HA标记的GIV-WT或GIV-FA的腺病毒感染原代小鼠HSC，饥饿，然后用TGF-β1治疗(我)或PDGF-BB(J型). 用qPCR检测胶原α1 mRNA水平。结果显示为与饥饿控件（Y轴）相比的折叠变化(我)用磷酸氢istone H3分析有丝分裂指数(J型)如中所示D类结果显示为细胞核磷酸组蛋白H3阳性细胞的%（Y轴）。误差线表示平均值±S.D.n=3。采用双尾Student t检验评估统计显著性。
因为活化的HSC对凋亡具有抵抗力1我们分析了两个真诚地促（Bax）和抗（Bcl-2）凋亡信号中间产物33在GIV缺失的HSC中，促凋亡Bax上调约2倍()抗凋亡Bcl-2减少约40%()与对照组相比，表明在缺乏GIV细胞的情况下，GIV细胞总体上是促凋亡的。此外，在用胶质毒素治疗的HSC中34作为一种凋亡诱导剂，GIV的表达减少了约50%，同时Bax的预期增加和Bcl-2的减少(补充图3E)表明促凋亡损伤后GIV表达谱的变化反映了抗凋亡基因的变化，即Bcl-2，而不是Bax。为了证实GIV在HSC中的抗凋亡作用，我们进行了TUNEL分析，并分析了Caspase 3的裂解，这是两种广泛用于测量细胞凋亡的方法35我们发现，与对照细胞相比，GIV缺失细胞的Caspase 3活性增加，这是由裂解酶的存在决定的(; ~ 2.5倍）和增加的片段DNA，由TUNEL测定(; ~ 2.5倍）。这些结果表明GIV耗竭可触发细胞凋亡，并且GIV是HSC损伤后生存所必需的。
因为GIV主要通过其GEF特性调节信号转导16我们询问两种关键的HSC表型，即增殖和胶原生成是否需要GIV的GEF功能。为了研究这一点，我们利用了先前验证的GIV结构：野生型GIV（GIV-WT）和GEF-缺陷型F1685A（GIV-FA）突变体16与对照组相比，Lx2 HSC的GIV耗竭抑制了胶原蛋白的生成，以响应转化生长因子-β1（TGF-β1）约40-50%()外源性表达siRNA-resistant GIV-WT而非GIV-FA突变可逆转这种效应。在TGF-β1刺激的原代HSC中也获得了类似的结果，即GIV-FA的表达与GIV-WT相比抑制了约60%的胶原合成(). 最后，关于血小板衍生生长因子（PDGF）的促有丝分裂反应，GIV-FA的表达比GIV-WT抑制了约7倍的有丝分裂()表明GIV的GEF功能是HSC中生长因子刺激胶原合成和增殖所必需的。这些结果共同表明，GIV及其GEF功能是几个关键表型所必需的，这些表型对进行性纤维化期间HSC的转分化和持续激活至关重要。
PDGFRβ在活化的HSC中直接结合并磷酸化GIV
接下来，我们询问哪些受体和配体激活GIV依赖性信号传导以增强HSC激活。首先，我们分析了两种主要促纤维化刺激物PDGF和TGF-β1在Lx2细胞中触发的信号事件2,三我们发现PDGF而非TGFβ-1在Tyr（Y）1764触发GIV磷酸化，Tyr是RTK的底物位点17和Ser（S）1416，Akt的基底位置32，是RTK-GIV-PI3K-Akt信号通路激活的替代标记17(). 然而，这两种生长因子都触发了Akt、SMAD和ERK蛋白的磷酸化(). 与这种激活一致，GIV与配体激活的PDGFRβ共免疫沉淀()以及Gαi和PI3K。在下拉分析中使用重组蛋白，我们证实了自身磷酸化PDGFRβ与GIV C末端之间的相互作用是直接的()发现重组PDGFRβ磷酸化酪氨酸1764和1798上的GIV在体外(); 其他RTK靶向的相同残基17我们发现在培养激活的原代HSC（箭头，)以及PDGF刺激的Lx2细胞（箭头，). 这些结果表明，在PDGF刺激下，GIV和Gαi可能在PM与活化的PDGFRβ相互作用。随后PDGFR对GIV的磷酸化触发了先前定义的RTK（活性）-pTyrGIV-Gi-PI3K通路17相反，在相同条件下，在与TGFβR的复合物中既不能检测到GIV，也不能检测到Gαi，这表明Ser/Thr TGFβR激酶可能不能通过GIV结合或直接转导信号。
PDGFRβ在肝损伤过程中直接结合并磷酸化HSC中的GIV(A、 B类)PDGF-BB刺激Lx2细胞的全细胞裂解物(A类)或使用TGF-β1(B类)通过免疫印迹（IB）分析各种信号通路。
(C类)用抗PDGFR或对照IgG对血清饥饿或PDGF-BB处理的Lx2细胞的裂解物（右侧）进行免疫沉淀。通过免疫印迹（IB）分析结合的免疫复合物（左）的GIV、总（t）和活化的（pY716）PDGFR、p85α（PI3K）和Gαi3。M=饥饿和刺激Lx2裂解物的混合物。
(D类)GST-PDGFR在体外自磷酸化，并用于纯化的His-GIV CT或His-PCT（Podocalyxin Tail；阴性对照）的下拉分析。用磷酸化-Tyr（pTyr）抗体通过免疫印迹（IB）观察结合受体。Ponceau S染色证实了等量的His标记配体。
(E类)利用重组PDGFR对野生型（WT）和His-GIV CT的磷酸化突变体进行体外激酶检测。通过免疫印迹（IB）分析pTyr和His-GIV-CT的反应。合并面板中的黄色像素（pTyr和His）显示磷酸化GIV-CT。
(F类)固定Col-GFP小鼠培养激活的原代HSC，并对其进行活性pY1764GIV（红色）和活性pY716PDGFR（青色）染色。“合并”面板显示PM处红色和青色像素的同位化（箭头）。箭头=质膜。比例尺=25μm。
(克)用PDGF-BB刺激Lx2细胞，固定并染色pY1764GIV（红色）、活性pY716PDGFR（绿色）和DAPI/DNA（蓝色）。“合并”面板显示黄色像素，表示PM的同位化（箭头）。箭头=质膜。比例尺=10μm。
(H（H）)固定培养活化的原代HSC，并对其进行活性pY1764GIV（红色）和DAPI/DNA（蓝色）染色。通过GFP信号检测胶原的产生。比例尺=10μm。F类,克和H（H）共聚焦显微镜分析。
(我)左：BDL或CCl小鼠肝脏切片4通过IHC分析损伤后的pY1764GIV活性。左侧面板上的方框区域在右侧放大。右：两种实验模型的相应对照组均未观察到染色。放大倍数=10倍。
接下来，我们研究了激活RTK（活性）-pTyrGIV-PI3K途径（使用磷酸化Tyr 1764 GIV作为替代标记物）和培养激活的原代HSC中的胶原合成。第1天，当胶原蛋白仍然无法检测到时，约50%的HSC中检测到pY1764-GIV(，补充图4). 第3天，约15-20%的HSC表达胶原蛋白，而100%表达pY1764-GIV(补充图4). 因此，我们之前观察到在HSC激活期间GIV的早期表达()还伴随着激活PDGFR-GIV-PI3K型在HSC激活期间，两者都是胶原合成之前的上游事件。我们确认该途径被激活体内在肝纤维化期间，因为pY1764-GIV仅在来自BDL或CCl的肝脏中检测到4-IHC治疗的小鼠和非对照肝脏(). 这些结果表明，在配体刺激下，GIV直接与自身磷酸化的PDGFRβ结合，这允许：a）GIV将G蛋白激活与RTK信号联系起来，以及b）PDGFR？磷酸化GIV；通过GIV协同增强Akt信号的两个事件17.
GIV增强多个受体下游的促纤维化PI3K-Akt和SMAD信号
因为PI3K-Akt和TGFβ-SMAD通路是驱动肝纤维化的主要纤维化前信号36我们询问了GIV，更具体地说，它的GEF功能或酪氨酸磷酸化是否调节HSC中的这些信号。为了研究这一点，我们利用了两种先前验证过的GIV结构：非磷酸化Y1764/1798F突变体（GIV-YF）和GIV-FA/YF，其中GEF和酪氨酸均发生突变。我们发现GIV-WT的外源表达，而不是Lx2细胞中的突变体增强了Akt和SMAD 2/3蛋白的磷酸化()表明GIV的GEF功能和酪氨酸磷酸化都是必需的。Lx2细胞内源性GIV耗竭抑制Akt磷酸化(); 外源性表达抗siRNA的GIV-WT而非GIV-FA可逆转这种效应()表明GIV的GEF功能是HSC中Akt磷酸化最大增强所必需的。GIV的GEF功能也需要用于增强Akt磷酸化，以响应各种配体[血清、PDGF-BB、TGF-β1、RANTES，其激活G蛋白偶联趋化因子受体（CCR），以及脂多糖（LPS），其激活Toll样受体、TLR4]针对不同类别的纤维原性受体()表明GIV通过其GEF功能增强了多个受体下游的促纤维化PI3K-Akt途径。FoxO1是Akt的主要下游靶点，其失活和核排斥在肝纤维化期间触发HSC转分化10约92%表达GIV-WT的细胞被排除在细胞核之外(). 相反，在表达GIV-FA的细胞中，约50%的细胞在细胞核中看到FoxO1，这表明GIV的GEF功能是FoxO1的核排斥和失活所必需的。此外，与表达GIV-WT的细胞相比，那些表达GIV-FA的细胞显示更少的应力纤维(补充图5)，总的促凋亡表型[低Bcl-2()和更高BAX()，Caspase 3活性较高()TUNEL分析了更多的片段DNA()]，降低SMAD 2/3活化，基于其磷酸化降低()以及减少核定位(). 综上所述，这些结果表明，GIV的GEF功能对于HSC活化的关键促纤维生成表型至关重要：肌动蛋白细胞骨架重塑、HSC存活、增强PI3K-Akt-FoxO1和TGFβ-SMAD途径。
GIV的GEF功能增强HSC中促纤维化Akt和SMAD信号(A类)通过免疫印迹（IB）分析表达GIV突变体的Lx2细胞的全细胞裂解物的各种信号通路。
(B-D公司)用对照（Scr）或GIV siRNA处理的Lx2细胞转染抗siRNA的GIV-WT或指示的突变体，饥饿（0%FBS），然后在裂解前用血清或各种配体刺激。通过免疫印迹（IB）分析等等分的裂解物中的GIV、磷酸化Akt和总Akt。
(E-F公司)将感染GIV-WT-HA或GIV-FA-HA腺病毒的Lx2细胞保存在0.2%的FBS中，固定并染色HA（GIV，绿色）、FoxO1（红色）和DAPI/DNA（蓝色），并用共焦显微镜进行分析。恒星=核FoxO1。比例尺=10μm。结果显示具有核FoxO1（Y轴）的%细胞(F类).
(G、 H（H）)去除内源性GIV的Lx2细胞随后被转染各种GIV构建物，并对这些细胞提取的RNA进行Bcl-2分析(克)和BAX(H（H）)通过qPCR检测mRNA水平。
(一、 J型)Lx2细胞感染GIV-WT-HA或GIV-FA-HA腺病毒，保存在0%的FBS中，固定并分析裂解的Caspase 3(J型)通过免疫荧光和通过TUNEL染色检测片段DNA(我). 条形图显示Y轴上Caspase 3（J）裂解或DNA片段（I；TUNEL）的%细胞。
(K（K）)去除内源性GIV的Lx2细胞随后转染siRNA-resistant GIV-WT或GIV-FA，用TGFβ和磷酸化SMAD刺激，并用免疫印迹（IB）分析总（t）SMAD 2/3。根据带密度测定法，表达GIV-WT的细胞中pSMAD/tSMAD的比率比表达GIV-FA的细胞高约2.0倍。
(五十、 M（M）)将感染GIV-WT-HA或GIV-FA-HA腺病毒的Lx2细胞保存在0.2%的FBS中，固定并染色HA（GIV，绿色）、SMAD2/3（红色）和DAPI/DNA（蓝色），并用共聚焦显微镜进行分析。星形=核SMAD2/3。比例尺=10μm。(M（M）)条形图显示核tSMAD2/3英寸的%细胞K（K）误差线表示平均值±S.D.n=3。采用双尾Student t检验评估统计显著性。
GIV抑制多受体下游的抗纤维化cAMP信号
接下来，我们询问通过GIV的GEF功能激活Gαi是否在HSC激活期间调节抗纤维化cAMP信号。首先，我们确认GIV在HSC中表达，与GEF预期的G蛋白结合16,19也就是说，它优先约束非活性Gαi3（加载GDP）()，而不是活性构象的Gαi3（负载GDP+AlF−4)GST下拉分析中。接下来，我们确认了需要GIV的GEF功能来增强Akt的各种刺激因素()也可以触发Lx2细胞中Gαi3的激活()，由特异识别Gαi活性GTP结合构象的抗体确定37内源性GIV耗竭抑制Gαi3活性(); 外源性表达抗siRNA的GIV-WT而非GIV-FA逆转了这种效应，表明GIV的GEF功能是HSC中Gαi3激活所必需的。正如预期的那样，表达GIV-FA的HSC中Gαi3活性的丧失伴随着细胞cAMP的积累增加()和增强的磷酸化()和核移位()表明GIV的GEF功能是抑制cAMP-CREB途径所必需的。这些结果表明GIV通过其GEF功能抑制HSC中抗纤维生成cAMP通路。
GIV激活HSC中Gαi并抑制抗纤维化cAMP/PKA/pCREB信号(A类)Lx2细胞的裂解物被用作下拉分析中全长GIV的来源，GST或GST-Gαi3单独预加载GDP（非活性）或AlF−4（活性），并固定在谷胱甘肽珠上。用免疫印迹法（IB）分析结合GIV和Gβγ。Ponceau S染色显示GST蛋白。
(B类)在裂解之前，用多种配体刺激缺乏血清的Lx2细胞。用Gαi:GTP单克隆抗体对等分的裂解物进行免疫沉淀，该单克隆抗体识别G蛋白的活性构象，并通过免疫印迹（IB）分析Gαi3的免疫复合物。
(C类)用对照（Scr）或GIV siRNA处理的Lx2细胞转染抗siRNA的GIV-WT或GIV-FA，并保存在0.2%的FBS中B类.
(D类)在裂解前用PDGF-BB刺激转染GIV-WT或GIV-FA的Lx2细胞。通过RIA分析裂解物的cAMP，并将其标准化为总蛋白。结果显示为cAMP（Y轴）中的折叠变化。
(E类)通过免疫印迹法（IB）分析转染GIV-WT或GIV-FA的Lx2细胞的GIV、phospho（p）Akt、phosphate（p）CREB和tubulin。根据带密度测定法，表达GIV-FA的细胞中pCREB/微管蛋白的比率比表达GIV-WT的细胞高约2.5倍。
(F类)将感染GIV-WT-HA或GIV-FA-HA腺病毒的Lx2细胞保存在0.2%的FBS中，固定并染色HA（GIV，绿色）、磷酸（p）CREB（红色）和DAPI/DNA（蓝色），并用共聚焦显微镜进行分析。箭头=GIV表达细胞。星=核反应堆。比例尺=10μm。结果显示%的细胞核pCREB细胞（Y轴）(克). 误差线表示平均值±S.D.n=3。采用双尾Student t检验评估统计显著性。
综合考虑，我们建议()GIV作为一个中心枢纽，整合多个纤维原性受体下游的信号，同时增强纤维前体（PI3-KAkt-FoxO1和TGFβ-SMAD）并抑制抗纤维蛋白（cAMP-PKA-pCREB）将促纤维化和抗纤维化信号之间的微妙平衡转变为有利于纤维化的整体促纤维化信号程序的途径。因此，通过转录（通过FoxO1、SMAD和CREB）和非转录机制（通过PI3K、Akt和细胞骨架重塑）的结合，对HSC持续激活和胶原合成至关重要的表型得到增强。
GIV增强HSC中的促纤维化和抑制抗纤维化信号通路不同类别纤维原性受体（顶部）的配体刺激通过直接相互作用（实心箭头）或未知机制（间断箭头）聚合到GIV上，以增强PI3K-Akt信号（1）并激活三聚体Gαi（2）。依赖于GIV的Akt激活引发了几种非转录反应（3），导致HSC激活。GIV-PI3K-Akt途径还调节两种不同的转录程序——（i）通过增加SMAD2/3（4）的磷酸化及其向细胞核的移位来增强纤维化前TGFβ-SMAD途径（5），从而增强胶原蛋白和α-SMA的增殖和转录（6）；（ii）通过磷酸化（7）抑制转录因子Foxo1，并触发其在细胞核外的移位（8），从而拮抗Foxo 1在生理学上维持的抗纤维化程序（9）。通过GIV的GEF功能激活Gi（2）抑制cAMP（10）的生成，cAMP是HSC中的一条主要抗纤维化途径，因为其能够抑制HSC迁移和增殖（11）。已知cAMP-PKA途径通过磷酸化CREB（12）在转录水平抑制纤维化，CREB转位到细胞核并抑制胶原蛋白和α-SMA的转录（13）。促纤维化途径=蓝色；抗纤维化=红色。
肝活检中GIV的表达与纤维化程度相关
由于GIV在肝纤维化早期上调，并且其表达是HSC激活所必需的，因此我们假设在肝活检中检测到GIV可以表明HSC持续激活，并标记进展为肝硬化的可能性。我们在21例慢性丙型肝炎病毒感染男性患者的肝活检中测试了这一假设，因为这些患者的纤维生成进展速度差异显著，而且对快速进展者和缓慢进展者的生物标记物的需求仍未得到满足38用Ishak量表分期纤维化（范围从0=无纤维化到6=肝硬化）38如前所示，正常肝脏中未检测到GIV()在100%中度至重度纤维化的肝脏中检测到（评分3-6）(). 然而，GIV仅在约37%轻度或无纤维化的肝脏中检测到（得分=0-2）(). 值得注意的是，GIV的表达与年龄、饮酒量、炎症程度或脂肪浸润没有任何相关性。这些结果表明，一些但并非所有患者在慢性病毒性肝炎的早期阶段，甚至在发生显著纤维化之前，都表达GIV，但随着肝硬化的进展，所有患者都呈阳性。在8例轻微或无纤维化的患者中，有3例肝活检GIV阳性的患者进展为晚期纤维化，这是通过增加FIB-4来确定的()和APRI()分数39,40随访3年。这些结果表明，肝活检中GIV的表达可以预测纤维化的进展，因此可以作为疾病的生物标志物。我们认为，在HCV感染早期肝活检中检测GIV可能会区分进展迅速的肝硬化患者和进展缓慢或根本没有进展的患者。
肝活检中GIV的表达可能预测纤维化进展(A类)通过IHC分析正常受试者和HCV感染患者不同纤维化阶段肝活检中GIV的表达。染色由两名病理学家使用简单的二进制评分系统对纤维化程度进行评分；即GIV为正或负。结果显示为每类纤维化中GIV（Y轴）阳性患者的%。
(B类)来自的代表性IHC图像A类显示了不同类别纤维化中阳性和阴性肝脏样本的示例。放大倍数=10倍。
(C、 D类)线图描绘了使用FIB-4测定的无纤维化或轻度纤维化患者的纤维化进展(C类)和APRI(D类)根据肝活检时和3年随访时的临床参数得出的分数。p值表明3年时纤维化评分存在显著差异。
(E类)示意图显示了我们提出的GIV在肝纤维化期间HSC纤维化信号传导中的作用模型。自上而下：各种类型的纤维损伤导致不同类别的受体激活，从而触发HSC中GIV的上调。GIV增加通过调节两条关键信号通路触发静止HSC转化为激活的肌成纤维细胞：1）原纤维PI3-KAkt通路和2）抗纤维cAMP-PKA通路。在静止的HSC中，低水平GIV表达产生一个净抗纤维化信号程序，其特征是Akt活性低，Gαi激活受损，从而导致cAMP水平升高。在活化的HSC中，高水平的GIV表达产生净促纤维化信号程序，其特征是高Akt活性和Gαi的活化增加，从而产生低水平的cAMP。低GIV表达使HSC保持静止状态，触发细胞凋亡，抑制正常肝脏中的胶原生成，而高GIV表达增强HSC迁移、增殖和存活，并触发胶原生成，从而导致肝纤维化。n=患者人数。误差条代表平均值±标准偏差。采用双尾Student t检验评估统计显著性。
讨论
在这里，我们将GIV定义为多受体下游纤维生成信号网络中的中心枢纽。凭借其激活三聚体G蛋白Gi的能力，GIV同时调节促纤维化和抗纤维化途径，这些途径具有拮抗作用，以平衡胶原蛋白的合成和去除，达到微妙的平衡。我们的结果提供了GIV如何触发HSC激活的详细机制见解，并支持：为了应对各种慢性损伤，不同类别的纤维原性受体被激活，从而触发GIV mRNA的上调、GIV蛋白的翻译及其在HSC中的激活。GIV GEF功能的增加表达和激活增强了许多受体下游的PI3K-Akt信号传导，并通过Gαi的激活减弱cAMP的积累。这些上游事件触发顺纤维生成和抗纤维生成途径的后续信号层（参见)，使整个网络偏向有利于纤维生成的整体纤维前信号程序。因此，几种表型（迁移、增殖、肌动蛋白重塑、存活/抗凋亡和胶原蛋白生成）不仅对HSC转分化为活性状态至关重要，而且对肝脏进行性肝损伤期间活性HSC丰度的持续增加也至关重要，最终导致肝纤维化。GIV耗竭或其GEF功能的靶向抑制可逆转HSC中的促纤维化程序，即抑制Akt活性并增加细胞cAMP，从而“重置”平衡为正常肝脏中存在的抗纤维化程序。我们得出结论，GIV是触发肝纤维化的多种纤维原性受体下游信号的关键传感器。
在许多利用GIV转导促纤维化信号的受体中，我们发现纤维化RTK-PDGFRβ直接结合并磷酸化GIV。这与我们之前关于RTK原型EGFR的工作一致，在该原型中，我们定义了GIV如何作为连接配体活化RTK和G蛋白信号的信号平台。尽管另一个主要的促纤维化受体，即TGFβR也需要GIV的GEF功能来增强Akt和SMAD信号和胶原合成，但令人惊讶的是，我们无法确定它们之间的直接联系（既不是结合也不是磷调节）。因为TGFβ和PDGF途径相互干扰41-43我们假设GIV及其GEF功能可能通过激活PDGFR通路间接增强Akt信号对TGFβ的反应。同样，因为PI3K-Akt途径可以增强对TGFβ反应的细胞中纤维生成性SMAD信号44GIV及其GEF功能可能通过激活Akt增强SMAD信号。
我们证明，当受到RANTES刺激时，GPCR（如CCR）也需要GIV的GEF功能来增强Akt活性。我们之前证明，GPCR（例如LPAR1和f-Met-Leu-Pro-R）需要GIV及其GEF功能来实现PI3K-Akt信号和趋化性16,19,45它们可以通过激活非RTK的Src家族来触发酪氨酸磷酸化和GIV的激活17我们得出结论，CCR通过激活GIV来调节促纤维化和抗纤维化信号。最后，我们还提供证据表明，TLR4是肝脏纤维化特有的受体，在LPS刺激下，也需要GIV的GEF功能来增强Akt信号。我们的发现与数据一致，数据显示TLR4需要激活PI3K-Akt通路以增强TGFβ-SMAD信号46,47TLR4的肝硬化导向性单核苷酸多态性（SNPs）在功能上与PI3K-Akt途径的基因相关48我们得出结论，TLR4通过GIV激活Akt，这里显示的结果为GIV如何通过调节白细胞介素-1（IL-1）/TLR超家族成员启动的信号网络来塑造先天免疫反应提供了第一个证据。因为KCs是肝脏LPS的主要靶点49这些细胞在损伤后也上调了GIV mRNA，TLR4-GIV-Akt通路可能也有助于在肝纤维化期间激活KCs。
除了证明多个纤维原性受体聚集在GIV上之外，我们还证明GIV随后激活Gαi调节两个功能性拮抗信号事件（参见)--（a）激活促纤维化PI3K-Akt信号，增强TGFβ-SMAD信号并抑制FoxO1，以及（b）抑制cAMP生成，抑制PKA-pCREB途径；从而产生有利于纤维化的整体促纤维化信号程序。因为PI3K-Akt途径与其他器官系统（皮肤、心脏、肺）的纤维原性疾病的研究密切相关（综述于50)]cAMP途径是其他各种纤维生成模型（心脏）中公认的抗纤维化途径51，肺部42，肾脏44、和皮肤26)所有器官的纤维化都有此处定义的共同受体/通路（即TGF-β1和PDGF52)我们推测GIV也可能是其他器官纤维化疾病的关键介质。
另一个重要发现是，在人类和小鼠的几种形式的慢性肝损伤后，GIV mRNA和GIV蛋白的表达持续上调。虽然我们在这里关注的是HSC中GIV的上调，但值得注意的是，其他细胞，如内皮细胞和KC，也通过促进HSC的持续激活而促进肝纤维化53损伤后GIV显著上调。这并不意外，因为已知GIV在血管内皮细胞中表达15我们之前证明GIV是巨噬细胞趋化性所必需的19与HSC一样，KC对细胞因子和趋化因子的激活和分泌由PI3K-Akt拮抗平衡7和cAMP-pCREB途径54由于GIV调节HSC中的这两条信号通路，我们怀疑GIV在肝纤维化中的作用不仅限于HSC的激活，还扩展到KC的激活；所有这些都是通过我们在这里概述的共同信号转导机制实现的。
至于GIV上调的机制，我们的结果表明其表达可能受到多个步骤的调控。例如，静止的HSC GIV mRNA水平较低，但没有蛋白质翻译，这表明这些细胞中的蛋白质翻译受到抑制或蛋白质半衰期短。然而，在活化的HSC中，可以看到高水平的GIV mRNA和全长蛋白，这表明转录诱导和/或RNA和/或蛋白稳定是这种上调的原因。我们最近将STAT3定义为一种关键转录因子，在创伤反应和癌症进展过程中负责GIV的上调22因为STAT3广泛参与了肝脏的炎症/损伤反应55肝纤维化被比作会愈合23STAT3可能在肝损伤后上调GIV，从而将炎症与纤维化联系起来。无论涉及何种机制，我们发现GIV的持续上调仅限于某些形式的损伤，而非其他形式的损伤：上调发生在所有形式的慢性纤维原性损伤中，但不发生在无纤维化愈合的急性损伤中。这些结果表明，GIV不仅是受损肝脏急性期反应的一个组成部分，相反，GIV在急性损伤期间的表达增加可能预示着进展为慢性和纤维化的可能性。
关于我们研究结果的临床相关性，我们提供证据表明GIV既可以作为治疗肝纤维化的靶点，也可以作为预测肝纤维化的生物标志物。我们在表达GEF-缺陷型GIV-FA的HSC中的发现表明，通过单点突变选择性抑制GIV:Gαi界面足以改变多种信号并抑制HSC持续激活所需的各种表型。基于这些，我们得出结论，GIV:Gαi界面是一个有效且特异的靶点，对干扰也很敏感。此外，由于细胞cAMP的积累可以逆转纤维化13cAMP的积累是抑制GIV的GEF功能的直接后果之一，我们预计靶向GIV:Gαi界面的拮抗剂不仅会停止，还会通过恢复抗纤维化信号而导致纤维化的逆转。基于我们的发现，GIV的GEF功能被多个受体利用，抑制GIV:Gαi界面构成了一种新的策略，可以通过单个靶点对外部操纵多个纤维原性受体。由于全长GIV在正常肝脏中不表达，并且肝脏中的大多数细胞（即肝细胞）即使在损伤后也不表达GIV，因此抑制GIV对肝脏主要代谢功能的靶外影响可能较小。我们得出的结论是，对抗GIV:Gαi界面的小分子具有选择性和广泛的潜力，即在表达全长GIV的细胞中选择性抑制GIV依赖性促纤维化信号传导，但广泛位于多种受体的下游。
关于GIV的预后潜力，我们提供了一个证据，即在慢性HCV感染过程中的早期（尚未发生显著纤维化时），在FFPE肝活检中检测到GIV可能预示着快速进展为晚期纤维化。基于GIV在HSC中的表达先于胶原合成和肝纤维化的发生这一事实，GIV符合理想预测因子的定义，即使在IHC检测到轻微或无纤维化的早期阶段，GIV也能识别高危患者。此外，我们的IHC结果显示，使用3种不同的CT抗体可以轻松、重复地检测到全长GIV，并且简单的二元评分系统（即GIV的存在或不存在）足以将高危人群与其他人群区分开来，而无需繁琐的主观评分算法。尽管我们的研究结果具有潜在的意义，但这项研究以及未来有关这一主题的任何研究的局限性包括肝活检中经常出现的取样错误，尽管个别活检符合组织学标准的充分性。为了避免这种局限性，我们使用了两种不同的临床评分方法来监测纤维化的进展，即FIB-4和APRI；每个分数都来自多个临床参数。我们发现，这两个评分同时将患者分为两组：非进展组（纤维化阶段F0=无纤维化；F1=无桥门脉纤维化；F2=罕见桥门脉纤维性）和进展组（肝硬化阶段F3=无肝硬化的众多桥；F4=肝硬化）。我们的研究结果表明，IHC在HSC中表达的GIV与3年内纤维化发展到显著水平有关。我们得出结论，GIV可作为临床应用的预测生物标记物，用于识别那些慢性肝损伤患者中进展性纤维化风险最高的患者。因为越来越多的证据表明活化的HSC推动了原发性肝癌和胆道癌的进展56，因为GIV是真诚地促进多种癌症侵袭性的促转移蛋白22,57GIV在HSC中的表达水平可能与肝癌的进展相关/预测。需要对更多患者进行进一步研究，以评估肝活检中GIV的表达是否独立预测肝硬化和/或癌症进展。
总之，我们将GIV定义为一个新的信号枢纽，位于驱动肝纤维化的复杂多受体信号系统的中心。我们的发现确立了一个新的范式，即单个多域信号传感器集中整合并广泛塑造整个纤维形成网络。作为一个有希望的治疗靶点，可以作为预测纤维化风险的生物标记物，GIV为患有肝纤维化疾病的患者实施个性化药物提供了机会。
方法
试剂和抗体
除非另有说明，否则所有试剂均为分析级试剂，均来自Sigma-Aldrich。细胞培养基购自Invitrogen。PDGF（Invitrogen）、TGFβ1（Invitro）、RANTES（R&D Systems）和LPS-E Coli 055:B5（Sigma）已商业化获得。BrdU来自Sigma。重组物和PDGFRβ购自Cell Signaling。所有限制性内切酶和大肠杆菌菌株DH5α购自新英格兰生物实验室。大肠杆菌菌株BL21（DE3）、低聚体胺和卵磷脂-Texas Red购自Invitrogen。DAPI购自Molecular Probes（Invitrogen）。基因果汁TM（TM）转染试剂来自Novagen（EMD Millipore），PfuUltra DNA聚合酶购自Stratagene。Silencer阴性对照加扰（Scr）siRNA购自Ambion和之前验证的32GIV siRNA序列是从Dharmacon定制的。山羊抗兔和山羊抗鼠Alexa Fluor 680或IRDye 800 F（ab'）2用于奥德赛红外成像的是Li-Cor Biosciences公司。本研究中使用的抗体包括针对Gαi3（M-14）和pan-Gβ（Santa Cruz Biotechnology）、phospho-Akt Ser 473、phosphal-ERK 1/2、phospon-SMAD 2和phosphan-CREB（Cell Signaling）和phosphon-Histone H3（Abcam）的兔pAbs。商业化获得了抗六组氨酸（His）、FLAG（M2）、肌动蛋白和α-微管蛋白（Sigma-Aldrich）、SMAD 2/3、磷酸化-PDGFRβ-Tyr716和GFP（Santa Cruz Biotechnology）、BrdU（BD Biosciences）、PDGFRβ（Biolegend）、α-SMA（DAKO）、对照IgG（Bio-Rad Laboratories）和抗活性Caspase 3（Abcam）的小鼠单克隆抗体。本研究中使用了几种抗GIV抗体。我们使用兔抗GIV线圈（GIVcc）（Millipore）和GIV-CT抗体（Santa Cruz Biotechnology）进行免疫印迹。线圈抗体检测GIV的大多数亚型，而CT-Ab仅检测GIV全长亚型，该亚型包含GIV作为信号换能器功能所需的结构域。对于免疫荧光，我们使用了兔单克隆抗GIV-CT（Spring Bioscience）和抗GIV-CT-mAb（Millipore）。三种不同的抗GIV CT Abs用于GIV的IHC检测（Santa Cruz Biotechnology、IBL America和Spring Bioscience）。所有这些CT抗体都是针对C末端的最后18 aa而产生的，并根据其特异性检测全长GIV亚型的能力在免疫印迹分析中进行了验证。抗Tyr1764-GIV抗体是由Spring Bioscience使用一个专有平台开发的，该平台使用包含pY1764的肽生成兔单克隆抗体。这是一种诊断级抗体，由我们的团队Ventana/Roche和Spring Biosciences联合开发，并在本项目中使用之前在多次检测中进行了广泛验证。Anti-Ser1614-GIV是从IBL America商业获得的，之前由高桥集团验证32.Anti-Gαi3:GTP（6-F12）是Graeme Milligan博士的礼物58.
质粒构建、突变和蛋白表达
将Gαi3克隆到pGEX-4T-1（GST-Gαi2），将GIV-CT（aa 1660-1870）克隆到pET28b（His-GIV CT），并通过沉默突变产生抗RNA干扰（siRNA休息）GIV32并克隆到p3XFLAG CMV中TM（TM）-14质粒（GIV-FLAG）如前所述16,19,26,45His-PCT（Podocalyxin Tail）是Farquhar MG博士的礼物59GIV突变体是根据制造商的说明，使用QuickChange II（Stratagene）和特定引物（序列可根据要求提供）生成的。所有结构均通过DNA测序进行检查。
GST、GST-Gαi3、His-GIV CT和His-PCT融合构建物在大肠杆菌菌株BL21（DE3）（Invitrogen），并按照前面所述进行纯化16,19,26用1 mM异丙基β-D-1硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在25°C下诱导细菌培养过夜。将来自1 L培养物的球状细菌重新悬浮在10 ml GST裂解缓冲液中[25 mM Tris-HCl，pH 7.5，20 mM NaCl，1 mM EDTA，20%（v:v）甘油，1%（v:v）Triton X-100，2X蛋白酶抑制剂混合物（完全不含EDTA，Roche Diagnostics）]或His-lysis缓冲液[50 mM NaH2人事军官4GST或His融合蛋白的pH值分别为7.4、300 mM NaCl、10 mM咪唑、1%（v:v）Triton X-100、2X蛋白酶抑制剂混合物（完全不含EDTA，罗氏诊断）。超声处理（3×30s）后，将裂解液在4°C下12000g离心20分钟。溶解的蛋白质用谷胱甘肽-脑葡萄糖4B珠（GE Healthcare）或HisPur钴树脂（Pierce）亲和纯化。洗脱蛋白质，根据PBS透析过夜，并储存在−80°C下。
小鼠和纤维化诱导
使用报告Col-GFP小鼠（pCol9GFP-HS4,5转基因）研究I型胶原的表达时间30在所有其他实验中，8至12周龄雄性C57BL/6小鼠（Jackson实验室）接受了BDL手术或CCl给药4与前面描述的完全一样7除未结扎胆管外，假手术的操作方法类似。BDL后5或21天处死动物。CCl公司4（Sigma-Aldrich；在玉米油中以1:3稀释）或载体（玉米油）通过腹膜内途径给药，剂量为0.5μl/g体重，每周两次，共12次注射。根据NIH在《实验动物护理和使用指南》中提出的建议，动物得到了人道的护理。所有动物实验和细胞分离研究都得到了加州大学圣地亚哥分校动物护理与使用委员会的批准。
小鼠肝细胞组分的分离培养
如前所述，将8至12周龄雄性C57BL/6小鼠（Jackson实验室）的肝细胞分为肝细胞、枯否细胞、内皮细胞和肝星状细胞60小鼠肝脏灌注后，用8.2%和14.5%的Nycodenz（Accurate Chemical and Scientific Corporation）进行三层不连续密度梯度离心。然后分别使用抗CD11b抗体或抗肝窦内皮细胞抗体通过磁性细胞分选，对枯否细胞或内皮细胞组分进行阳性筛选（Miltenyi Biotech）。通过对Kupffer细胞和内皮细胞的阴性选择，用相应抗体进行磁性细胞分选，纯化肝星状细胞组分。这些细胞组分立即均质以提取RNA。通过相控显微镜、紫外线（UV）激发的自体荧光（HSC）和二乙酰化低密度脂蛋白（LDL）（EC）摄取检测肝细胞、HSC和EC的纯度。通过1μm乳胶粒的吞噬作用，通过功能分析证明KC的纯度。每种细胞类型的纯度如下：肝细胞，大于97%；EC，大于98%；KC，大于95%；HSC，大于96%。当我们在整个手稿中分离HSC用于各种测定时，通过用抗结蛋白抗体进行免疫染色，纯度被确认为>98%。HSC在含有10%FBS的DMEM中的无涂层塑料组织培养皿/盖玻片上培养，仅用作原代培养物。
RNA分离和定量（qPCR）
根据制造商的方案，使用RNeasy试剂盒（QIAGEN）分离总RNA。首先使用Superscript II逆转录酶（Invitrogen）合成第一链cDNA，然后进行核糖核酸酶H处理（Invit罗gen），然后进行定量实时PCR。在每个实验中，省略逆转录酶的反应作为阴性对照。然后在实时PCR系统（ABI StepOnePlus；Applied Biosystems）上进行反应。用SYBR green（Invitrogen）检测基因表达，用ΔΔT型方法。本工作中使用的引物是针对GIV的最后两个外显子设计的，因此它们使用Invitrogen的Oligo-Perfec Designer专门检测所有已知的GIV全长亚型，并使用Premierbiosoft的NetPrimer进行评估26本工作中使用的引物序列包含在补充表1中。
患者样本
用于GIV mRNA分析的人类肝脏样本收集于西奈山医院。从接受肝细胞癌手术切除或肝移植的HCV感染患者中采集肝硬化样本。正常肝组织取自接受非肿瘤性疾病肝切除术的患者，包括肝腺瘤和局灶性结节增生。将肝脏样品快速冷冻，提取RNA，DNA酶处理，逆转录，并按照上述方法进行实时定量PCR分析。
本研究中用于IHC的肝活检标本来自弗吉尼亚州圣地亚哥医疗系统2009年至2010年间接受经皮肝活检的21名患者。使用标准的Jamshidi抽吸针进行活检，样品立即用福尔马林固定并嵌入石蜡中。活检标本的充分性通过至少6-8个门静脉三联体的存在来确定。此外，从圣地亚哥县进行的尸检中获得了7个正常肝脏样本。本研究中使用的所有组织均在IRB批准后收集（项目编号04-0056 0001 05 ME X和101264），并征得患者知情同意。
至于本研究的局限性，尽管活检是根据标准临床实践进行的，并且符合当前的肝活检取样标准，但众所周知，尽管符合单个活检的组织学标准，但肝活检仍可能出现取样错误。尽管抽样误差是可能的，但这仍是肝组织学检测的“金标准”。
免疫组织化学
GIV IHC分析是在BenchMark XT自动滑动染色器（Ventana Medical Systems，Inc.）上进行的。FFPE样品（4 um切片）脱蜡，预处理以回收抗原，然后灭活内源性过氧化物酶。将样品与抗GIV兔单克隆抗体（Ventana Medical Systems，Inc.）或多克隆抗体（IBL，Santa Cruz）（10μg/ml）在37℃下孵育16分钟，并使用OptiView DAB IHC检测试剂盒观察免疫定位蛋白。检测后，用苏木精II和发蓝试剂对所有样品进行复染。所有检测的抗体之间有100%的一致性。
半薄免疫荧光
肝脏标本用4%多聚甲醛在4°C下固定4h，冷冻并在液氮中冷冻。使用配备FCS冷冻附件的徕卡Ultracut UCT切片机在−100°C下切割半薄切片（0.5μm）。冰冻切片用PBS（3×）清洗，用0.15%甘氨酸（2×）清洗并在封闭缓冲液（5%正常山羊血清、2%鱼皮明胶和PBS中2 mg/ml的BSA）中培养20分钟，初级抗体培养2小时，次级抗体培养45分钟。使用的抗体稀释如下：小鼠抗GIV-CT（1:30）、GFP（1:50）；α-SMA（1:200）；DAPI（1:1000）和二级山羊抗鼠（594）、山羊抗兔（488）和山羊抗家兔（635）Alexa-conjugated抗体（1:250）。切片在徕卡SPE共焦显微镜上成像，使用63x油物镜，使用488、561、633和405激光线进行激发。对设置进行了优化，最终扫描图像的线平均值为3。所有图像均使用Image J软件（NIH）进行处理，并使用Photoshop和Illustrator软件（Adobe）进行组装。
全细胞免疫荧光
Lx2细胞在室温下用PBS中的3%多聚甲醛固定25分钟，用0.1M甘氨酸处理10分钟，随后在室温下用含有3%BSA和0.2%Triton X-100的PBS封闭/透化30分钟。一级和二级抗体在含有3%BSA和0.2%Triton X-100的PBS中在室温下培养1小时。细胞在徕卡SPE共焦显微镜上成像，使用63×油物镜，使用488、561和405激光线进行激发。对设置进行了优化，最终扫描图像的线平均值为3。使用的抗体稀释如下：GIVcc（1:150）；GM130（1:150）；磷酸-GIV（Tyr1764；1:500）；磷酸-PDGFRβ（1:50）；PDGFRβ（1:100）；小鼠抗GIV-CT（1:100）；黄芩苷（1:1000）；DAPI（1:2000）；次级山羊抗兔（594）和山羊抗鼠（488）Alexa结合抗体（1:500）；抗磷酸化H istone H3（Ser28）（1:150）、抗BrdU（1:10）、SMAD 2/3（1:100）、磷酸化CREB（1:250）、FoxO1（1:1100）和抗活性Caspase 3（1:200）。所有图像均使用Image J软件（NIH）进行处理，并使用Photoshop和Illustrator软件（Adobe）进行组装。
在研究转录因子的核定位的分析中，通过计算细胞核中是否存在转录因子的任何核染色来量化具有核定位的细胞的百分比，并将其用作二元系统（即具有或不具有转录因子核定位的胞体）的基础~每个条件下200-400个细胞从三个独立的实验中计数。
细胞培养、转染、裂解和定量免疫印迹
Lx2人肝星状细胞系取自Scott Friedman（Mount Sinai，NY），并根据先前发布的指南在含有2%FBS的DMEM培养基中培养31.转染、裂解和免疫印迹完全按照之前所述进行19,26,61.
按照制造商的协议，使用Genejuice（Novagen）转染Lx2细胞以获得DNA质粒，使用Oligowetamine（Invitrogen）获得siRNA寡核苷酸。对于腺病毒感染，将细胞与各自的病毒在50 MOI下孵育5 h。然后，更换培养基并将细胞保持2-3天。对于涉及血清饥饿的检测，隔夜将血清浓度降低至0%，对于血清减少治疗，使用0.2%FBS。用冷PBS清洗细胞，然后重新悬浮并在样品缓冲液中煮沸，制备全细胞裂解物。在免疫沉淀或下拉分析中用作蛋白质来源的裂解物是通过将细胞重悬在裂解缓冲液[20mM HEPES，pH 7.2，5mM乙酸镁，125mM乙酸钾，0.4%Triton X-100，1mM DTT，补充有原钒酸钠（500μM）、磷酸酶（Sigma）和蛋白酶（Roche）抑制剂混合物]中来制备的，然后在4°C下通过28G针头，并在随后的实验中使用之前清除（10000×g，10分钟）。
对于免疫印迹，蛋白质样品通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜（密理博）。在与初级抗体孵育之前，用补充有5%脱脂牛奶（或在检测磷酸化蛋白时用5%BSA）的PBS封闭膜。使用Li-Cor Odyssey成像系统进行双色检测和量化的红外成像。一级抗体稀释如下：抗-His 1:1000；防FLAG 1:500；抗GIV-CT 1:500；抗磷酸-GIV（Tyr1764）1:500；抗磷酸-GIV（Ser1416）1:500；抗磷Akt 1:250；抗Akt 1:500；抗磷-ERK1/2 1:250；抗Gαi3 1:333；抗泛Gβ1:250；抗α微管蛋白1:2000；抗肌动蛋白1:1000；抗SMAD2/3 1:250；抗磷-PDGFRβ1:250；抗PDGFRβ1:250和抗磷酸CREB（1:1000）。所有Odyssey图像均使用Image J软件（NIH）进行处理，并使用Photoshop和Illustrator软件（Adobe）进行组装。免疫印迹的未截取图像如补充图7-9所示。
细胞迁移和增殖测定
用对照干扰（Scr）siRNA或GIV siRNA转染Lx2细胞约36小时。然后用20μl移液管尖端刮伤单层培养物（100%融合），随后在接下来的24小时内用相控显微镜对细胞进行监测，以量化细胞迁移（以伤口闭合百分比表示）使用Image J软件对图像进行分析，计算0h和24h伤口面积除以0h×100面积的差值。
如前所述，Lx2细胞的增殖率通过磷酸化H istone H3（Ser28）（有丝分裂指数）和BrdU掺入（S期DNA复制）进行测量20对于有丝分裂指数，细胞在盖玻片上生长24小时，然后固定并通过共焦显微镜进行分析。对于BrdU摄取分析，Lx2细胞在盖玻片上生长24 h，用10μM BrdU处理30 min。然后用70%乙醇在室温下固定细胞30 min，用PBS（3×）洗涤，用2 M HCl在室温下处理20 min，然后用0.1 M Na2B类407（pH 8.5）在室温下保持2分钟。最后，用PBS（3×）清洗盖玻片，并用共焦显微镜进行分析。对于磷酸化-胆固醇和BrdU分析，从三个独立的实验中对来自10个随机选择的区域的400-600个细胞进行计数（DAPI染色）。有丝分裂指数由阳性染色细胞数/DAPI染色细胞核总数×100决定。结果显示为来自3个单独实验的10个场的平均值±S.E.M。对于原代小鼠HSC中的有丝分裂指数，从小鼠肝脏分离细胞并在盖玻片上生长16 h。然后，用GIV-WT或GIV-FA腺病毒感染mHSC，24 h后，用PDGF-BB（20 ng/ml，16 h）饥饿或处理细胞，并用共聚焦显微镜测量有丝分裂指标。
细胞凋亡测定
使用了三种不同的方法。Lx2细胞生长在盖玻片上，用对照干扰（Scr）siRNA或GIV siRNA转染48小时，或感染GIV-WT或GIV-FA腺病毒，24小时后，细胞再饥饿24小时。为了测量Caspase 3裂解，将细胞固定并用抗活性Caspase 3Ab（1:200）染色。根据原位细胞死亡检测试剂盒TMR red（Roche）的方案，采用TUNEL法测量DNA片段。从三个独立的实验中对来自随机选择的场的100个细胞进行计数（DAPI染色）。通过将阳性染色细胞数除以DAPI染色细胞核总数×100，确定具有活性Caspase 3或片段DNA的细胞百分比。用qPCR检测两种真正的促凋亡（Bax）和抗凋亡（Bcl-2）信号中间产物的表达。
表达GIV的腺病毒的产生
将HA标记的全长人GIV野生型（GIV-WT）和抗人和鼠GIV siRNA的GIV-F1685A（GIV-FA）克隆到pShuttle-CMV载体中62用PacI将所得质粒线性化，并使用基因脉冲电泳器（Bio-Rad）将其转化为电竞争性AdEasier E.coli（Agilent）。根据测序和限制性内切酶分析选择正确的重组克隆，用PacI线性化并转染到Cre8细胞（匹兹堡大学Ora Weisz博士的礼物）。使用HEK-293细胞扩增腺病毒颗粒，并使用氯化铯梯度进行纯化62.
体外下拉试验和免疫沉淀
如前所述，在室温下将纯化的GST-Gαi3、GST单独、His-GIV CT或His-PCT固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖或HisPur钴珠上90分钟17,19,26,63将Lx2 HSC裂解物或磷酸化PDGFRβ（50 ng）蛋白添加到每个试管中，在4°C下进行结合反应4小时，并在结合缓冲液中恒定翻滚[50 mM Tris-HCl（pH 7.4），100 mM NaCl，0.4%（v:v）Nonide P-40，10 mM MgCl2，5 mM EDTA，2 mM DTT，蛋白酶抑制剂混合物]。用1 mL洗涤缓冲液[4.3 mM Na洗涤珠子（4×）2高性能操作4，1.4 mM千赫2人事军官4（pH 7.4），137 mM NaCl，2.7 mM KCl，0.1%（v:v）吐温20，10 mM MgCl2，5mM EDTA，2mM DTT]，并在莱姆利样品缓冲液中煮沸。当GST-Gαi3用于分析时，结合缓冲液和洗涤缓冲液均补充30μM GDP。
为了进行免疫沉淀，将细胞裂解物（约2 mg蛋白质）与2μg抗PDGFR单克隆抗体或免疫前对照小鼠IgG在4℃孵育4 h。添加蛋白G Sepharose珠（GE Healthcare），并在4°C下再孵育60分钟。清洗珠，并通过在Laemmli的样品缓冲液中煮沸洗脱结合的免疫复合物。
为了免疫沉淀活性Gαi3，细胞裂解物与构象Gαi3:GTP小鼠抗体（1μG）在4°C下孵育1 h58或免疫前对照小鼠IgG。添加蛋白G Sepharose珠（GE Healthcare），并在4°C下再培养45分钟。如前所述，在Laemmli的样品缓冲液中煮沸，清洗珠并洗脱免疫复合物59,61,62.
体外激酶测定
使用纯化的His-GIV-CT或His-PCT蛋白（~5μg）和商业获得的PDGFRβ激酶（细胞信号传导）进行体外激酶测定。通过添加1000μM ATP开始反应，并在25°C下30μl激酶缓冲液中进行60分钟[60 mM Hepes（pH 7.5），5 mM MgCl2，5 mM氯化锰2，3μM钠三OV公司4]. 通过添加Laemmli样品缓冲液和煮沸停止反应。
cAMP的测量
用GIV-WT或GIV-FA转染Lx2细胞，血清饥饿（0%FBS，16 h），用异丁基甲基黄嘌呤（IBMX，200μM，20 min）培养，然后用PDGF（20 ng/ml，10 min）和Forskolin（10μM，10 min.）培养。通过抽吸培养基和添加150μl冰镇TCA 7.5%（w/v）终止反应。通过放射免疫分析法（RIA）测定TCA提取物中的cAMP含量，并将其归一化为蛋白质[（使用染料结合蛋白分析法（Bio-Rad）测定]64数据表示为Forskolin刺激后的折叠变化。
数据分析与统计
所有实验至少重复三次，结果要么作为一个代表性实验，要么作为平均±S.D。使用双尾Student t检验评估统计显著性。
