体内HIF介导的还原性羧基化受柠檬酸盐水平和致敏剂的调节VHL（甚高频）-缺乏细胞去谷氨酰胺

HIF足以从RCC细胞中的谷氨酰胺诱导RC

为了验证HIF-2α足以从谷氨酰胺促进RC的假设，我们在VHL（甚高频）-重组786-O细胞(图3). 尽管重新引入野生型，HIF-2αP-A仍在该多克隆细胞群中组成性表达VHL（甚高频），反映了假性缺氧条件(图3A). 我们通过检测其靶基因GLUT1、LDHA、HK1、EGLN、HIG2和VEGF的表达，证实了该突变具有转录活性(图3B和S3A系列). 如所示图3C，重新引入野生型VHL（甚高频）在786-O细胞中抑制RC，而组成活性HIF-2α突变体的表达足以刺激该反应，恢复了TCA循环代谢物M1的富集VHL（甚高频）-786-O细胞缺陷。HIF-2αP-A的表达也导致葡萄糖氧化的伴随降低，证实了谷氨酰胺代谢中观察到的代谢改变(图3D和3E). 用[U-¹³C类₅]谷氨酰胺，通过RC生成M5柠檬酸盐、M3富马酸盐、M2苹果酸盐和M3天冬氨酸(图3F).

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图3

HIF-2α的表达足以诱导RCC细胞谷氨酰胺还原性羧基化和脂质生成

（A） 常氧条件下稳定HIF-2α表达示意图。

（B） 如图所示，pVHL、HIF-2α及其靶蛋白GLUT1在786-O衍生细胞中的表达。

（C） 还原羧基化的相对贡献。

（D和E）葡萄糖氧化对指示代谢物（D）和柠檬酸盐（E）碳的相对贡献。

（F） 使用[U诱导HIF-2αP-A还原羧基化的证据-¹³C类₅]谷氨酰胺。Student t检验将VHL重组或突变HIF-2α表达细胞与相应的对照组进行了比较。误差条代表SEM。

（G） ISA结果显示葡萄糖氧化和谷氨酰胺还原对脂肪生成乙酰辅酶A的特定贡献（误差条表示95%的置信区间）。另请参见图S3.

接下来，我们测试了VHL（甚高频）-HIF-2α的独立表达不仅足以刺激TCA循环中的RC，还可以将脂肪生成的底物偏好从葡萄糖转换为谷氨酰胺。HIF-2αP-A在786-O细胞中的表达-VHL（甚高频）关于减少谷氨酰胺以促进脂肪生成(图3G)表明HIF-2α本身可以诱导RCC细胞中的谷氨酰胺-脂质途径VHL（甚高频）UMRC2和UMRC3细胞中葡萄糖氧化的恢复(图S3B–S3I)，HIF-2αP-A的表达并未显著影响每种底物对这些RCC细胞中TCA循环或脂质合成的贡献（数据未显示）。UMRC2和UMRC3细胞内源性表达HIF-1α和HIF-2α，而786-O细胞只表达HIF-2β。有令人信服的证据表明，至少在RCC细胞中，HIF-α亚型有重叠，但也有不同的功能，它们在调节生物能量过程中的作用仍然是一个积极的研究领域。总的来说，HIF-1α具有抗增殖作用，其在体外的表达导致RCC细胞快速死亡，而HIF-2α促进肿瘤生长(Keith等人，2011年;拉瓦尔等人，2005年). 因此，我们无法在仅内源性表达HIF-2α的细胞中稳定表达HIF-1αP-A突变体。为了深入了解HIF-α同系物在促进RC中的作用，我们使用小鼠新生上皮肾（NEK）细胞，并在常压下选择性诱导小鼠HIF-1α或HIF-2αP-A的表达。表达HIF-1αP-A激活RC，与我们在癌细胞系中的观察结果一致。在该模型中，HIF-2αP-A不影响该反应对任何TCA循环代谢物的贡献，至少在所研究的条件下是如此(图S3J). 因此，HIF-1α或HIF-2α对RC的诱导可能是物种或细胞类型特异性的。或者，可能有多余的副记录作用，和/或在没有其他副记录的情况下调整代谢程序的控制。

代谢流量分析显示HIF激活后IDH流量的净逆转

为了确定RCC细胞中的绝对通量，我们采用了¹³如上所述的C代谢通量分析（MFA）(Metallo等人，2012年). 在此，我们使用[U的组合模型执行MFA-¹³C类₆]葡萄糖和[1-¹³C类₁]来自786-O衍生的等基因克隆PRC3（VHL）的谷氨酰胺示踪数据集^{−/ −})/重量8（VHL⁺)细胞，通过重新引入pVHL表现出强大的代谢调节。为此，我们首先测定了特定的葡萄糖/谷氨酰胺消耗量和乳酸/谷氨酸分泌率。正如预期的那样，与WT8对应物相比，PRC3表现出葡萄糖消耗量和乳酸生成量增加(图4A). 而PRC3的谷氨酰胺消耗量和谷氨酸生成率均高于WT8(图4A)，PRC3细胞的净碳内流较高(图4B). 重要的是，拟合数据表明，在PRC3细胞中柠檬酸盐对α-酮戊二酸的通量为负值(图4C). 这表明异柠檬酸脱氢酶和乌头酸酶（IDH+ACO）的净（正向加反向）通量朝向柠檬酸盐的生成。PRC3细胞的交换通量也高于WT8细胞，而PRC3的PDH通量更低。与示踪数据一致，这些MFA结果强烈表明，在VHL（甚高频）-缺乏细胞。PRC3细胞的ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）估计通量也低于WT8细胞。此外，苹果酸脱氢酶（MDH）通量为负值，反映了草酰乙酸在VHL（甚高频）-缺陷细胞(图4C). 这表明通过IDH、ACO和ACLY下游还原途径的流量增加。此外，在PRC和WT8之间，α-酮戊二酸下游的一些TCA循环通量估计值没有显著差异(表S1). 这表明VHL（甚高频）-缺陷细胞维持谷氨酰胺氧化，同时上调还原羧基化(图S1B). 这一发现与在VHL（甚高频）-缺乏细胞。表S1显示了代谢网络和完整的MFA结果。在中获得了类似的MFA结果VHL（甚高频）-缺陷向量与VHL（甚高频）-重建UMRC2细胞（数据未显示）。总之，MFA数据显示HIF表达逆转了IDH净流量，可能是为了补偿PDH抑制导致的柠檬酸盐生成不足。

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图4

代谢通量分析VHL（甚高频）-不足和VHL（甚高频）-阳性细胞

（A） PRC3（VHL）的细胞外通量（Glc和Gln摄取、Glu和乳酸分泌）^−/−)和WT8（VHL⁺)等基因细胞。误差条表示SEM。

（B） 谷氨酰胺衍生碳的净流入量由谷氨酰胺摄取量和谷氨酸分泌量之间的差异决定。误差条表示SEM。

（C） 组合[U的通量估计-¹³C类₆]葡萄糖/[1-¹³C类₁]谷氨酰胺MFA模型。学生t检验比较了WT8和PRC3细胞。谷氨酸脱氢酶；天冬氨酸转氨酶；丙酮酸脱氢酶；CS，柠檬酸合成酶；异柠檬酸脱氢酶；ACO，乌头糖；苹果酸脱氢酶；ACLY，ATP-柠檬酸裂解酶；丙酮酸在胞浆和线粒体之间的转运。误差线表示95%的置信区间。

HIF激活通过降低柠檬酸盐水平促进RC

为了支持现有文献，我们的MFA数据显示HIF抑制绝对丙酮酸脱氢酶（PDH）流量(Kim等人，2006年;Papandreou等人，2006年). 我们观察到柠檬酸水平在VHL（甚高频）-UMRC2细胞缺陷(图5A)，柠檬酸-α-酮戊二酸比率在VHL（甚高频）-缺乏和HIF-2αP-A表达的RCC细胞系(图5B和S4A系列). 我们假设低柠檬酸盐水平是通过大规模作用促进RC的关键。为了测试HIF促进RC的机制是否在于其降低柠檬酸盐水平的能力，我们恢复了细胞内柠檬酸盐库，希望在TCA循环中抑制RC。首先，我们击倒了HIF目标PDK-1(图5C)并观察到RC对TCA循环的贡献在VHL（甚高频）-缺乏PRC3细胞(图5D). 类似地，击倒ATP柠檬酸裂解酶(图5E)抑制PRC3细胞中的RC（RC在PRC3中的相对贡献图5F，RC在图S4B). 接下来，我们标记VHL（甚高频）-不足和VHL（甚高频）-用[1重建UMRC2细胞-¹³C类₁]谷氨酰胺，并用1 mM和4 mM醋酸盐补充培养基。添加醋酸盐降低了相对(图5G)和总供款(图5H)中RC的VHL（甚高频）-缺乏细胞，在VHL公司-重组的副本。M1富集使RC形成TCA循环代谢物。醋酸盐对最小RC无重大影响VHL（甚高频）-重组细胞与向这些细胞中添加醋酸盐并没有显著增加细胞内柠檬酸水平的观察结果一致(图5I和S4C系列). 相反，在VHL（甚高频）-细胞缺陷导致其柠檬酸水平显著增加(图5I和S4C系列)（达到与VHL（甚高频）-阳性细胞）以及对RC的显著抑制。为了确定醋酸盐到柠檬酸盐流量的代谢途径，我们用[U标记对照组和ACLY敲除的PRC3细胞-¹³C类₂]在ACLY敲除条件下，观察到柠檬酸M2的百分比增加(图S4D)表明醋酸盐对柠檬酸盐水平的解救作用VHL（甚高频）-缺乏细胞可能是通过柠檬酸合成酶与草酰乙酸缩合而不是通过ACLY的可逆性发生的。我们证实了醋酸盐可以作为PRC3/WT8细胞对的脂肪来源(图S4E). 我们还用[5-¹³C类₁]谷氨酰胺在天然标记的乙酸盐存在下。与之前的观察结果一致，在醋酸盐存在下，谷氨酰胺还原对脂肪生成乙酰辅酶A的贡献降低(图S4F). 接下来，我们直接向培养基中添加柠檬酸盐，并在提取之前用PBS彻底冲洗细胞，以确保细胞内代谢物的测量。添加8 mM柠檬酸盐降低了M1柠檬酸盐在VHL（甚高频）-UMRC2细胞不足一半，但与醋酸盐相比，对观察到的最小RC有中度影响VHL（甚高频）-重组细胞(图5J). 有趣的是，富马酸M1、天冬氨酸M1和苹果酸M1的水平未受影响。根据定义，人们可以预期添加无标记柠檬酸盐会降低柠檬酸M1的富集百分比，而不管其对RC的假定影响如何。为了控制外源柠檬酸盐对RC-衍生柠檬酸盐总形成的影响，我们用[1-¹³C类₁]谷氨酰胺和[U-¹³C类₆]柠檬酸盐，从柠檬酸盐总离子中减去柠檬酸盐M6总离子（外源性且非细胞代谢生成），并使用公式%M1×（总离子−%M6×总离子）计算RC的总贡献。同样，外源柠檬酸盐显著降低了RC在VHL（甚高频）-缺乏UMRC2细胞，但在VHL（甚高频）-重组细胞(图5K). 醋酸盐和柠檬酸盐对RC的这种差异效应符合并支持我们的假设，即内源性柠檬酸盐水平通过质量作用调节RC。与醋酸盐相比，在培养基中添加柠檬酸盐导致柠檬酸与α-酮戊二酸比率增加(图5L)和柠檬酸绝对水平(图S4H)不仅在VHL（甚高频）-有缺陷但也有VHL（甚高频）-重组细胞。外源性柠檬酸盐（而非醋酸盐）也能影响VHL（甚高频）-重建的细胞可以用划分差异或柠檬酸合成酶的变构抑制来解释(Lehninger，2005年); 也就是说，醋酸盐提高细胞内柠檬酸水平的能力可能受到限制(VHL（甚高频）-（重组）显示高内源性柠檬酸水平的细胞。无论其机制如何，结果表明，增加细胞内柠檬酸盐池对细胞依赖RC具有直接的生化作用。最后，我们分析了参与谷氨酰胺还原利用的酶的转录物和蛋白质水平，并没有观察到两者之间的显著差异VHL（甚高频）-不足和VHL（甚高频）-重组UMRC2细胞(图S4I和S4J)表明HIF不会通过这些酶的直接反式激活促进RC。IDH1/IDH2平衡定义如下：

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图5

柠檬酸盐水平对HIF介导的还原羧基化的调控

（A和B）RCC细胞中的柠檬酸盐离子计数（A）和柠檬酸盐与-α-酮戊二酸盐的比率（B）。Student t检验比较了重组VHL细胞和缺乏VHL细胞。

（C） PDK-1击倒验证VHL（甚高频）-PRC3细胞缺陷。

（D） PDK-1敲除条件下还原羧基化对TCA循环的相对贡献。Student的t检验将PDK-1敲除与对照细胞进行了比较。

（E） PRC3细胞中ACLY敲除的验证。

（F） ACLY敲除对还原羧基化相对贡献的影响。Student的t检验将ACLY敲低与对照细胞进行了比较。

（G和H）醋酸盐和柠檬酸盐对VHL缺失/VHL重建UMRC2细胞中还原羧基化活性的影响。醋酸盐抑制VHL缺陷UMRC2细胞中还原羧基化的相对（G）和总（H）贡献。

（一） 通过添加醋酸盐拯救柠檬酸-α-酮戊二酸比率。

（J和K）外源柠檬酸抑制了VHL（甚高频）-UMRC2细胞缺陷。

（五十） 外源柠檬酸对（K）中柠檬酸-α-酮戊二酸比率的拯救作用。ACLY，ATP-柠檬酸裂解酶；PDK-1，丙酮酸脱氢酶激酶。误差条表示SEM。另请参阅图S4.

因此，我们试图研究HIF是否可以通过增加NADPH的生成来影响IDH反应的驱动力。我们没有观察到NADP的显著变化⁺/NADPH比率介于VHL（甚高频）-细胞裂解物中的缺陷细胞和VHL阳性细胞(图S4I). 然而，我们使用与NADP-依赖性IDH酶相关的适当氧化（α-酮戊二酸）和还原（异柠檬酸/柠檬酸）代谢物的测量比率来确定游离二核苷酸的比率。确定的比率(图S4J)与Krebs实验室最初报告的值非常一致(Veech等人，1969年)并显示HIF表达的UMRC2细胞表现出较高的NADP⁺/NADPH比率。总的来说，这些数据强烈表明HIF-调节的柠檬酸盐水平调节还原通量以维持足够的脂肪生成。

体内可检测到谷氨酰胺的还原羧基化

VHL（甚高频）-缺乏的RCC细胞依赖RC进行脂质合成，这可能表明这种反应有助于肿瘤生长。已知还原羧基化发生在细菌中，并在棕色脂肪组织中进行了描述(Yoo等人，2004年)但它是在脊椎动物的其他组织中还是在实际肿瘤中发生尚不清楚。我们试图测定来源于VHL（甚高频）-缺乏的UMRC3细胞在裸鼠皮下异种移植。我们将[1-¹³C类₁]谷氨酰胺（见实验程序），并通过高分辨率分析肿瘤提取物中柠檬酸盐的富集¹³C核磁共振波谱和GC-MS(图6). [1-¹³C类₁]谷氨酰胺只能通过RC将碳转移到柠檬酸盐中，因此仅需检测¹³柠檬酸盐中C的富集表明该反应在体内是活跃的。为了达到最大¹³C浓缩柠檬酸盐，我们进行了时间过程输液-¹³C类₁]谷氨酰胺并达到同位素稳定状态¹³肿瘤中谷氨酰胺的富集(图6A). 我们还分析了¹³在最早和最晚输注点，血浆中的C-谷氨酰胺富集，观察到类似情况¹³6小时后C富集。如所示图6B，我们检测到¹³30分钟内肿瘤中富含C的柠檬酸盐，输注6小时后RC占柠檬酸盐生成量的4%(图6B). 值得注意的是，稳态¹³肿瘤中谷氨酰胺的富集率为30%(图6A)表明还原通量至少占柠檬酸盐产量的12%VHL（甚高频）-在这些实验条件下缺乏肿瘤。据报道，肾皮质相对缺氧(Zhong等人，1998年). 因此，我们分析了¹³C柠檬酸盐在肾脏提取物中的富集平行进行，并表明RC在该器官中也具有活性(图6B). 稳态¹³正常肾脏中也存在谷氨酰胺的C富集，但其含量较高(图6B)表明与肿瘤相比，RC在肾脏中的贡献总体较低。尽管处于稳定状态¹³谷氨酰胺前体C的富集，柠檬酸M1在肿瘤中的百分比随时间延长而增加，而在正常肾脏和血浆中达到稳定。重要的是，没有证据表明RC与血浆或肾脏相比以延迟的方式出现在肿瘤中，这有力地表明RC发生在肿瘤异种移植物中。通过以下方式获得了一致的结果¹³C核磁共振波谱(图6C和6D)其中¹³输注6小时后，在肿瘤提取物中观察到C富集，而在对照小鼠的羧基区域未检测到信号(图6C). 这些结果表明，RC在体内发生，至少在VHL（甚高频）-缺陷性肿瘤。

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图6

体内还原性羧化活性的证据

（A） 时间进程¹³输注[1期间肿瘤、正常肾脏和血浆提取物中谷氨酰胺的C富集（%）-¹³C类₁]谷氨酰胺。¹³使用对照非融合小鼠测定时间零点的C富集。

（B） 通过GC-MS分析测定不同组织中柠檬酸M1的百分比。

（C） 高分辨率¹³C核磁共振波谱显示¹³α[1肿瘤提取物中羧基的C富集-¹³C类₁]与对照鼠相比，谷氨酰胺融合鼠。

（D） 核磁共振分析¹³通过羧基信号的去卷积来确定输注过程中肿瘤柠檬酸盐中C的富集。柠檬酸盐信号的面积由肿瘤重量划分，并归一化为二恶烷信号。误差条表示n=3的SEM。

细胞代谢物提取和GC-MS分析

该方法在之前进行了描述(Metallo等人，2012年). 简单地说，用甲醇（−80°C）淬灭代谢活性，添加等量的水，用吸管刮孔收集试管中的细胞。将两体积的三氯甲烷（−20°C）添加到每个试管中，旋转提取物并在4°C下以11000 RPM离心10分钟。水相用于极性代谢物分析，氯仿相用于脂肪酸分析。蒸发含有氨基酸和有机酸的极性相，将其溶解在2%甲氧基胺盐酸盐中的吡啶中，通过添加N-甲基-N-叔丁基二甲基硅基三氟乙酰胺+1%叔丁基二甲基氯硅烷衍生，并进行GC-MS分析。脂肪酸甲酯（FAMEs）是通过非极性相与2%H反应得到的₂SO公司₄：甲醇。酯交换后，通过添加己烷和饱和氯化钠分离FAME。己烷相经过GC-MS分析。

代谢通量分析和同位素光谱分析

如前所述，使用基于基本代谢单元（EMU）框架的软件Metran（在Matlab（Mathworks）中执行）估算细胞内流量和对脂肪生成乙酰辅酶A的特定贡献(Metallo等人，2012年).

细胞外培养基的代谢物分析

细胞以低密度接种在基础DMEM中，在72小时生长期结束时收集废培养基，并使用黄泉仪器（YSI）7100进行分析。

NADP的测定⁺/NADPH比率

细胞NADP⁺/根据制造商的说明（细胞技术），使用基于荧光的分析方法测定NADPH水平。NADP公司⁺/还使用Krebs实验室开发的方法测定NADPH比率，如本文所述(Veech等人，1969年).

质粒和西方印迹

表达HA-VHL突变体和HA-HIF-2α的质粒购自Addgene。编码靶向PDK1和ACLY的shRNA序列的质粒从马萨诸塞州总医院（MGH）的Broad Institute RNAi Consortium（TRC）文库获得（shRNA序列可在补充实验程序). 如前所述提取蛋白质并进行免疫印迹(Zimmer等人，2008年).

动物研究

所有协议都符合制度规定。在nu/nu小鼠皮下注射UMRC3细胞（5×10⁶每次注射的细胞数）。肿瘤体积计算为长度（mm）×宽度²（毫米²) × 0.5. 用于体内¹³C-标记研究，给动物（n=3）注射[1-¹³C类₁]谷氨酰胺用于上述指定时间段(Marin-Valencia等人，2012年).

¹³C核磁共振波谱

高分辨率质子解耦¹³在Bruker AVANCE III 500 MHz Wide Bore NMR光谱仪中，使用商用（5 mm）三共振探针，在11.7 T（125.13 Hz，25°C[pH 7.2]）下获得肿瘤提取物的C NMR光谱(¹H、，¹³C、，²H） 直接优化¹³C检测。

这项工作得到了NIH R01 CA122591、MGH质子束联邦共享项目和阿斯利康奖（全部授予O.I）的支持；由葡萄牙科学技术基金会（FCT）资助（给P.A.G.）；MICINN CTQ-2010-20960-CO2-02（至P.L-L.）；和NIHR01 DK075850（至G.S.）。我们要感谢Konstantia Angelidou（哈佛公共卫生学院）对统计方法的建议，以及Ralph DeBerardinis博士对体内标记实验的有益建议。