抗精神病药物激活mTORC1依赖性翻译增强神经形态复杂性

纹状体细胞培养

如前所述，从E17-18 C57Bl/6小鼠或E18-19 Sprague-Dawley大鼠胚胎中制备初级神经元(59)并在涂有0.1μg/ml聚-d-赖氨酸的平板上培养（用于DIV7神经元的Western blotting实验）或涂有0.1微克/毫升聚-d-鸟氨酸的盖玻片（用于DIV14-22神经元的免疫荧光和Sholl分析）。纹状体神经元在Neurobased和B27（Invitrogen，Grand Island，NY）中生长。电镀前，根据制造商在DIV0的说明，使用AMAXA核感染系统（Lonza，Allendale，NJ）通过电穿孔将强力霉素诱导的组成活性4E-BP AA、WT 4E-BP、空载体、S6K1 shRNA或干扰shRNA导入纹状体神经元。Scramble构建物、S6K1 shRNA和MAP2 shRNA（宾夕法尼亚州匹兹堡开放生物系统公司）与GFP（新泽西州阿伦代尔市Lonza）共转染。在氟哌啶醇治疗前，用0.5μg/ml多西环素诱导4E-BP-AA过夜。在氟哌啶醇治疗前，在10μM下使用S6K1抑制剂20分钟。对于24小时内的药物治疗，神经元被血清饥饿，并用氟哌啶醇、阿米苏必利或利培酮（Sigma-Aldrich）治疗。神经元用5μM的Akt-VIII抑制剂（Akti）或125μM的雷帕霉素（Sigma-Aldrich）预孵育，然后用氟哌啶醇处理。对于Western blotting，神经元在1×10⁶/6孔板中的孔。对于免疫荧光，纹状体细胞培养在3.33×10⁵/12孔板中的盖卡瓦上的井。在共同培养中，纹状体神经元以3:4的比例与皮层神经元一起培养14天。

用于原代细胞培养的Western Blot

治疗后，根据上述方案对细胞进行裂解和制备(59)。大多数蛋白质印迹是在10%或12%丙烯酰胺凝胶上进行的。4E-BP、磷酸化4E-BP，磷酸化Akt、总Akt，磷酸化S6和S6的抗体来自Cell Signaling（Danvers，MA）。先前描述了识别ARMS（892）的抗体(34)。识别GSK3β和氯氰菊酯的抗体来自Transduction Laboratories/BD Biosciences（加州圣何塞），识别MAP2的抗体来自Chemicon/Millipore（马萨诸塞州Billerica）。

免疫荧光

免疫荧光细胞被涂布在盖玻片上，生长7天，并固定在4%多聚甲醛/20%蔗糖中，并按前面所述进行染色(59)。初级抗体识别pAkt或pS6（同上），DARPP32（小休·海明斯博士赠送）(60)]、HA（3F10，罗氏诊断，印第安纳波利斯）或GFP（abcam）。使用配备60X相位3、NA 1.40油浸物镜的Eclipse E800显微镜和由NIS Elements F 3.0软件驱动的DigiSight单色相机（全尼康）拍摄了一些图像（纽约州梅尔维尔）。使用图像J（美国国立卫生研究院）进行强度量化，方法是在原始图像文件中选择体感兴趣的区域（不包括细胞核），并测量每个视图中每个可见细胞的强度，每个封面的平均视图，减去背景，然后按治疗分组，按车辆基线划分，并与其他治疗组进行比较。共焦成像使用配备40x Plan Neofluor[数字孔径（NA）1.3]DIC油浸物镜（卡尔蔡司显微成像）的LSM 510激光扫描共焦显微镜进行。对于Sholl分析，拍摄图像，增强对比度，手动去除DARPP32阳性细胞周围的背景，并对细胞进行骨骼化和检查。使用ImageJ和Advanced Sholl Analysis插件处理图像(37)。线路扩大只是为了便于演示(图4D)，使用较薄的骨架线进行分析。因为DARPP32存在于脊椎中(61)，使用ImageJ用DARPP32染色法对脊椎进行定量。对距躯体前100μm处的脊椎进行分析，并根据以下标准进行鉴定，脊椎必须包含一个亮点，其颈部靠近大小至少为1μm×1μm的投影，并存在于至少两个1μm厚的z堆栈框架中。

SUnSET系列/SILAC公司

纹状体培养物以3×10的速度生长⁷Neurobasic和B27（Invitrogen）中的细胞/治疗组。48小时研究中使用的神经元被换成含有氟哌啶醇或载体的SILAC培养基，并在裂解前培养48小时。在5小时的研究中，将细胞进行血清饥饿处理，并在SILAC培养基和1μg/ml嘌呤霉素中培养5小时，同时加入或不加入20 nM氟哌啶醇。治疗后，细胞被裂解、离心以去除DNA和碎片，所有新生蛋白用识别嘌呤霉素的抗体进行免疫沉淀(23).

由于SILAC氨基酸标签的重量与治疗组（溶媒或氟哌啶醇）相关，因此可以将样本合并并免疫沉淀在一起，以避免治疗组之间的偏差和差异。免疫沉淀缓冲液为50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、140 mM NaCl、1%NP-40和10%甘油。嘌呤霉素–SILAC初始筛选（5小时研究）进行了一次，用中标签标记氟哌啶醇，用重标签标记载体筛选。在48小时的研究中，进行了3个独立的生物复制：前向实验（氟哌啶醇有重标记，载体有中标记）和两个反向实验（标记被反转）。用于48小时蛋白质组研究。3×10⁷纹状体细胞/治疗组生长至DIV7，并在SILAC培养基中加入20nM氟哌啶醇或载体48小时。如前所述进行样品制备和LC/MS分析(29)。简单地说，免疫沉淀蛋白通过SDS-PAGE分离，用胰蛋白酶在凝胶中消化过夜。将凝胶带切成小块，并在25 mM NH中脱色₄HCO公司_三/50%乙腈，用乙腈脱水并干燥。用12.5 ng/μL胰蛋白酶溶液在25 mM NH中对凝胶片进行再水化₄HCO公司_三并在37℃下孵育过夜。用5%甲酸/50%乙腈提取两次肽，然后用乙腈进行最终提取。样品通过真空离心浓缩至干燥，并在进一步分析之前用2%乙腈在0.1%甲酸中再溶解。

使用配备纳米电喷雾离子化源（杰米·希尔仪器服务公司）的LTQ-Orbitrap质谱仪，通过纳米流RPLC/MS分析产生的肽，并使用公开的方法制备质谱(29)。对于48小时正向1小时和5小时屏幕样品，配备75μm×12-cm反相自组装柱（Reprosil C18，3μm，Dr.Maisch GmbH，德国）的Eksigent纳米LC系统（Eksigen Technologies）直接连接到质谱仪。在110分钟内，用3%–40%乙腈和0.1%甲酸的梯度洗脱肽。在数据依赖模式下，使用Orbitrap进行一次60 000分辨率的MS扫描，并在LTQ中进行多达八次MS/MS扫描，同时进行Orbitrap扫描，以获得从每个扫描中选择的最强烈峰值的质谱。Orbitrap测量扫描的自动增益控制目标值设置为500 000，LTQ MS/MS扫描的自动增量控制目标值为10 000。测量扫描在剖面模式下采集，MS/MS扫描在质心模式下采集。

为了分析48小时反向SILAC样品，使用了与Q Exactive质谱仪（Thermo Fisher Scientific）耦合的Thermo Scientistic EASY-nLC 1000。采用自组装75μm×50-cm反相柱（Reprosil C18，1.9μm，Dr.Maisch GmbH，Germany）进行肽分离。以250 nL/min的流速，在240 min内用3–30%乙腈和0.1%甲酸的梯度洗脱肽。Q Exactive在数据依赖模式下操作，在m/z 400下以50000的分辨率进行测量扫描（瞬态时间=256 ms）。从调查扫描中选出的前10个最丰富的前兆，其隔离窗为1.6汤姆逊，并被高能碰撞离解碎片化，归一化碰撞能量为27。测量扫描和MS/MS扫描的最大离子注入时间分别为60 MS，两种扫描模式的离子目标值均设置为1000000。

蛋白质鉴定和定量

使用MaxQuant计算蛋白质组学平台版本1.2.0.18处理原始文件。根据IPI大鼠蛋白质数据库（3.68版）搜索片段光谱，允许最多两次遗漏胰蛋白酶裂解。半胱氨酸的氨基甲酰化被设定为固定修饰。蛋氨酸氧化，蛋白质N-末端乙酰化，D₄-赖氨酸，¹³C类₆-精氨酸，¹³C类₆-15牛₂-赖氨酸，以及¹³C类₆-¹⁵N个₄-精氨酸被用作数据库搜索的变量修饰。对于LTQ-Orbitrap数据，前体和碎片质量容差分别设置为7 ppm和0.5 Da。对于Q Exactive数据，前体和碎片质量容差分别设置为7 ppm和20 ppm。基于诱饵数据库搜索的估计肽和蛋白质假阳性率为1%。

蛋白质组数据分析

根据UniProtKB上的描述，人工将识别的蛋白质分类为（i）翻译相关蛋白（伴侣蛋白、折叠蛋白、核糖体蛋白和tRNA合成酶），（ii）细胞骨架相关蛋白（肌动蛋白、微管、细胞骨架结合蛋白、细胞骨架修饰剂和运动蛋白），（iii）膜结合蛋白，（iv）膜信号蛋白（与膜相互作用并具有直接信号级联的蛋白），（v）转录和核蛋白，（vi）信使核糖核酸处理蛋白（前信使核糖核酸到信使核糖核酸的运输和剪接直至实际核糖体相互作用），（vii）运输蛋白（内吞作用和细胞器处理），（viii）与降解相关的蛋白质（例如，那些参与蛋白酶体介导的降解、溶酶体蛋白质或任何其他蛋白质分解过程的蛋白质），（ix）与突触释放相关的蛋白（积极参与突触胞吐），（x）参与翻译后修饰的蛋白质，不属于已知信号复合体的一部分，（xi）线粒体蛋白质，（xii）与脂肪代谢相关的蛋白质，以及（xiii）其他未分类的蛋白质。在所有三个实验中变化不一致的蛋白质或仅在一个实验中测量的蛋白质不包括在分析中。选择增加1.2倍的临界值（氟哌啶醇/载体的蛋白质量比率为1.2（到一个显著数字）或更大），因为Western blot可以可靠地检测到该范围内的报告变化，并且以前在文献中的神经元质谱分析中也使用过该值(30)。候选人必须在三次重复中至少被测量和增加两次的标准也是基于以前的出版物(29,31)。那些在同一方向上至少有一个其他变化的情况下变化了1.2倍的蛋白质被宣布为低严格候选。那些变化了1.2倍，但三次都在同一方向上发生了变化，即中等强度。那些在同一方向上至少有两次变化大于1.2倍的被宣布为高度严格。然后从候选蛋白库中选择三种低严格度候选蛋白进行验证。使用非正常肽比率计算这些候选的显著性，并对每个质谱实验进行t检验分析。

体内实验：给小鼠注射氟哌啶醇

成年雄性C57/Bl6小鼠经腹腔注射0.25 mg/kg氟哌啶醇或溶于0.9%盐水中的载体（DMSO），并返回笼子24小时。通过颈椎脱位处死动物，在冰上对纹状体进行显微解剖，并对组织进行快速冷冻。纹状体裂解物在存在磷酸酶和蛋白酶抑制剂的冰上进行超声处理，并通过Western blot进行分析。裂解缓冲液如所述(13).

双光子成像

1个月大的Thy1-YFP阳性小鼠接受了杆植入手术，以固定头部，并在待成像区域将颅骨减薄至20μm：0.2×0.2 mm区域，中心位于+2.8 mm Bregma，+1.2 mm中线[额叶联合皮质（第0天）]。动物被允许恢复24小时，然后进行成像(40)然后，将0.25 mg/kg氟哌啶醇或溶于0.9%生理盐水中的溶媒注射到它们的笼子中。24小时后，相同的树突被重新破坏。ImageJ软件用于分析图像堆栈。从不同时间点采集的具有高图像质量（信噪比>4:1）的三维堆栈中识别出相同的树突状片段。树突突起的数量和位置（突起长度超过树突轴直径的三分之一）在每个视图中都进行了识别，而之前对动物的治疗一无所知。丝足被鉴定为长而薄的结构（通常大于平均脊柱长度的两倍，头部直径与颈部直径之比<1.2:1，长度与颈部直径的比>3:1）。其余突起被归类为脊椎。没有分离出棘的亚型。使用三维堆栈确保组织运动和成像间隔之间的旋转不会影响脊柱识别。如果脊柱或丝状伪足的位置与相对相邻的地标保持相同的距离，则认为它们在不同视图之间是相同的。如果根据第一个视图，脊柱与预期位置的距离超过0.7 mm，则视为不同。