公共科学图书馆一号。2014; 9（7）：e102467。
阴道液中的游离糖原与乳酸杆菌定植和阴道pH值低
,1,* ,2 ,1 ,1 ,1 ,2 ,2 ,三和1
帕里亚·米尔蒙塞夫
1美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学免疫学/微生物学系
安娜·L·霍顿
2美国伊利诺伊州芝加哥库克县健康与医院系统核心中心
道格拉斯·吉尔伯特
1美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学免疫学/微生物学系
德里克·布尔加德
1美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学免疫学/微生物学系
阿兰·兰迪
1美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学免疫学/微生物学系
凯萨琳·M·韦伯
2美国伊利诺伊州芝加哥库克县健康与医院系统核心中心
马吉·科恩
2美国伊利诺伊州芝加哥库克县卫生与医院系统CORE中心
雅克·拉威尔
三美国马里兰州巴尔的摩马里兰大学医学院基因组科学研究所
格雷戈里·斯皮尔
1美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学免疫学/微生物学系
大卫·N·弗雷德里克斯，编辑器
1美国伊利诺伊州芝加哥拉什大学免疫学/微生物学系
2美国伊利诺伊州芝加哥库克县健康与医院系统核心中心
三美国马里兰州巴尔的摩马里兰大学医学院基因组科学研究所
美国弗雷德·哈钦森癌症中心
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
构思并设计了实验：PM GTS。执行实验：DG DB JR。分析数据：PM ALH KMW JR AL GTS。投稿试剂/材料/分析工具：KMW MC JR。投稿人：PM ALH KMW JR GTS。
2014年4月15日收到；2014年6月17日接受。
这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了适当的信任。
- 补充资料
图S1：
相对丰度
乳酸杆菌
参与者糖原的种类和浓度随时间的变化。左Y轴是相对丰度鸡冠花乳杆菌、内脏乳杆菌、詹森乳杆菌和加塞乳杆菌; 右Y轴是糖原浓度（µg/µl）。X轴是年度访问次数。（畅通节能法）
GUID:49C39FB6-295C-41D6-934E-B710A3E8E807
图S2：
葡萄糖的分布
乳酸杆菌
和糖原。每年从21名8-11岁女性的阴道液中测量葡萄糖和糖原水平。最终的分析样本由177个观察值组成，所有变量的值均未缺失。的分布乳酸杆菌相对丰度（A）和糖原（B）以葡萄糖作为连续变量进行总结。（畅通节能法）
GUID:CF124654-9BFA-45A7-8BEE-47DBCDAA4AEC
图S3：
末次月经后糖原浓度（LMP）。阴影部分表示四分位范围，水平条表示中位数，胡须表示95%的置信区间。N=149，不包括6次报告绝经或妊娠的就诊和19次LMP＞50天的就诊。（畅通节能法）
GUID:67F6CCD2-621C-45F5-A037-E416D6DD9D2E
图S4：
pH值依据
乳酸杆菌
相对丰度≥85 vs.<85%。
（畅通节能法）
GUID:0A0FAAA8-90A1-4DA1-8FF6-678D76650253
- 数据可用性声明
作者确认，研究结果所依据的所有数据都是完全可用的，没有任何限制。所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。
摘要
目标
乳酸杆菌在许多女性的下生殖道微生物群中占主导地位，产生较低的阴道pH值，对健康的妊娠结局和防止几种性传播病原体的感染至关重要。然而，促进乳酸杆菌仍然缺乏了解。我们假设下生殖道管腔中游离糖原的数量是乳酸杆菌定植和阴道pH值低。
方法
定量灌洗样品中的游离糖原。16S rRNA基因的焦磷酸测序用于鉴定8–11年间收集的21名非洲裔美国女性的微生物群。
结果
女性之间甚至同一女性体内的游离糖原水平差异很大。游离糖原最高的样本对应的生殖器pH值中值显著低于低糖原样本（pH值5.8；p<0.001）。微生物群的组成部分乳酸杆菌糖原高的样本与糖原低的样本相比最高（中位数=0.97对0.05，p<0.001）。在多变量分析中，过去6个月内有1对0男性性伴侣与糖原呈负相关，而BMI≥30与糖原呈正相关。高浓度糖原对应较高水平的克氏乳杆菌和詹森氏乳杆菌，但不是内陆乳杆菌.
结论
这些发现表明，生殖液中的游离糖原与生殖微生物群有关，该微生物群主要由乳酸杆菌，提示糖原对维持生殖器健康很重要。旨在增加生殖器游离糖原的治疗可能会影响乳酸杆菌殖民化。
介绍
在许多女性中，健康的下生殖器微生物群主要由乳酸杆菌物种，如鸡冠花乳杆菌、詹森乳杆菌、加塞利乳杆菌或内陆乳杆菌
[1]–[4]乳酸杆菌定植的一个关键特征是生殖道的pH值相对较低（pH≤4.5），因为这些细菌能够产生大量乳酸[5],[6]这种低pH值有助于防止其他微生物定植[5]–[8].乳酸杆菌该物种还可以通过产生其他抗菌化合物（如细菌素）来促进阴道健康[9],[10].
缺乏阴道定植乳酸杆菌与细菌性阴道病（BV）等疾病的发展有关，通常与女性的不良医疗后果有关[11]–[13]生殖器微生物群以乳酸杆菌为主的女性感染HIV、HSV-2和其他几种性传播病原体的风险显著降低，包括淋病奈瑟菌和沙眼衣原体
[14]–[18]在感染HIV的女性中，生殖器乳酸杆菌水平较高的女性在阴道液中释放的HIV病毒较少[19],[20]并且向伴侣传播艾滋病毒的风险较低[21]乳酸杆菌定植还可降低盆腔炎和妊娠相关并发症的风险，包括早产[4],[22]–[25].乳酸杆菌因此在维持健康方面发挥着重要作用。
不同种类的乳酸杆菌对阴道病原体提供不同程度的保护。殖民地克氏乳杆菌和詹森氏乳杆菌被认为是最有益的内陆乳杆菌和加塞里乳杆菌被认为缺乏保护[1],[26]–[29].识别不同种类的乳酸杆菌而有助于其定植的因素对于了解病原体的易感性和预防妊娠不良结局至关重要。
人们早就认识到阴道乳酸杆菌女性的水平和阴道pH值在一生中都会发生变化[30]–[32]青春期开始时，女性下生殖道通常以乳酸杆菌并且阴道pH降低。这些变化与循环雌激素增加和阴道上皮细胞糖原沉积增加相一致[30].殖民化与乳酸杆菌上皮内糖原的沉积导致了这样一种假设，即糖原是乳酸杆菌的重要能量来源，并且乳酸杆菌能够在女性下生殖道定植并产生乳酸[12],[30].
然而，关于糖原如何促进乳酸杆菌女性下生殖道的定植。目前尚不清楚有多少糖原可用于乳酸杆菌阴道环境中的应用。而含糖原的阴道上皮层的厚度可能因激素浓度而异[30],[31],[33],[34]目前尚不清楚这将如何影响乳酸杆菌生长的阴道腔中的游离糖原水平。此外，几项研究表明，大多数菌株乳酸杆菌-至少在体外-不要直接利用糖原[35]–[38]即使从女性生殖道中分离出糖原[37].
在本研究中，我们研究了游离糖原（即生殖液中非细胞相关的可溶性糖原）与乳酸杆菌殖民化。因此，我们测量了生殖液中的游离糖原，并评估了其与乳酸杆菌级别，不同乳酸杆菌物种和阴道pH。
材料和方法
道德声明
该研究由拉什大学医学中心和库克县卫生与医院系统机构审查委员会（IRB）批准。根据拉什大学医学中心和库克县卫生与医院系统IRB批准的方案，获得所有参与者的书面知情同意。
参与者和样本采集
该分析中的所有受试者均为来自芝加哥女性机构间艾滋病毒研究（WIHS）网站的HIV血清阴性非裔美国女性，她们报告了与芝加哥WIHS登记的HIV感染女性相似的社会人口学和行为风险因素，和被选为配对对照，进行HIV感染对阴道微生物群影响的纵向研究（手稿正在编写中）。大型纵向研究的排除标准包括在指数研究访视时患有淋病、衣原体、梅毒或滴虫病，在研究期间的任何时候都处于绝经后状态，以及在研究期间任何报告的性交易。在采集样本时，进行了详细的结构化心理和行为访谈、身体和妇科检查，以及血液和妇科采样和测试。以下人员的在场阴道毛滴虫,白色念珠菌和HSV分别通过湿贴、KOH制剂和病变目视检查进行测定。细菌性阴道病（BV）由Amsel标准确定，定义为存在以下三个因素：阴道pH值>4.5、线索细胞和胺味[39]在收集宫颈阴道灌洗液（CVL）之前，通过向pH值范围为4–7的指示试纸条中添加生殖器液体来测定阴道分泌物的pH值（ColorpHast指示试纸，MCB试剂，新泽西州吉布斯敦）。然后通过CVL收集生殖道液体，用10ml非抑菌无菌生理盐水冲洗宫颈，然后从后穹窿抽吸。生殖器液样本在处理前保持低温，处理发生在采集后6小时内。在−80°C下储存之前，轻轻旋转样品以均匀分布细胞。
条形码16S rRNA基因V1-V2区扩增子的DNA分离、PCR扩增和焦磷酸测序
通过以13200 rpm的速度离心25分钟，将来自生殖液样品的细菌制成颗粒。上清液储存在−70°C下，用于糖原测量。将细菌颗粒重新悬浮在200µl无核酸酶水中（加利福尼亚州巴伦西亚的齐亚根）。使用FastDNA SPIN试剂盒（MP Biomedicals，Solon，OH）进行DNA分离。将细菌颗粒添加到裂解基质A管中，并以6m/s搅拌珠粒40秒（FastPrep-24，MP Biomedicals，Santa Ana，CA）。最终洗脱体积为100µl。用NanoDrop 2000分光光度计测定DNA浓度。所有程序均在室温下进行。
如前所述，对条形码16S rRNA基因V1-V2区域扩增子进行焦磷酸测序[40]简单地说，域级引物的条形码集合(即27F和338R）包含八位条形码，用于从基因组DNA提取物中扩增细菌16S rRNA基因的V1和V2高变区。引物如下：27F-5′-GCCTTGCCAGCCGCCT公司CAGTC公司AGAGTTTGCCTGGCTCAG公司-3′和338R-5′-GCCTCCCTCGCGC-CATCAGNNNNNNNN猫GCTGCCTCCCGTAGGAGT公司-3′，其中下划线的序列分别是27F和338R中的454个生命科学FLX测序引物B和A，粗体字母表示通用16S rRNA引物27F和388R。引物338R中的8 bp条形码用8个N表示。以等摩尔浓度汇集条形码扩增产物，并使用钛技术在Roche/454 FLX仪器（Branford，CT）上测序。QIME软件的组件（版本1.6.0）[41]用于根据序列的条形码对序列进行装箱，修剪引物和条形码，删除长度大于8bp、碱基调用不明确和/或短于150bp的均聚序列。此外，利用UCLUST的UCHIME成分检测嵌合序列[42]并去除嵌合序列。使用朴素贝叶斯分类器组合进行细菌分类分配[43]接受RDP数据库版本10的培训[43]和pplacer[40],[44]每个样本运行一次，因为我们过去的研究表明，重复的PCR扩增和焦磷酸测序步骤具有相对较低的变异性[40].
糖原测定
使用糖原检测试剂盒（加利福尼亚州米尔皮塔斯市BioVision）对生殖液样品中的游离糖原进行荧光测定。样品在冰上解冻并旋转10秒。将生殖液或生理盐水（用作空白）添加到96 well板中的4孔（10µl/孔）中。使用水解缓冲液将体积调节至50µl，无论是否使用水解酶（每个孔2个）。没有酶的微孔构成了葡萄糖背景。从最终读数中减去葡萄糖背景值，以确定糖原浓度。相对荧光单位（RFU）使用BioTek Synergy HT平板读取器（BioTeg Instruments，Inc，Winooski，VT）测量。
变量分类和统计分析
分析的解释性变量包括年龄、最高教育水平（高中以下、高中以上、大学或研究生学历）、年、当前吸烟状况（是与否）、体重指数（BMI）、过去6个月男性性伴侣数量、口服避孕药使用（是与不是）、，产次（0–1 vs.≥2）和输卵管结扎史（是vs.否）。BMI作为一个连续变量收集，并按照标准类别作为正常体重进行分析（18.5–24.9）；超重（25.0-29.9）和肥胖（≥30）。收集男性性伴侣总数作为连续变量；然而，在所有的研究访问中，26%的人报告说没有性伴侣，59%报告说有一个性伴侣，所以性伴侣的数量被分析为0个、1个或≥2个伴侣。乳酸杆菌从16S rRNA基因阴道微生物群分析中获得的相对丰度呈双峰分布，并将其分为≥85%和<85%；这一分类证明了Amsel标准确定的细菌性阴道病（BV）的含量有效性，其中，患有BV的女性的BV患病率为1.4%（1/69）乳酸杆菌相对丰度≥85%，而患有乳酸杆菌相对丰度<85%。糖原的分布呈现出明显的偏斜，任何转换（包括平方根、对数和指数转换）或标准化都无法改善这种偏斜。由于游离阴道糖原没有临床相关的切点，因此将糖原作为一个二元变量进行分析，对中位数（0.026µg/µl）进行二分法，并根据分布的四分位数（≤0.009；0.009–0.026；0.026–0.064；以及0.064–0.425µg/m l）分类使用切点。
在所有年度研究访问中，共有189个有效糖原和178个有效微生物群测量值。最终分析样本包括177个糖原和微生物组均未缺失的观察值。非正态分布连续变量的分布(乳酸杆菌sp.相对丰度，和阴道pH值）由糖原浓度的四分位数进行分析，使用等效于Kruskal-Wallis检验的方法，通过估计每四分位数糖原的聚类调整Somers D参数，并在所有四分位数中检验零关联的无效假设，调整重复测量的聚类[45]为了解释个体随时间的重复测量之间的相关性，我们使用具有可交换相关性结构的广义估计方程（GEE）来拟合互补对数回归模型，这是一种替代具有偏态分布的二进制响应的逻辑回归模型[46]GEE模型利用稳健方差估计（三明治估计）调整标准误差，以实现重复测量的非相关性。指数化系数产生的优势比与logit模型中的优势比具有相同的解释。确定可能混淆乳酸杆菌相对丰度和糖原，为了检查与糖原相关的因素，我们对糖原和乳酸杆菌相对丰度作为结果变量。单变量分析中p<0.2的变量以及根据先验的在多变量模型中输入假设；采用逐步方法为最终的多变量模型选择预测因子。在多变量分析中，具有统计学意义（p<0.05）的变量或被认为在概念上重要的变量保留在最终模型中。所有模型中都包含一个时间指标，以调整糖原和乳酸杆菌相对丰度。使用STATA 13.1版（德克萨斯州大学城STATA公司）对数据进行分析。
结果
相对丰度分布乳酸杆菌按糖原浓度
在8-11年的时间里，每年通过颈阴道灌洗从21名非洲-美国HIV血清阴性的女性中收集阴道液样本，平均每个受试者8.8个样本。1994-1995年，8/21（38%）受试者进行了索引访问，2001-2002年，13/21（62%）受访者进行了指数访问。受试者在指数研究访视中的特征总结如下指数访视时的中位年龄为28.5岁（范围18.6–40.0）。在指数访视中，29%的人超重，57%的人肥胖；66.7%的受试者是当前吸烟者。在所分析的177份样本中，11.3%的样本是在女性检测阳性时采集的阴道毛滴虫而2.8%的女性白色念珠菌，28.8%来自临床诊断为BV的女性（Amsel标准）。所有女性均无需进行HSV培养的可识别病变。阴道pH值中值为5.3（范围：4.0-7.0）。
表1
受试者在指数访视时的特征，N=21。
| n（%） |
|
年龄，中位数（范围）
| 28.5 (18–40) |
|
学历
| |
| 高中以下 | 6 (28.6) |
| 高中毕业生 | 8 (38.1) |
| 大专以上学历 | 7 (33.3) |
|
体重指数
| |
| 18.5–24.9（正常重量） | 3 (14.3) |
| 25.0–29.9（超重） | 6 (28.6) |
| ≥30（肥胖） | 12 (57.1) |
|
奇偶校验
| |
| 0–1 | 7 (33.3) |
| ≥2 | 14 (66.7) |
|
输卵管结扎术
| 2 (9.5) |
|
过去6个月口服避孕药
| 3 (14.3) |
|
当前吸烟情况
| 14 (66.7) |
|
过去6个月男性性伴侣数量
| |
| 0 | 3 (14.3) |
| 1 | 12 (57.1) |
| ≥2 | 6 (28.6) |
|
根据Amsel标准临床检测BV
| 5 (23.8) |
|
pH值中值（范围）
| 5.0 (4.0–7.0) |
在所有就诊期间，对21名女性中的每一位的游离糖原量进行了测量，范围为0至0.425µg/µl，中位数为0.026µg/m l(). 在个体水平检查时，一些女性的游离糖原水平持续偏低(例如，受试者6、8和21），而其他受试者随着时间的推移糖原水平保持在较高水平（例如受试者12和20）。然而，在大多数女性中，不同就诊时糖原浓度在相对较低和较高水平之间波动(例如受试者1和12）。
相对丰度分布乳酸杆菌通过糖原浓度。每年从21名8-11岁女性的阴道液中检测糖原水平。（A） 最终分析样本包括177个观察结果，糖原和乳酸杆菌.分配乳酸杆菌相对丰度是由糖原作为一个连续变量来概括的。（B） 相对丰度乳酸杆菌以及参与者的糖原浓度随时间的变化。左Y轴是相对丰度乳酸杆菌; 右Y轴是糖原浓度（µg/µl）。X轴是年度访问次数。
这个乳酸杆菌阴道标本的相对丰度为0～100%，呈双峰分布；平均值和中位数分别为45.9%和28.3%(). 两者之间有着强烈的积极联系乳酸杆菌相对丰度和游离糖原（Spearman r=0.48，p<0.001）。同样，在乳酸杆菌女性之间和女性内部的相对丰度(例如受试者8和16）。两者的相对丰度克氏乳杆菌和惰性乳杆菌在不同的访问中，女性和每个女性的波动也很大(图S1). 我们发现血糖水平与乳酸杆菌阴道液相对丰度（Spearman r=0.07，p=0.37；图S2A). 此外，阴道液中的游离糖原水平和葡萄糖之间没有显著相关性(图S2B).
接下来，我们确定哪些因素可能导致阴道液中糖原水平的变化。在单变量分析中，我们发现BMI≥30和有输卵管结扎史与糖原>0.026µg/µl的几率增加有关。此外，目前吸烟以及过去6个月内有1对0的男性性伴侣与糖原水平较低有关。相比之下，年龄、教育程度、胎次和口服避孕药的使用与糖原水平无关，人群中高糖原患者的比例也没有随时间变化().
表2
与高糖原相关的因素（>0.026µg/µl），N=177次就诊。
| 单变量OR*（95%置信区间） | p值 | 多变量OR*（95%置信区间） | p值 |
|
年龄（年）
| 1.02 (0.97–1.06) | 0.461 | – | – |
|
教育类
| | | | |
| 高中以下 | 1.0（参考） | – | – | – |
| 高中毕业生 | 1.67 (0.78–3.56) | 0.187 | – | – |
| 大专以上学历 | 1.18 (0.56–2.52) | 0.660 | – | – |
|
体重指数
| | | | |
| 18.5–24.9 | 1.0（参考） | – | – | – |
| 25.0–29.9 | 1.57 (0.79–3.11) | 0.196 | 1.50 (0.69–3.24) | 0.307 |
| ≥30 | 2.10 (1.02–4.32) | 0.045 | 2.21 (0.98–5.02) | 0.057 |
|
奇偶校验≥2 vs.0–1
| 2.10 (0.86–5.13) | 0.106 | – | – |
|
输卵管结扎术
| 1.75 (1.07–2.87) | 0.025 | – | – |
|
口服避孕药的使用
| 1.31 (0.66–2.60) | 0.444 | – | – |
|
当前吸烟情况
| 0.53 (0.32–0.89) | 0.016 | – | – |
|
男性性伴侣，过去6个月
| | | | |
| 0 | 1.0（参考） | – | 1.0（参考） | – |
| 1 | 0.48 (0.28–0.85) | 0.011 | 0.46 (0.27–0.80) | 0.006 |
| ≥2 | 0.76 (0.41–1.41) | 0.384 | 0.77 (0.38–1.55) | 0.259 |
|
访问
| 0.98 (0.92–1.04) | 0.536 | 0.97 (0.90–1.04) | 0.357 |
因为阴道上皮细胞的糖原表达被认为受到雌激素水平变化的影响[47]，我们检查了游离糖原水平是否根据自我报告的月经周期的四分位数而变化，但发现它们在月经周期的不同阶段没有显著变化(图S3).
在多变量分析中，过去6个月内有1对0男性性伴侣与高糖原发生率较低相关（aOR 0.46；95%CI 0.27–0.80）；男性伴侣≥2对0之间的相关性在统计学上不显著（aOR 0.77；0.38–1.55）。BMI≥30与高糖原发生率增加略有关联（aOR 2.21；95%CI 0.98–5.02；).
高游离糖原与以乳酸杆菌阴道pH值低
因为微生物群主要由乳酸杆菌与感染/传播性传播感染（STI）的可能性降低和妊娠结局改善相关[13]，16S rRNA基因的焦磷酸测序用于确定乳酸杆菌.当根据糖原浓度的四分位数进行分析时，乳酸杆菌游离糖原含量最高的样品中含量最高[中位数相对丰度=0.97（IQR 0.31-0.98），]在游离糖原含量最低的样品中显著降低[中位数相对丰度=0.05（IQR 0.00–0.22），p<0.001]。
高水平的游离糖原与以乳酸杆菌物种和低阴道pH值。最终分析样本包括177个观察结果，糖原和乳酸杆菌如图所示，游离糖原作为一个二元变量进行分析，将中位数二分法，并根据分布的四分位数使用切点进行分类。分布乳酸杆菌相对丰度（A）和阴道pH值（B）通过糖原四分位数总结为连续变量*p值通过扩展Kruskal-Wallis检验进行估计，并对重复测量中的聚类进行调整。
因为阴道pH值低（≤4.5）被认为是与乳酸杆菌殖民化[5],[6],[13],[48]，我们通过四分之一的糖原浓度检查阴道pH值。阴道pH值随着糖原浓度的增加而降低，从糖原浓度最低的样品的中位数5.8（IQR 5.5-6.1）降至糖原浓度最高的样品的中位数4.4（IQR4.0-5.3）（p<0.001；). 正如预期的那样，在具有乳酸杆菌相对丰度≥85%(图S4).
177份样本中有20份为阳性毛滴虫属，的毛滴虫属+样本中的乳酸杆菌（中位数=0.14）与无毛滴虫属（中值=0.34，p=0.02）。然而，糖原在毛滴虫属+与。毛滴虫属–样本。
确定哪些因素与高乳酸杆菌相对丰度（≥85%），因此临床诊断BV的发病率较低（1.4%；见方法），进行单变量分析。除了较高的糖原水平外，教育、BMI 25-29.9和口服避孕药的使用都被发现与乳酸杆菌相对丰度≥85%(). 相反，拥有较近期的男性性伴侣的几率较低乳酸杆菌相对丰度。时间、年龄、胎次、输卵管结扎史和当前吸烟与乳酸杆菌相对丰度。在控制教育、BMI和口服避孕药使用的多变量分析中，糖原水平与乳酸杆菌相对丰度().
表3
相关因素乳酸杆菌≥85%，N=177次就诊。
| 单变量OR*（95%置信区间） | p值 | 多变量OR*（95%置信区间） | p值 |
|
糖原，µg/µl
| | | | |
| ≤0.009 | 1.0（参考） | – | 1.0（参考） | – |
| <0.026 | 1.68 (0.63–4.48) | 0.298 | 2.57 (1.07–6.17) | 0.035 |
| <0.064 | 3.36 (1.24–9.16) | 0.018 | 5.87 (1.90–18.1) | 0.002 |
| 0.064–0.425 | 8.15 (2.86–23.2) | <0.001 | 25.2 (7.08–89.8) | <0.001 |
|
就诊时的年龄
| 1.01 (0.94–1.08) | 0.873 | – | – |
|
教育类
| | | | |
| 高中以下 | 1.0（参考） | – | 1.0（参考） | – |
| 高中毕业生 | 1.20 (0.38–3.77) | 0.754 | 1.92 (0.26–14.3) | 0.523 |
| 大专以上学历 | 3.39 (1.24–9.29) | 0.017 | 8.12 (1.09–60.4) | 0.041 |
|
体重指数
| | | | |
| 18.5–24.9 | 1.0（参考） | – | 1.0（参考） | – |
| 25.0–29.9 | 2.36 (1.19–4.67) | 0.014 | 3.11 (1.31–7.37) | 0.010 |
| ≥30 | 1.30 (0.53–3.23) | 0.565 | 0.90 (0.32–2.48) | 0.834 |
|
奇偶性≥2对0–1
| 1.20 (0.40–3.61) | 0.751 | – | – |
|
输卵管结扎术
| 1.75 (0.78–3.94) | 0.173 | – | – |
|
口服避孕药的使用
| 3.05 (1.48–6.29) | 0.002 | 12.8 (4.31–38.2) | <0.001 |
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当前吸烟情况
| 0.56 (0.26–1.21) | 0.139 | – | – |
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男性性伴侣，过去6个月
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| 0 | 1.0（参考） | – | – | – |
| 1 | 0.47 (0.27–0.82) | 0.008 | – | – |
| ≥2 | 0.51(0.24–1.08) | 0.078 | – | – |
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访问
| 0.99 (0.90–1.10) | 0.883 | 1.01 (0.90–1.12) | 0.904 |
糖原与不同物种的关系乳酸杆菌
主要物种乳酸杆菌已知在女性生殖道定居，克氏乳杆菌和詹森氏乳杆菌被认为是最具保护性的内陆乳杆菌和加塞里乳杆菌可能对阴道病原体的保护作用较弱[13]当这些相对丰度乳酸杆菌对所有样本中的物种进行了评估，内陆乳杆菌被发现是最主要的物种，其次是克氏乳杆菌().
相对丰度乳酸杆菌按糖原浓度分类的物种。如图所示，游离糖原作为一个二元变量进行分析，将中位数二分法，并根据分布的四分位数使用切点进行分类。The distribution of乳酸杆菌物种相对丰度以糖原作为连续变量，以糖原四分位数表示。阴影部分表示四分位范围，水平条表示中位数，胡须表示95%的置信区间*使用Kruskal-Wallis检验的扩展，并对重复测量中的聚类进行调整，p<0.05。
有趣的是惰性乳杆菌在糖原类别之间没有显著差异，从最低游离糖原浓度时的中位数0.03（IQR 0.00–0.129）增加到最高糖原浓度下的0.142（IRR 0.002–0.926）（p=0.125；). 相反，克氏乳杆菌游离糖原浓度最低和最高时，相对丰度分别从中位数0.00（IQR 0.00–0.001）显著增加到0.002（IRR 0.00-0.753）（p=0.011）。詹森氏乳杆菌和加塞里乳杆菌每种微生物都占所有微生物群的2%以下，但只有詹森尼乳杆菌游离糖原浓度不同，其水平也有显著差异().
讨论
通过测量阴道上皮中的糖原沉积，早期研究者注意到青春期前女孩中没有糖原，青春期后女性中出现糖原，绝经后女性上皮内糖原水平较低[30],[31]糖原的出现与阴道定植同时发生乳酸杆菌阴道pH值下降[30],[31]这些观察结果导致了这样一种假设，即乳酸杆菌可以利用糖原作为能量来源，在内腔中生长并产生大量乳酸，这是乳酸杆菌促进阴道健康的能力的关键[5],[6],[12],[48].
我们通过量化生殖器液中可供利用的游离糖原数量来推进这些研究乳酸杆菌物种。然后我们评估了糖原与乳酸杆菌相对丰度用分子方法测量生殖器细菌组成的比例乳酸杆菌因为培养方法不能准确报告生殖器细菌的数量。我们观察到阴道液中的游离糖原水平与生殖微生物群的比例密切相关，生殖微生物群包括乳酸杆菌这些观察结果具有潜在的医学意义，因为女性下生殖道中的乳酸杆菌对阴道健康有重大影响，包括抵抗性STI和预防妊娠并发症[13],[48]因此，我们的数据表明，生殖器分泌物中的糖原量可以显著影响乳酸杆菌物种定殖。
令人惊讶的是，我们发现女性体内的游离糖原水平存在很大差异，甚至同一女性在不同时间的游离糖元水平也存在很大差异。样本每隔一年采集一次，目前尚不清楚在较短的时间内发生了何种程度的变化。这种变化可能很重要，因为可用糖原的这种波动可能会深刻影响乳酸杆菌物种定殖。我们推测，长期和/或持续的低游离糖原可用性可能会使女性面临细菌性阴道病的风险，以及STI的获得和潜在传播风险[49].
为了研究这种差异的原因，我们利用自我报告的末次月经日期将糖原与月经周期相比较，因为在不同发育阶段（青春期前、青春期、更年期）阴道上皮糖原的变化已经有一段时间了；从而提示雌激素参与糖原的表达[47]有趣的是，观察到的游离糖原水平的变化似乎并不是由于激素的变化，因为据报道，在月经周期的不同阶段，自上次月经以来的几天与游离糖原的高水平没有显著相关性().
有可能是对最后一次月经的误报掩盖了这种关系。然而，Gregoire等人报告称，水解阴道活检中定量的糖原与月经周期相关的激素变化无关[50]表明雌激素和糖原之间存在脱节。此外，在接受双侧卵巢切除术的女性阴道涂片的细胞中检测到大量糖原[51]以及一项对绝经后女性的研究[52]另一方面，通过显微镜观察，雌激素的使用导致阴道上皮增厚，含糖原脱落的阴道细胞数量和细胞中糖原的数量增加[52],[53].其他来源（如脂肪细胞）如何产生雌激素[54])可影响游离糖原水平尚待测定。研究人员还观察到，在服用Depoprovera后的3个月内，阴道活检中含有糖原的上皮厚度出现了微小但显著的下降[33]; 然而，在给予Depoprovera 12个月后，含糖原上皮的厚度没有显著差异[55].
这些发现强调了对雌激素进行近距离纵向测量的必要性，以便更明确地研究雌激素和游离糖原水平之间的联系。
这可能很困难，因为在月经周期中，雌激素水平在几天内变化多达10倍[56]游离糖原的任何变化都可能滞后于雌激素的快速上升（或下降）数天。雌激素可能会增加每个细胞的上皮内糖原沉积，和/或导致含有糖原的上皮厚度增加。然而，这些变化可能对阴道液中的游离糖原水平影响不大。相反，含糖原的上皮细胞脱落的速度、含糖原量以及释放糖原的速度可能是游离糖原的更重要因素。
对女性之间观察到的游离糖原变化的另一种可能的解释可能是，糖原被不同类型的微生物群或宿主衍生的因素不同地利用或降解。我们发现，游离糖原含量最高的女性的微生物群主要由乳酸杆菌物种。因此，如果退化解释了变化，这将表明乳酸杆菌物种不能利用或降解游离糖原，而微生物群乳酸杆菌该物种能够利用糖原进行生长。然而，考虑到糖原和乳酸杆菌在性发育过程中发现了相对丰富的物质，并且女性不太可能产生一种物质来促进非-乳酸杆菌微生物群，而不是乳酸杆菌因此，糖原的变化很可能是由于上皮细胞产生或释放的变化。或者，根据许多在体外研究表明，乳酸杆菌利用糖原的能力可能取决于环境的pH值[36]，和/或特定乳酸杆菌物种[36],[37].最近的经文组学分析内陆乳杆菌表明表达了一些糖苷酶和麦芽糖转运蛋白体内这种细菌可能参与糖原的利用[57].
营养可能是影响游离糖原浓度的另一个因素。众所周知，摄入碳水化合物会增加肝脏和肌肉细胞中的糖原水平[58],[59]在我们的分析中，我们发现BMI≥30与高糖原发生率的增加有关，尽管这种关系仅略微显著。相比之下，Willson等人。[52]，发现绝经后妇女碳水化合物摄入量的增加不会显著改变阴道涂片中糖原阳性细胞的数量。
在这项研究中，虽然游离糖原水平变化很大，但样品中的中间水平约为0.026µg/µl。考虑到这些样品是通过灌洗收集的，因此被稀释了大约30倍[60]，未稀释生殖液中糖原的实际中位数浓度估计约为1µg/µl。这只相当于阴道液中约0.1%的碳水化合物。粘膜液中可能会利用和/或将糖原降解为较小的含葡萄糖聚合物。因此，碳水化合物的浓度可能高于0.1%，相应地影响乳酸杆菌阴道中的物种。
与其他研究类似[61]–[63],内陆乳杆菌被发现是最普遍的乳酸杆菌该类群中的物种(). 在不同的乳酸杆菌分析的物种，詹森氏乳杆菌和克氏乳杆菌游离糖原浓度高的样品中的水平明显较高(). 这是一个重要的发现，因为它表明这两个人的殖民化乳酸杆菌物种-被认为可能是最具保护性的[13]-在糖原水平较高时更受欢迎。
然而，有趣的是，内陆乳杆菌“与糖原水平较低的样品相比，糖原水平较高的样品的相对丰度并没有显著升高，这可能是由于受试者之间的高度变异性所致(). 与其他报告类似[61]，我们还发现样品中含有50%以上内陆乳杆菌pH值相对较高（中位数=4.4）克氏乳杆菌（中位数=4，p=0.03）。通过不同途径利用糖原的能力乳酸杆菌因此，物种可能会影响这些细菌的乳酸生成，从而导致阴道pH值的差异，并赋予不同程度的保护。
阴道定植乳酸杆菌物种和低阴道pH值可以降低STI、BV和早产的风险。因此，理解和支持一个可以通过以下方式促进殖民化的环境乳酸杆菌物种是维持阴道健康的关键。本文提供的数据确定游离糖原是与乳酸杆菌生育年龄女性的相对丰度和阴道pH值较低。我们没有发现拥有≥2个男性性伴侣与0个男性性伙伴之间的相关性具有统计学意义，这可能是因为报告≥2个性伴侣的组样本量较小。
这项研究有几个局限性。首先，这项研究中的所有女性都是非裔美国人。因此，这里测量的游离糖原水平是否代表其他种族/民族背景尚不确定。评估不同种族人群的游离糖原水平是很重要的，因为研究表明，不同种族的女性的微生物群组成可能不同[61]第二，应该注意的是，本研究中细菌的相对丰度是通过使用16S rRNA基因焦磷酸测序的V1-V2引物来评估的，这可能会导致某些属的过度或不足。阴道毛滴虫，一种已知是阴道中关键成员的细菌，在本研究中可能未得到充分表达，因此阴道阿托波氏菌可能代表人数过多[64]; 然而，任何引物集都有偏差。比较由其他焦磷酸测序方法测定的游离糖原水平与阴道微生物群的关系将很有趣。
综上所述，我们的数据表明，持续低水平的游离糖原可能会增加女性发生与低水平相关的不良医疗结果的风险乳酸杆菌水平。此外，由于乳酸杆菌提供不同程度的保护，我们的研究对如何实现更有益的乳酸杆菌定植具有重要意义。这些研究指出了了解影响游离糖原水平的生物因素的重要性，并进一步表明，设计增加和维持高游离糖原的干预措施可能会对女性健康产生积极影响。
支持信息
图S1
相对丰度
乳酸杆菌
参与者随时间变化的糖原种类和浓度。左Y轴是相对丰度克里斯帕特乳杆菌、伊内斯乳杆菌、詹森乳杆菌和加塞乳杆菌; 右Y轴是糖原浓度（µg/µl）。X轴是年度访问次数。
（畅通节能法）
图S2
葡萄糖的分布
乳酸杆菌
和糖原。每年从21名8-11岁女性的阴道液中测量葡萄糖和糖原水平。最终的分析样本由177个观察值组成，所有变量的值均未缺失。The distributions of乳酸杆菌相对丰度（A）和糖原（B）以葡萄糖作为连续变量进行总结。
（畅通节能法）
图S3
末次月经后糖原浓度（LMP）。阴影部分表示四分位范围，水平条表示中位数，胡须表示95%的置信区间。N=149，不包括6次报告更年期或妊娠的就诊和19次LMP>50天的就诊。
（畅通节能法）
图S4
pH值依据
乳酸杆菌
相对丰度≥85 vs.<85%。
（畅通节能法）
致谢
我们要感谢Supriya Mehta博士的有益讨论。
数据可用性
作者确认，研究结果所依据的所有数据都是完全可用的，没有任何限制。所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。
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