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实验神经学。作者手稿；PMC 2014年7月10日发布。
以最终编辑形式发布为：
实验神经学。2006年10月；201(2): 416–427.
2006年6月21日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.expneuro.2006.04.031
预防性维修识别码：项目经理4090707
NIHMSID公司：尼姆斯343953
PMID：16793040

毛果芸香碱诱导癫痫持续状态后小鼠齿状回星形胶质细胞的变性和增殖

卡林·博尔赫斯,a、，日期：，* 戴娜·麦克德莫特,a、，c（c） 哈桑·伊雷尔,一 尤兰·史密斯,b、，c（c）和雷蒙德·丁莱丁一
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

与神经元和少突胶质细胞相比，星形胶质细胞对损伤具有相对的抵抗力。在此，我们报告了毛果芸香碱诱导癫痫持续状态（SE）后早期小鼠星形胶质细胞的短暂区域特异性丢失。毛果芸香碱诱导SE后1天和3天，齿状门胶质酸性纤维蛋白（GFAP）免疫反应性降低，健康出现的GFAP或S100β阳性细胞数量显著减少（≥65%），SE电子显微镜显示门部有大量电子密度的变性星形胶质细胞突起和变性胶质细胞体。GFAP表达细胞的退化可能与肺门神经元的死亡有关，因为我们没有观察到在红藻氨酸诱导的SE后星形胶质细胞的丢失，之后肺门神经元保持完整。SE后10天，门部GFAP免疫反应性恢复，部分来自门部GFAP阳性细胞。与对照组小鼠不同，许多GFAP阳性的肝门突起起源于颗粒下区（SGZ）的细胞体。为了研究增殖是否有助于肝门的重新填充，我们在SE后3天注射5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）。SE后5小时至31天，在肝门和SGZ中发现了许多BrdU/GFAP共标记细胞，一些有肝门突起，表明这两个区域的增殖都有助于肝门星形胶质细胞和星形胶质细胞突起的生成。与毛果芸香碱诱导的小鼠SE相比，毛果芸香碱诱导的大鼠SE后未发现星形胶质细胞变性。这些发现表明，在小鼠匹罗卡品癫痫模型中，小鼠齿状门的星形胶质细胞变性，随后星形胶质细胞发生导致门部重新聚集。

关键词：干细胞，癫痫，肝门，Kainate，胶质纤维酸性蛋白，成体祖细胞，小鼠株

介绍

星形胶质细胞在健康和受伤的中枢神经系统中，在谷氨酸和钾的摄取、生长因子、细胞因子和细胞外基质蛋白的产生中发挥着许多重要作用(Kettenmann和Ransom，2004年). 在过去的十年中，越来越清楚的是，星形胶质细胞和神经元通过化学方式进行交流（例如，在纽曼，2003). 最近的一项研究表明，星形胶质细胞中的钙波可以触发星形胶质细胞释放谷氨酸，导致阵发性去极化偏移(Tian等人，2005年)，发作间期活动中观察到异常的长时间去极化。损伤或癫痫持续状态（SE）后的神经胶质增生以反应性星形胶质细胞过度表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）为标志(Eng等人，1992年). 与神经元和少突胶质细胞相比，这两种细胞都非常容易在缺血期间发生谷氨酸介导的死亡(Petito等人，1998年)，星形胶质细胞相对抗损伤。然而，注射“胶质毒性”药物，包括3-氯丙二醇，可以选择性地损伤星形胶质细胞(威利斯等人，2004年)，乌头酸酶抑制剂氟柠檬酸盐(Paulsen等人，1987年)或6-氨基烟酰胺（参见克鲁姆，1994以及其中的参考）。此外，在亨廷顿病的早期阶段发现了凋亡的星形胶质细胞(托马斯等人，1995年). 在发育过程中和整个成人生活中，粒下区（SGZ）中的神经干细胞增殖并生成神经元（在Gage等人，1998年;家长，2003;Kempermann等人，2004年;Lie等人，2004年)以及在较小程度上的星形胶质细胞(Palmer等人，2000年;坎佩曼和盖奇，2002年;Steiner等人，2004年). 在体外和体内使用GFAP基因控制的绿色荧光蛋白表达进行谱系追踪表明，成年神经前体细胞表达GFAP，早期具有放射状胶质细胞的形态（例如。，Seri等人，2001年,2004;Garcia等人，2004年). 癫痫发作后，颗粒下成体干细胞的增殖促进神经发生(Bengzon等人，1997年;Parent等人，1997年;Scott等人，2000年;Ferland等人，2002年;Huttmann等人，2003年)但据我们所知，癫痫发作后星形细胞生成是否也增强尚不清楚。

众所周知，癫痫会诱导星形胶质细胞中GFAP的过度表达（胶质增生症）；在一些模型中，描述了星形胶质细胞的增殖和肿胀(Nadler等人，1980年;Niquet等人，1994年,Nitecka等人，1984年). 只有少数研究报告了动物模型SE后星形胶质细胞变性的证据(Motte等人，1998年;Revuelta等人，2005年)而且可能在人类身上(Gurnett等人，2003年).

在研究小鼠毛果芸香碱模型的神经病理学时，我们发现SE后10至31天，包括齿状门在内的表现出神经元损伤的区域出现反应性星形胶质细胞(Borges等人，2003a). 我们现在在光镜和电镜水平上提供了证据，证明SE后1至3天，小鼠肝门中的许多星形胶质细胞退化。我们研究了3至31天期间肝门星形胶质细胞重新聚集的机制。5溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）标记显示SE后3～7天肝门和SGZ的星形胶质细胞增殖增强。此外，SE后1周，肝门GFAP-和S100β-的过程通常起源于SGZ内或附近的细胞体，其中一些是BrdU标记的，提示SGZ中的星形胶质细胞发生有助于随后门与星形胶质细胞的重新聚集。一些结果以抽象形式呈现(Borges等人，2003b).

材料和方法

毛果芸香碱注射按长白CF1小鼠的描述进行(Borges等人，2003a,2004). 简言之，在匹罗卡品（275–310 mg/kg，i.p.）注射前15–30分钟，向小鼠注射甲基东莨菪碱和特布他林（0.9%NaCl中每个i.p.注射2mg/kg），以将外围副作用降至最低。30%的CF1注射小鼠经历了约5小时的行为SE，这是由主要由全身阵挛性发作组成的持续行为发作活动定义的（参见Borges等人，2003a更多关于癫痫发作行为的详细描述，包括改良的Racine量表）。表现出行为性癫痫发作少于1小时的小鼠被用作“无SE对照”组。对照小鼠接受特布他林和甲基东莨菪碱，但不接受毛果芸香碱。

我们还从两个不同来源的两个近交129亚系（骨桥蛋白缺乏小鼠的野生型对应物）中诱导了毛果芸香碱诱导的癫痫发作。129只小鼠，来自AB2.1小鼠干细胞，来自Susan Rittling博士(Rittling等人，1998年)此处命名为129（AB2.1）和129/Sv（Taconic，Hudson，NY）小鼠，取自Lucy Liaw博士(Liaw等人，1998年)此处称为129/SvTac。向11只129（AB2.1）小鼠（19–31 g）注射270–310 mg/kg毛果芸香碱（i.p.），诱导10只小鼠出现SE，其中7只小鼠存活SE。1只小鼠没有出现SE。5只小鼠在接受260 mg/kg毛果芸香素（i.p.）后没有出现SE，它们被用作“无SE对照”组。向八只129/SvTac小鼠注射240 mg/kg毛果芸香碱（i.p.），导致三只小鼠出现SE，四只小鼠（“无SE对照”组）没有SE，一只死亡。

之前的研究使用了重复注射红藻氨酸诱发SE的CF1小鼠切片(Borges等人，2004年). 简单地说，每30分钟注射一次红藻氨酸（5–20 mg/kg，在磷酸盐缓冲盐溶液中腹腔注射），直到达到SE。行为性SE 4~5小时后，通过注射25 mg/kg戊巴比妥（i.p.）终止癫痫发作。在第14天到第35天之间，对三只小鼠进行长达27小时的潜在自发行为发作录像。

Sprague Dawley大鼠（150–220 g，Charles River）在注射甲基东莨菪碱和特布他林前19–24 h注射127 mg/kg氯化锂（0.9%NaCl中每个腹腔注射2 mg/kg），20 min后注射匹罗卡品（30 mg/kg，腹腔注射。，Clifford等人，1987年). 在一些大鼠中，不使用锂，并给予340 mg/kg匹罗卡品。锂/匹罗卡品注射大鼠在SE 90分钟后终止SE，或匹罗卡因注射大鼠2.5小时后通过注射20–25mg/kg戊巴比妥（i.p.）终止SE。SE后，所有动物均喂以湿润的啮齿类食物，并根据需要在乳酸林格溶液中注射5%葡萄糖。对照组大鼠用生理盐水代替毛果芸香碱。

为了标记门部的增殖细胞，在SE后3天一次性注射5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU，100 mg/kg，i.p.，Sigma）。在注射BrdU后的不同时间点，即5 h（SE后3天后的4只小鼠和3只对照小鼠）、4 d（SE后的3只对照鼠和5只小鼠）、，7天（三只小鼠在SE后10天）和28天（三只小鼠在SE后31天）。所有实验均由埃默里大学动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并按照其指导方针进行。尽一切努力减少动物的痛苦。

在氟罗烷麻醉下斩首后，取下大脑，用4%多聚甲醛固定，并嵌入石蜡块中。将8微米厚的脑切片去石蜡化，用正常血清封闭，然后用针对星形胶质细胞标记物GFAP的一级抗体（兔抗w-GFAP，Dako Inc.，加利福尼亚州Carpintaria，1:500）孵育，然后用物种特异性生物素化二级抗体孵育，亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，根据制造商（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）和0.6 mg/ml 3,3′-二氨基联苯胺（DAB）/0.03%过氧化氢和苏木精复染显色。

对于用细胞特异性抗体进行BrdU双重标记，我们在pH6.0的1mM柠檬酸钠缓冲液中微波切片后使用荧光免疫组化。用单克隆小鼠抗BrdU抗体（BD Pharmingen，San Diego，CA；1:100）以及兔抗GFAP（Dako，1:500）、兔抗S100β（Swant，Bellinzona，Switzerland，1:50）或山羊抗双皮质激素抗体（C-18，1:100，Santa Cruz Biotechnologies Inc.，Santa Cruz，CA）孵育切片。为了可视化，使用了CY3-结合的山羊抗兔抗体（Dako，1:400用于GFAP可视化）和生物素化马抗鼠抗体，然后使用了链霉亲和素结合的CY2（Dako1，1:200，用于BrdU）。或者，我们使用FITC-标记的驴抗鼠抗体（用于显示BrdU）和生物素化羊抗兔抗体（用于S100β）或生物素化兔抗羊抗体，然后使用链霉亲和素结合的CY3（1:200，用于双皮质激素）。所有生物素化抗体均来自Vector Labs，并以1:200的稀释度使用。使用小胶质标记物进行BrdU双重标记单叶灰树异凝集素B4，切片首先用胃蛋白酶（加利福尼亚州福斯特城Biomeda公司）预处理10分钟，然后如上所述进行微波处理。BrdU抗体与生物素化抗体一起孵育单叶木隔离素B4（Sigma，1:40）过夜，用CY2标记的驴抗鼠抗体（1:100，用于BrdU）和链霉亲和素结合的CY3（1:200，用于凝集素）进行可视化。在所有荧光染色中，细胞核用Hoechst 33258染色（分子探针，尤金，俄勒冈州）。所有其他荧光试剂均来自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.（宾夕法尼亚州西格罗夫）。

到脑角的截面在−2.1和−2.5 mm之间（对应于背海马，Hof等人，2000年)用于计数。计算门和齿状分子层总面积内的细胞数（有关面积的定义，请参阅图2A). 门被定义为齿状颗粒细胞和垂直于CA3c锥体细胞层顶端的线之间的区域。计算肺门细胞时，不包括沿齿状颗粒细胞层位于肺门边缘区域的SGZ，其直径约为一个细胞。颗粒细胞层外与海马裂交界的区域被定义为分子层。

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毛果芸香碱诱导SE后齿状门选择性星形胶质细胞死亡取决于诱导SE的种类和方法。肺门区位于包含齿状颗粒细胞的两个叶片和垂直于CA3锥体细胞层末端的黑线之间。分子层（ML）位于颗粒细胞层（GC）外，由黑线包围。毛果芸香碱诱导SE后不同时间每8µm背海马切片中健康GFAP阳性细胞的平均细胞数和标准误差(n个=4–5只CF1小鼠），用于显示门突的齿状分子层（B，三角形）、门（B，方形）和颗粒下星形胶质细胞（C）。SE后1天和3天肝门健康GFAP表达细胞的数量显著下降，但齿状分子层没有下降（单向方差分析，随后进行事后Dunnett检验）。SE后10天和31天，具有肺门突起的颗粒下细胞数量显著增加（单因素方差分析，随后进行事后Dunnett检验）。所有比较均与对照组小鼠相关**P（P）< 0.01. （D–F）重复注射红藻氨酸（D）诱导的SE约4 h后3天，CF1小鼠、对照大鼠（E）和毛果芸香碱（F）诱导的SD约2.5 h后2天，门的代表性GFAP免疫染色（棕色）。注意，表达GFAP的细胞在所有三个切片中看起来都是健康的（粉红色箭头）。SE后，大鼠（F）的肝门神经元（黑色箭头）数量减少，但在kainate诱导的SE后，小鼠没有减少。绿色箭头指出了一些萎缩的GFAP阴性细胞，很可能是濒临死亡的神经元。切片用苏木精复染，比例尺为50µm。（对于本图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的网络版。）

非荧光切片通过直接显微镜检查计数。用蓝色苏木精染色法对其大的胞体和几个深色核仁进行鉴定。在至少两个随机选择的切片中，对每只小鼠的GFAP阳性细胞和浅蓝色苏木精染色的圆形细胞体（定义为“健康”）的数量进行计数。对于BrdU与GFAP或doublecortin的荧光双重染色，我们使用蔡司LSM 510型共焦显微镜，氩（488-nm激发）和氦/氖（543-nm激发）激光，以及使用钛蓝宝石（755nm）激光对Hoechst染料进行双光子激发。蔡司AIM软件通过z（z）-每个8-µm截面的轴，增量为0.4–1.5µm。使用40×、63×或100×油浸物镜对每只小鼠至少四个肺门切片进行GFAP/BrdU染色。在一些z切片中，环绕或邻近GFAP免疫反应的BrdU阳性核被计数为GFAP阳性。首先通过光学显微镜选择双皮质激素/BrdU双染色，然后对典型的双染色细胞和典型的BrdU阳性、双皮质激素阴性细胞进行成像。在共聚焦切片中，无法区分“健康”核和收缩核。此外，细胞计数是半定量的，因为切片只有8微米厚。对于BrdU与S100β或凝集素的荧光双重染色，使用20×和40×物镜的Leitz荧光显微镜和Leica数码相机拍摄BrdU、S100β、凝集素和核标记的图像，并将其叠加在Photoshop中。S100β/BrdU双染色在计算机屏幕上计数（每只小鼠1–3个切片，n个＝5只小鼠）。对每只小鼠的细胞计数进行平均，并使用单因素方差分析在治疗组之间进行比较，然后使用选定配对的Bonferroni事后检验或相对于对照的Dunnett多重比较检验*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. 给出了一组小鼠的平均误差和标准误差（SEM）。

对于电镜检查，SE后1天，用过量的氯胺酮（75 mg/kg）和美托咪定（多米托，0.5 mg/kg）对小鼠进行麻醉，然后用冷林格溶液灌注，然后在pH 7.4的0.1M磷酸盐缓冲液中加入250 ml含有4%多聚甲醛和0.1%戊二醛的固定剂。然后用振动棒将大脑切割成60µm厚的切片。切片在1%四氧化锇中后固定，在一系列分级的乙醇/环氧丙烷中脱水，并嵌入显微镜载玻片上的树脂（Durcupan，Fluka）中。在60°C下树脂硬化48小时后，将小鼠齿状回的组织块粘在树脂块上。在超薄切片机上切割超薄切片，收集在铜单槽网格上，用柠檬酸铅染色，并用电子显微镜检查（蔡司，EM 10C）。用于对该材料中元素进行分类的超微结构特征如Peters等人（1991年）.

结果

毛果芸香碱诱导SE后1-3天，小鼠齿状门星形胶质细胞变性

毛果芸香碱诱导SE后不同时间石蜡切片的GFAP免疫染色(图1A–D)11只小鼠中有10只在SE后1至3天肝门处出现GFAP标记缺失(图1A–C). SE后1天处死的五只小鼠中只有一只表现出与对照小鼠相似的丰富的GFAP标记。相反，齿状分子层星形胶质细胞中GFAP的表达似乎没有变化或略有上调。肺门GFAP免疫反应性的丧失是暂时的，因为毛果芸香碱诱导SE后10天，肺门含有许多GFAP过度表达的突起和细胞(图1D). SE后1天和3天，我们观察到门部苏木精染色的细胞核通常变暗和萎缩，这是典型的固缩细胞，并且与短GFAP表达过程相关，表明门部星形胶质细胞可能正在退化(图1B、C，底部插图）。相反，在对照组小鼠中，大多数GFAP表达突起较长（>5µm），与圆形或豆形淡蓝色染色的躯体有关，被定义为“健康”(图1A，插图）。在对照小鼠中，在距前体−2.1和−2.5毫米之间的部分（对应于背侧海马，Hof等人，2000年)在每8µm切片的肝门中发现21.7±1.9个苏木精染色的健康细胞核，与GFAP免疫反应相关（平均值±SEM，n个＝5只小鼠）。SE后1天和3天，仅7.7±2.2(n个=5）和8.9±3.1(n个=4）发现了GFAP阳性细胞，表示健康肺门GFAP阳性的细胞减少了59-65%(图2B正方形，P（P）< 0.01). 服用匹罗卡品但未出现SE的小鼠在3天后未出现肝门星形胶质细胞丢失（22.3±0.5肝门GFAP阳性细胞，n个= 4). 这表明毛果芸香碱诱导的SE，而不是药物本身，导致GFAP训练的丧失。同样，星形胶质细胞标志物S100β的免疫反应在门部消失；SE后3天，平均69%的肝门S100β阳性细胞丢失(图1E、F、黄色箭头、，n个=4只小鼠）。相反，在齿状分子层中，表达GFAP的星形胶质细胞数量在SE后1至3天略有增加，但不显著(图1C上镶嵌，图2B三角形），表明星形胶质细胞丢失在齿状回中具有区域特异性。此外，齿状分子星形胶质细胞对GFAP和S100β的过度表达以及更坚固的形态表现出反应性(图1C鞋面镶嵌和图1F). SE后6小时，许多肺门神经元丢失(Borges等人，2003a)，但GFAP阳性细胞含有健康的细胞核，肺门健康的GFAP-阳性细胞数量与对照小鼠相似(图2B，平方），表明星形胶质细胞在神经元损伤后发生变性。SE后10天，具有肝门突的亚颗粒星形胶质细胞突出(图1D，箭头），它们的数量在31天时仍然很高(图2C,P（P）<0.01).

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毛果芸香碱诱导SE后，CF1小鼠肝门GFAP（A–D）和S100β（E，F）的免疫反应性暂时降低。对对照小鼠（A）和SE后1、3和10天的小鼠（B–D，如右下角所示）的齿状回石蜡切片进行GFAP免疫染色（棕色），并用苏木精（蓝色）进行复染。（A） 黑色箭头指向通过大小和核仁识别的肺门神经元，粉红色箭头指向包含椭圆形或圆形淡蓝色细胞核的代表性星形胶质细胞，定义为健康（插图中放大）。（B，C）毛果芸香碱诱导SE后1天和3天，肝门GFAP免疫反应性消失。剩余的GFAP表达细胞主要包含深色和收缩的细胞核（固缩的粉红色箭头，底部插图中放大），只有短的GFAP阳性突起。齿状分子层中的GFAP阳性细胞是健康的，在SE后3天GFAP过度表达（C，上部插图）。（D） SE后10天，GFAP标记的反应性星形胶质细胞重新出现在门部（箭头所示），主要位于SGZ内或附近，其细胞核呈健康圆形或椭圆形，细胞核较轻，突起延伸至门部（粉红色箭头，插图）。SE（F）后3天，对照小鼠（E）和小鼠S100β（红色）的（E，F）免疫染色显示S100β免疫反应性和肝门S100β阳性细胞（黄色箭头）丢失。在齿状分子层中，反应性星形胶质细胞近端突起中S100β的表达上调。细胞核用Hoechst 33258（蓝色）染色。注意，S100β在细胞核中表达，因此S100β阳性细胞核呈紫色。白色箭头表示通过较大尺寸识别的肝门神经元。面板A（适用于B–D）和E（适用于F）中的钢筋代表50µm。（关于本图例中颜色参考的解释，读者可参考本文的网络版。）

电子显微镜

为了证实毛果芸香碱诱导SE后小鼠门部星形胶质细胞变性，我们进行了电子显微镜检查。SE后一天，许多电子密度高的退化星形胶质细胞突起(图3A)发现于肝门，与我们在光镜下的发现一致。退化的突起被归类为星形细胞突起，因为它们广泛分布于整个神经膜，与神经元元件密切接触，包括细胞体、树突和轴突终末，这是星形细胞突触的特征(Peters等人，1991年). 没有其他胶质细胞显示出这种分布模式，并形成与神经元结构紧密接触的胶质突起的紧密片状丛。此外，在肝门发现核膜受损且染色质分布不典型的小细胞体，因其体积小而被归类为胶质细胞体(图3C). 颗粒细胞层中未观察到退化的胶质细胞体，这表明毛果芸香碱诱导SE后不久，星形胶质细胞变性特地发生在门部。在对照组小鼠中，星形胶质细胞突起较轻，靠近核膜的染色质密度最高(图3B、D).

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毛果芸香碱诱导SE（a，C）后1天CF1小鼠门和对照CF1小鼠（B，D）门的电子显微镜观察。（A） SE后一天，星形胶质细胞突起呈电子致密，表明星形胶质细胞突变性（Deg AS）。（C） 小细胞染色质分布不典型，核膜缺失，与变性胶质细胞一致（Deg GL）。在对照小鼠中，星形胶质细胞突起较轻（B中为AS），核膜完整（D），符合健康星形胶质细胞形态（AS）。标记看起来健康（Te）或电子密集的突触末端，即退化（Deg-Te）。Den，枝晶；轴突。

129株小鼠和其他癫痫模型的星形胶质细胞丢失

众所周知，红藻氨酸诱导的癫痫发作在不同的小鼠品系中诱导不同程度的细胞死亡。因此，我们通过毛果芸香碱注射（i.p.）在两个近交系129亚系129（AB2.1）和129/SvTac中诱发SE。在远交系CF1小鼠中，齿状门中的星形胶质细胞丢失具有很强的重复性，并且在这129个亚系中也发现了星形胶质细胞的丢失(图4). 这些小鼠品系的癫痫发作行为和持续时间与注射匹罗卡品后约20–45分钟开始的癫痫发作和持续约5小时的SE发作相似。所有小鼠主要表现为持续的全身阵挛性癫痫发作，一些小鼠偶尔出现强直阵挛发作。毛果芸香碱诱导SE三天后，129（AB2.1）小鼠肝门GFAP阳性细胞减少40-78%（61±14%，n个=3只小鼠，P（P）< 0.001,图4A–C)129/SvTac小鼠表现出69-79%的损失（76±4%，n个= 3,P（P）< 0.001,图4C). 与CF1小鼠相似，两个近交系129只小鼠在SE后第3天都出现大约95%的肝门神经元丢失(n个=3个）与无SE控制组相比(n个=3129（AB2.1），n个=4 129/SvTac小鼠）。在CA3和CA1锥体细胞层严重受损的小鼠中，我们还观察到毛果芸香碱诱导SE后3天，海马CA1和CA3区以及梨状皮质中GFAP免疫反应性的丧失（未发表）。

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在129只小鼠中，毛果芸香碱诱导SE后3天，健康的表达肝门GFAP的星形胶质细胞显著丧失。（A，B）一只129（AB2.1）小鼠的Hilar GFAP免疫反应性（棕色）没有出现SE（A），一只出现SE（B）。（C） 129个（AB2.1）有SE和无SE的肺门健康GFAP阳性星形胶质细胞平均数（±SEM）n个=3）和129/SvTac小鼠（无SE：n个=4; 东南方：n个=3），显示两个子串的统计显著损失（双尾未配对t吨测试***P（P）<0.001). 比例尺为50µm。（对于本图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的网络版。）

与毛果芸香碱诱导的SE相反，在反复注射红藻氨酸诱导SE后，我们观察到肝门星形胶质细胞的数量没有减少（每节22.3±0.5个GFAP阳性的肝门细胞，n个= 6;图2D). 有趣的是，与毛果芸香碱诱导SE后平均每12.5小时观察一次自发运动性癫痫发作相比，我们无法在kainate诱导SE后14至35天拍摄的三只小鼠的10至27小时累积视频中检测到任何自发行为性癫痫发作(Borges等人，2003a). 此外，无论是单独用匹罗卡品诱导SE后1至3天，大鼠肝门星形胶质细胞在光镜下均表现出健康(n个= 3,图2E、F，粉红色箭头）或通过锂/毛果芸香碱(n个= 10). 毛果芸香碱诱导大鼠SE（无锂）后的细胞计数显示肝门神经元减少约50%，但星形胶质细胞数量没有变化（未显示）。

齿状回中部分星形胶质细胞的再生和增殖

毛果芸香碱诱导SE后10天，用GFAP过表达过程和细胞重新填充门。有趣的是，当计算星形胶质细胞时，只有14.3±1.7个GFAP阳性细胞(n个=4）在每个节段的肝门内发现(图1D，粉红色箭头，图2B正方形），但SGZ中有许多细胞（20.1±2.1细胞；n个=4）GFAP阳性突起延伸至肝门(图1D，粉红色箭头；图2C). 在对照组小鼠中，仅发现少数颗粒下细胞具有厚而长的肺门GFAP阳性突起。在肝门星形胶质细胞丢失后，这些细胞有可能被特异性地生成，用星形胶质细胞突起重新填充肝门。

接下来，我们使用BrdU注射和共焦显微镜检查局部增殖是否有助于星形胶质细胞的重新聚集。我们比较了肝门和邻近SGZ内的增殖情况(图5–8)众所周知，在发育期间和癫痫发作后的细胞增殖（例如。，Parent等人，1997年;Huttmann等人，2003年). 在注射胸腺嘧啶类似物BrdU后5 h处死的对照小鼠中，在肝门和SGZ中发现很少BrdU标记细胞(图6). 然而，当SE后3天注射小鼠并在5小时后分析时，门部BrdU阳性细胞的数量显著增加，SGZ有增加的趋势(图5A–E,​,6).6). 在SGZ中的BrdU标记细胞中，大多数细胞与GFAP阳性过程相关(图5A–C,​，6C中，6摄氏度，闭合圆）。至少有两种不同类型的颗粒下BrdU/GFAP标记细胞。一种细胞类型的特征是细胞核水平朝向颗粒细胞层，并且GFAP阳性突起向门延伸(图5A)这表明它代表粒下增殖的星形胶质细胞。第二类细胞的细胞核垂直于颗粒细胞层，一个突起径向延伸至颗粒细胞层(图5B、C)类似于放射状胶质细胞，在kainate诱导SE后，其增殖也增加(Huttmann等人，2003年). 其中一些放射状细胞也将其主要突起延伸到门，在那里似乎形成了血管末端(图5B)类似于以星形胶质细胞为特征的I型细胞Filippov等人（2003年）SE后3天，35–52%的肺门BrdU阳性细胞为GFAP阳性(图5E,​，6B），6亿)表明星形胶质细胞增殖或DNA修复发生在肝门。为了研究第3天增殖的细胞是否分化为成熟的星形胶质细胞，在注射BrdU后4、7和28天，即SE后7、10和31天，处死小鼠并进行分析。SE后7和10天，门内BrdU/GFAP双染细胞的数量略有增加(图5F，箭头；​箭头；6B），6亿)和肺门BrdU/GFAP染色细胞在SE后31天仍然存在(图5G，箭头）。此外，粒下GFAP/BrdU共染细胞的数量在第7天显著增加(图6C,P（P）< 0.05; 65%的BrdU标记的颗粒下细胞），且细胞在SE后持续31天(图5G，箭头）。这些数据表明，增殖有助于颗粒下和肺门GFAP阳性细胞的生成。

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毛果芸香碱诱导SE后CF1小鼠门和SGZ中GFAP阳性星形胶质细胞的增殖和生成。门和SGZ中BrdU/GFAP双荧光染色的共焦图像显示为BrdU（绿色）和GFAP（红色）作为投影。一些面板显示正交切片（正交、A1、A2、F3）xy公司部分位于中间，绿线指示x赫兹顶部显示的切片和指示位置的红线yz公司位于每个面板右侧的切片。小鼠在SE后第3天注射BrdU，并在5h（A–E）、BrdU后第7天、SE（F）后第10天、BrdU后第28天和SE（G）后第31天进行分析。除E1、F1和G1仅显示GFAP染色外，所有面板均显示BrdU和GFAP标签。在一些面板中，Hoechst 33285用于定向（面板A4、B2、C2、D2、E3、G3）。图A-C显示了SE后3天在SGZ中发现的不同BrdU/GFAP双标记细胞类型：（A）一种具有水平排列细胞核的假定颗粒下星形胶质细胞和（B，C）放射状神经胶质样细胞，图B中的细胞在门中显示假定端足。注意，面板A中的BrdU阳性核仅部分包含在切片中，但其上部被细胞质GFAP标记包围。图D和E（黄色箭头）显示了Hilar BrdU/GFAP标记的细胞，可能是增殖或损伤的星形胶质细胞。BrdU阳性但GFAP阴性的细胞由白色箭头（E）指出。SE后10天和31天，在肝门（黄色箭头）和SGZ（黄色箭头，证明并非所有BrDU阳性细胞都标记了GFAP。GL-颗粒细胞层。标尺20µm。（对于本图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的网络版。）

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毛果芸香碱诱导CF1小鼠SE后肝门和SGZ中GFAP阳性细胞增殖和生成的时间进程。A组说明了SE后3天注射BrdU的实验装置以及杀死小鼠进行BrdU/GFAP荧光双染色共聚焦分析的时间。（B–D）SE后不同时间显示每8µm切片中BrdU阳性细胞的平均数量（±SEM）(n个=3-4只小鼠）。对照组小鼠（con）用生理盐水代替毛果芸香碱。在门（B）和SGZ（C）中计数与细胞体和/或其突起中GFAP免疫反应相关的BrdU阳性细胞（封闭符号）或无GFAP免疫阳性细胞（开放符号）。B组显示，SE后3～10天肝门BrdU/GFAP共表达细胞数量较对照组显著增加，表明SE后肝门星形胶质细胞增殖。10～31天双标记细胞数量有下降趋势，后期BrdU标记微弱，与多次细胞分裂后BrdU标记物的稀释一致。BrdU阳性、GFAP阴性细胞数量在SE后第3天达到高峰，随后下降。这与这些细胞中的大多数是小胶质细胞相一致，小胶质细胞在SE发生3天后迅速分裂并侵入受损的肝门（参见图7B). （C） SE后7天，粒下BrdU/GFAP共表达细胞数量增加，表明粒下星形胶质细胞、放射状胶质细胞和/或潜在的神经干细胞增殖。较少的BrdU阳性细胞是GFAP阴性的，这表明GFAP阴性的神经前体细胞、小胶质细胞或内皮细胞增殖，并在以后产生神经元。（D） 显示了颗粒下区BrdU/GFAP阳性细胞的亚群，其GFAP表达过程延伸到门，但不包括颗粒细胞层。这些细胞在SE后新出现，与新生成的颗粒下反应性星形胶质细胞一致，这些细胞在损伤后继续在SGZ增殖。SE后31天细胞数量减少可能是由于细胞分裂过程中BrdU稀释所致。所有统计比较均采用单因素方差分析（ANOVA），然后采用Dunnett多重比较试验（相对于对照小鼠）进行*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.

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毛果芸香碱诱导CF1小鼠SE后的神经发生。对SE后3天注射BrdU并在4天后即SE后7天处死的小鼠的荧光BrdU（绿色）和双皮质激素（DCX，红色）涂层进行共聚焦分析。显示了BrdU的z堆栈图像投影（A1，B1）、双皮质激素的z堆栈图像投影或两者的投影（A3，B3）和正交视图（B4）。SE后7天，大多数BrdU阳性细胞核没有被双重皮质醇阳性细胞质（A1–A3）包围，但发现了一些共标记细胞（B）。黄色箭头标志着一个细胞具有双重皮质醇阳性的放射状突起，细胞核至少部分被表达双重皮质酮的细胞质包围，表明该模型中发生了神经发生。GL，颗粒细胞层；SGZ，亚颗粒带。比例尺代表20µm。（对于本图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的网络版。）

图6D描述了主要GFAP阳性突起投射到肝门的颗粒下BrdU阳性细胞亚群的数量(图5A，G箭头）。单次注射BrdU后数天内，BrdU/GFAP染色细胞数量增加(图6B、C)进一步证明，星形胶质细胞增殖至少在SE后的前10天内仍在进行。在以后的时间，特别是在10天和31天，许多细胞中的荧光BrdU信号较微弱，这与分裂细胞中BrdU的稀释一致。SE后31天，BrdU阳性细胞数量相对较少(图6B–D)可能是由于BrdU信号稀释到检测阈值以下或新衍生细胞的潜在损失。在所有时间点，齿状分子层中也发现大量BrdU/GFAP双染色细胞（未显示），这表明星形胶质细胞增殖导致齿状回几个区域的胶质增生。此外，在大脑其他部位也发现了BrdU/GFAP共染色细胞，最显著的是在皮层、杏仁核、丘脑、海马腔隙层分子以及CA1和CA3区域的软脑膜附近，这表明星形胶质细胞增殖可能与胶质增生有关。

在SGZ中，GFAP不仅由星形胶质细胞表达，还由可分化为神经元的神经前体细胞表达（例如。，Garcia等人，2004年;Seri等人，2004年). 为了研究SGZ是否在该模型中产生成熟的星形胶质细胞，我们还对BrdU和S100β进行了荧光双免疫组化(图7A)，齿状回中成熟星形胶质细胞的标记(Kligman和Hilt，1988年;Steiner等人，2004年). 事实上，SE后7天，相当一部分BrdU标记的细胞与S100β阳性细胞核和肝门突起（14%）和SGZ（20%；图7A黄色箭头）。这表明一些新的肝门和颗粒下星形胶质细胞来源于SE后3天分裂的细胞。

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毛果芸香碱诱导的SE-BrdU/S100β-colabeled成熟星形胶质细胞和小胶质细胞出现在CF1小鼠的门部。SE后第3天向小鼠注射BrdU。面板A和B显示了荧光双标记，如右角所示，BrdU（绿色）、S100β（A，红色）或单叶灰树异凝集素B4（B，红色）BrdU后4天和SE后7天（A），或BrdU注射后5小时（SE后3天，B）。面板A1、A2、B1和B2显示了仅通过绿色和红色滤光片观察到的双重染色。图中显示了红色和绿色滤光片（A3、B3）以及Hoechst 33258复染（蓝色、A4、B4）的覆盖层。SE后7天，在门和SGZ（A，黄色箭头）中发现一些BrdU/S100β-标记细胞，表明S100β-阳性星形胶质细胞是通过增殖产生的。注意，许多BrdU阳性细胞在SE后3天与凝集素结合，与增殖的小胶质细胞一致（B，黄色箭头）。面板B中的白色箭头指向BrdU阳性、凝集素阴性细胞，可能代表增殖的星形胶质细胞或其他非小胶质细胞类型。比例尺为20µm。（对于本图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的网络版。）

SE后3天，肝门中大约一半的BrdU阳性细胞呈GFAP阴性(图6B). 此时，许多肺门BrdU阳性细胞表达单叶G.simplicifolia异凝集素B4表明SE后3天，许多增殖的肺门细胞是小胶质细胞(n个= 4,图7B，黄色箭头）。SE后3天，BrdU-阳性/GFAP-阴性细胞数量下降(图6B)与小胶质细胞的快速转换和增殖相一致。我们之前已经证明，毛果芸香碱诱导SE后3天，肝门含有许多具有小胶质细胞形态的β2-微球蛋白阳性细胞(Borges等人，2003a).

由于神经发生在其他癫痫模型中是显著的，我们接下来研究了SE后7天匹罗卡品小鼠模型中是否发生颗粒下神经发生。使用荧光和共聚焦分析切片，对BrdU和未成熟神经元标记物双重皮质醇进行双重染色(Rao和Shetty，2004年)，我们主要在SGZ和颗粒细胞层中发现双重皮质素阴性/BrdU阳性细胞(图8A，白色箭头）。然而，我们也观察到一些BrdU标记的细胞核被未成熟的神经元标记物双重皮质素所包围(图8B，黄色箭头；n个=4只小鼠），表明该模型中的神经发生与星形细胞发生平行。

讨论

利用光学和电子显微镜，我们发现在不同品系的小鼠中，毛果芸香碱诱导SE后，小鼠齿状门中的星形胶质细胞很快退化。SE后一周，门被星形胶质细胞和来自SGZ细胞的星形胶质细胞突起重新填充。这些星形胶质细胞至少部分由门和SGZ的局部增殖产生。

肝门星形胶质细胞的选择性易损性

本研究的一个主要发现是，匹罗卡品诱导小鼠SE后，肝门GFAP标记丢失。这一发现具有很强的重复性，在多个小鼠菌株中观察到，包括CF1、两个129亚系和C57BL/6CR小鼠（数据未显示），但在大鼠中或在kainate诱导的SE小鼠中没有观察到。电子显微镜证实石蜡切片中的星形胶质细胞在光镜下变性，显示星形胶质细胞突起和胶质细胞体的退化(图3C). 退化细胞相对较小的细胞直径使我们确信，退化体细胞是胶质细胞。虽然退化细胞体的表型可能难以描述，但退化星形细胞突起的存在(图3A)贯穿整个神经膜，再加上含有GFAP的元素的丢失，提供了相关证据，支持齿状回中存在退化的星形胶质细胞胞体。据我们所知，门部星形胶质细胞变性以前没有报道过。然而，GFAP免疫反应性的短暂丧失(Jorgensen等人，1993年)星形胶质细胞肿胀(Nadler等人，1980年;Nitecka等人，1984年)据报道，在大鼠注射红藻氨酸后，苔藓纤维通路和CA3锥体细胞层中存在GFAP，我们观察到毛果芸香碱处理大鼠梨状皮质中GFAP表达的缺失(Borges等人，2003b). 在红藻氨酸诱导的SE后，门部未观察到星形胶质细胞变性，可能是由于红藻氨酸的SE比毛果芸香碱小鼠模型的SE严重。毛果芸香碱诱导SE后6h即发生肝门神经元变性(Borges等人，2003a)在肺门GFAP表达出现任何明显变化之前。因此，肝门星形胶质细胞的丢失不太可能导致肝门神经元死亡。然而，我们不能排除肺门星形胶质细胞功能早期受损的可能性，例如钾和谷氨酸的摄取，可能导致神经元死亡和/或癫痫发作。确定伴有海马硬化症的人类颞叶癫痫（TLE）中星形胶质细胞是否也受到损伤是很有意义的。

为什么毛果芸香碱诱导小鼠齿状回SE后肝门而非分子层星形胶质细胞退化？首先，有可能肝门星形胶质细胞只是被广泛的癫痫模型中齿状门发生的局部神经变性，可能是由于离子和神经递质浓度失衡或死亡神经元胞浆溢出所致。这与观察到的几个相关性一致。我们在分子层中没有发现星形胶质细胞丢失的证据，分子层缺乏神经元变性，在kainate模型中我们没有观察到肝门星形胶质细胞的丢失，在该模型中肝门神经元保持完整（另见Schauwecker和Steward，1997年). 在大鼠中，毛果芸香碱诱导SE后，未观察到GFAP丢失或星形胶质细胞损伤的迹象，这可能是因为发现许多肺门神经元仍然完好无损。相反，我们发现锂/毛果芸香碱诱导大鼠梨状皮层SE后，星形胶质细胞永久性损伤，这表明神经元明显丢失(Borges等人，2003b). 另外，肺门星形胶质细胞可能比邻近齿状分子层的星形胶质细胞更容易受到损伤。例如，与分子层星形胶质细胞相比，许多肝门部星形胶质细胞含有戈莫阳性内含物(Ohm等人，1992年)来源于被溶酶体吞噬的转化线粒体，含有过氧化物酶活性、血红素、铜和活性SH基团(Schipper，1991年). 这些内含物可能是慢性氧化应激的指标(Schipper，1996年)，但夹杂物在大脑病理中的原因和作用仍不清楚。

部分星形胶质细胞通过增殖进行再生

另一个重要的问题是，在SE诱导的变性一周内，星形胶质细胞如何重新出现在小鼠门部。在未经治疗的小鼠中，星形细胞发生在SGZ内(Eckenhoff和Rakic，1988年;Steiner等人，2004年)在门内(Bondolfi等人，2004年).此外，缺血后在肝门内发现许多BrdU/GFAP双标记细胞(Sharp等人，2002年). 与这些研究一致，我们在注射BrdU后5小时在肝门和SGZ内发现BrdU/GFAP双标记细胞。此外，在注射BrdU后的7天内，BrdU/GFAP阳性细胞的数量有增加的趋势。这些数据表明，在毛果芸香碱小鼠模型中，GFAP阳性细胞在肝门和SGZ中增殖。在SGZ内或附近发现了许多含BrdU的细胞体，其主要GFAP过度表达过程延伸到门。这些细胞似乎是新生成的潜在反应性星形胶质细胞，因为这种形态的神经干细胞尚未被描述。存活的肝门星形胶质细胞、颗粒下星形胶质细胞以及干细胞可能会增殖，以应对毛果芸香碱诱导的癫痫发作和/或肝门损伤。我们的数据表明，颗粒下区不仅是癫痫发作后的神经发生区，也是星形细胞发生区。

我们在毛果芸香碱小鼠模型中的发现似乎与其他癫痫模型不同，在其他癫痫模型中，齿状回中发现主要的神经发生，但很少有星形发生（例如。，Parent等人，1997年;Scott等人，2000年;Ferland等人，2002年). BrdU注射时间和组织分析的差异可能是造成这种明显差异的原因。在我们的研究中，早在SE后注射BrdU，早在注射后5小时就采集组织，而上述报告中的大多数实验使用了更长的BrdU采集后时间，预计BrdU标签会从许多分裂的星形胶质细胞中稀释出来。癫痫发作后早期，星形发生可能更为明显。虽然我们观察到明显的星形细胞发生，但在SE后7天，我们还发现BrdU/双皮质素标记的未成熟神经元，这表明毛果芸香碱小鼠模型也发生了神经发生。需要对BrdU注射进行更仔细的研究，并分析不同时间点的多种神经元标记物，以比较癫痫模型中星形细胞生成和神经生成的程度。

功能含义

在健康的大脑中，星形胶质细胞体均匀分布，只有星形胶质细胞突起的尖端重叠(Bushong等人，2002年;绪方和小坂，2002年). 然而，直到毛果芸香碱诱导SE后31天，胶质细胞门中的GFAP分布不均匀(图1D).星形胶质细胞的紊乱是否会产生功能紊乱尚待确定。此外，具有肺门突的颗粒下星形胶质细胞的存在可能表明早期星形胶质细胞受损，因为这些细胞仅在毛果芸香碱中发现，而在红藻氨酸小鼠模型中未发现。因此，即使在晚期，星形胶质细胞的形态和分布也可能表明星形胶质细胞在其他大脑疾病和大脑区域受损。

星形胶质细胞变性和随后小鼠齿状门部分重新填充的功能后果是什么，以及癫痫发生的潜在影响？有趣的是，门部星形胶质细胞和神经元变性的程度与我们检测CF1小鼠自发癫痫发作的能力相关。毛果芸香碱诱导SE后11至17天，我们观察到自发发作(Borges等人，2003a)，但在红藻氨酸诱导SE后35天内，我们没有发现任何自发癫痫发作(Borges等人，2004年). 自发性癫痫发作在红藻氨酸CF1小鼠模型中很少见，或发作较晚（例如。，Lahteinen等人，2002年). 相比之下，匹罗卡品或锂/匹罗卡平诱导的大鼠SE可导致自发癫痫发作，伴有梨状皮质的严重神经元和星形胶质细胞变性，但不包括齿状门。

星形胶质细胞在调节神经元兴奋性方面发挥着重要作用，例如通过控制细胞外钾、谷氨酸和腺苷的浓度。事实上，星形胶质细胞中笼状钙的光解和突触外来源（可能是星形胶质细胞）释放的谷氨酸可以引起阵发性去极化转变(Tian等人，2005年).另一方面，低浓度的氟柠檬酸盐被认为通过抑制乌头糖选择性抑制星形胶质细胞代谢，乌头糖是三羧酸循环中不可或缺的酶(Paulsen等人，1987年)，可引发局灶性癫痫(威洛比等人，2003年). 门部星形胶质细胞丢失或功能改变可能会改变齿状回的神经元信号。齿状回控制CA3和CA1区域的输入，对细胞外钾的变化高度敏感（由Nadler，2003年)尤其是TLE海马硬化患者(Gabriel等人，2004年). 在动物癫痫模型（例如。，Gouder等人，2004年)是未来工作的一个有趣问题。在人类TLE组织中发现了促惊厥星形胶质细胞特性（例如。，Hinterkeuser等人，2000年;Bordey and Spencer，2004年;Eid等人，2004年). 在海马硬化TLE患者手术切除的组织中，肝门星形胶质细胞显示较小的内向整流钾电流(Bordey and Spencer，2004年)与没有硬化的组织相比，齿状体对高钾更敏感(Gabriel等人，2004年). 这些发现表明，在人类癫痫海马中，肝门星形胶质细胞的钾缓冲可能受损。

总之，本研究显示SE诱导的肝门部星形胶质细胞变性和随后的星形胶质细胞再生，部分是通过局部增殖。我们的数据以及其他癫痫模型和人类TLE组织的发现，进一步引起了人们对星形胶质细胞在癫痫发生和癫痫发生中的潜在作用的兴趣。深入了解星形胶质细胞异质性、星形胶质细胞丢失和星形胶质细胞生成的功能后果，可能有助于更好地理解星形胶质细胞在脑损伤和癫痫中的作用以及潜在的新治疗策略。

致谢

我们非常感谢露西·刘和苏珊·里特林送给我们129只小鼠，沃尔特·休伯特和马克·弗劳特为电子显微镜准备了组织，弗兰克·戈登为我们提供了统计建议。作者感谢Robert Baul、Marla Gearing和Veronica Walker在石蜡切片和免疫染色方面的帮助。

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