简介
肿瘤表现出组织水平和细胞力学的改变，包括细胞外基质（ECM）重塑和变硬、间质压力升高和物质转运改变1实验模型表明，增强ECM硬度可促进恶性肿瘤，相反，抑制基质硬化可降低肿瘤发病率并改善治疗2–4然而，力学影响细胞行为以调节恶性肿瘤的分子机制尚不清楚。此外，改变生物物理线索对癌症的发病、组织病理学和进展的临床后果尚不清楚。
microRNAs（miRNAs）是基因表达的转录后调节器，在癌症中发生改变，它们调节调节细胞生长、存活和侵袭的抑癌基因和癌基因的水平5，6miRNAs还调节细胞-细胞和细胞-基质的相互作用，包括整合素依赖性粘附7整合素信号在肿瘤中增加，在ECM僵硬被阻止时减少，表明miRNAs和肿瘤力学之间存在潜在的功能联系2，三的确，ECM僵硬增强了TGFβ诱导的恶性乳腺上皮细胞（MEC）的miRNA依赖性转移8剪切应力和周期性拉伸诱导肺泡上皮和内皮细胞中的miRNAs9，10这些结果表明miRNAs对机械信号敏感。
磷酸肌醇3-激酶（PI3K）是参与恶性转化的多种途径的交叉点，对细胞生长、生存和侵袭至关重要11我们发现ECM僵硬直接调节ErbB受体依赖的PI3K激活和MEC侵袭，PI3K信号通过抑制ECM僵硬而减少体内，意味着影响PI3K信号传导的分子受到机械调节2，三作为PI3K活性的关键负调控因子，磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN）是人类癌症中经常减少的肿瘤抑制因子12，13在这里，我们使用全局分析来确定一种机械调节的miRNA，miR-18a，它通过降低HOXA9水平直接或间接靶向PTEN，以促进PI3K依赖性恶性肿瘤。临床上，miR-18a的表达可预测管腔型乳腺癌患者的临床结局。
结果
ECM硬度调节培养物中microRNA的表达体内
为了确定乳腺组织对机械微环境差异作出反应的分子机制，我们在软（<400Pa）或硬（>5kPa）聚丙烯酰胺（PA）凝胶上结合重组基膜，分析了非恶性MCF-10A人乳腺上皮细胞（hMEC）中表达的miRNAs(，补充表1、2). 对差异表达的miRNAs的询问显示了总的和成熟的miRNAs的变化，并显示未处理的miRNA3受到ECM硬度的过度上调（双侧Kolmogorov-Smirnov检验，P（P）=0.040,补充图1A).体内，我们还观察到，当我们用赖氨酰氧化酶（LOX）药物抑制剂β-氨基丙腈或特异性LOX功能阻断抗体治疗小鼠，以防止PyMT乳腺肿瘤中的ECM交联和硬化时，miRNAs同样受到ECM硬度的调节，表明细胞miRNAs对基质力学有反应(，补充表3、4).
ECM硬度调节培养物中microRNA的表达体内A.描绘在体外实验方法使用人类乳腺上皮细胞（hMECs）和合成聚丙烯酰胺（PA）底物与重组基底膜（BM）功能化，以模拟正常人类乳腺和乳腺肿瘤在恶性进展过程中的力学特性。B.描绘体内使用乳腺癌多瘤中间T（PyMT）小鼠模型抑制LOX的实验方法。C.miR-17-92靶点的验证和定量（P（P）微阵列结果<0.05）。用RNU48对miRNA靶点进行标准化，并绘制相对于软组的图。D.对FVB小鼠（WT）、经LOX抑制剂（WT+LOX-i）治疗的FVB鼠、对照PyMT小鼠（肿瘤）和经LOX抑制剂治疗的PyMT鼠（LOX-i，n=10/组）进行miR-18a的qPCR。用U6标准化小鼠miR靶点，并绘制与FVB（WT）组相关的图形。E.原位注射到FVB宿主4号乳腺的PyMT原发肿瘤细胞的肿瘤生长和最终肿瘤体积的量化（n=6/组）。PyMT细胞表达对照结构（miR-CTL）或miR-18a。F.原位注射表达对照构建物（miR-CTL）或miR-18a（n=6/组）的PyMT细胞的宿主FVB小鼠肺部PyMT mRNA表达的定量。将结果归一化为18S，并绘制与miR-CTL相关的图表。G.直接注射到FVB宿主的#4乳腺中的PyMT原代肿瘤细胞的肿瘤生长和最终肿瘤体积的定量（n＝5/组）。PyMT细胞表达对照antagomiR（ant-CTL）或对miR-18a的antagomiR（ant-18a）。H.FVB小鼠尾静脉注射表达对照antagomiR（ant-CTL）或抗miR-18a（ant-18a，n=6/组）的PyMT原代细胞后肺重量的定量。对于在体外条形图，结果是至少3个独立实验的平均值±标准误差。对于体内条形图，结果为平均值±S.D.（*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）< 0.001)
我们注意到，在硬PA凝胶培养的hMEC中差异表达的成熟miRNA池中，属于多顺反子miR-17-92簇的miRNAs持续被诱导(补充表1)14由于miR-17-92簇与恶性肿瘤有关，我们探讨了该簇对僵硬介导的恶性转化的影响14，15集群中单个miRNAs的失调表达可通过增殖、凋亡和分化的不平衡来驱动恶性肿瘤15，16重要的是，只有一个特定的集群成员miR-18a显著且持续地增加，以响应ECM刚度(). 事实上，虽然miR-17-92簇在小鼠乳腺转化中上调，但当通过LOX抑制减少组织纤维化和僵硬时，在PyMT肿瘤中只有miR-18a被显著抑制(，补充图3A–3C). 由于我们对确定硬度调节的肿瘤抑制途径感兴趣，我们将重点放在描述miR-18a在恶性肿瘤的机械调节中的作用上。
我们首先确定在培养的几种非恶性和转化的乳腺癌细胞系中，底物力学稳定地增加了miR-18a(补充图1B)18我们证实，miR-18a在MCF-10A、MCF-7和T4-2细胞中未引起明显的细胞增殖或凋亡变化，但确实增加了凤尾鱼非依赖性集落形成(补充图1C、1D). 将PyMT乳腺肿瘤细胞注射到FVB宿主清除的乳腺脂肪垫中进行的原位实验表明，增加miR-18a水平可以促进生长和最终肿瘤体积，以及肺转移(). 我们还发现，antagomiR介导的MCF-7和T4-2乳腺癌细胞miR-18a的敲低降低了它们在软琼脂中的生长和存活(补充图1E)19确实，miR-18a的敲除降低了注射到FVB小鼠清除脂肪垫中的PyMT乳腺肿瘤细胞的生长和最终肿瘤体积()并通过尾静脉检测抑制其形成肺转移的能力(，附图1F). 这些发现确定miR-18a是一种机械调节的肿瘤增强子。
ECM僵硬通过诱导miR-18a减少PTEN并增强PI3K活性而促进恶性肿瘤
在肿瘤抑制因子PTEN的3′UTR中发现miR-18a的假定结合区域(补充图2A)20–23报告者使用PTEN的假定野生型和突变的3′UTR区域进行的分析证实，miR-18a在三个预测位点中的两个与PTEN转录相互作用并抑制PTEN转录(，补充图2B)24在硬底物上生长的hMEC中PTEN mRNA减少(). 免疫荧光和免疫印迹也显示PTEN在生长在硬底物上的hMEC中表达缺失，在细胞核和细胞质部分的表达显著减少(). PTEN mRNA在僵硬的小鼠乳腺肿瘤组织中的表达同样减少，抑制基质硬化（LOX-i或αLOX）可防止PTEN丢失(，补充图3D). 最后，我们记录了PI3K活性之间的负相关关系，由磷酸化Akt升高表示Ser473系列和PTEN蛋白，细胞增殖或凋亡没有任何变化，表明ECM僵硬可以通过调节PTEN诱导miR-18a调节乳腺的恶性进展(，补充图3E–3G).
ECM僵硬通过诱导miR-18a减少PTEN并增强PI3K活性而促进恶性肿瘤A.添加1μg对照物（miR-CTL）或miR-18a后，对野生型或突变PTEN 3′UTR活性进行荧光素酶报告分析（针对两个假定的miRNA种子区域）。将结果归一化为各个miR-CTL组。B.软（<400Pa）或硬（>5kPa）PA凝胶培养hMEC的PTEN mRNA。将结果归一化为18S，并绘制相对于软的图形。C.软或硬PA凝胶培养的hMEC中PTEN（红色）和DAPI（蓝色）的免疫荧光图像。比例尺，20μm；插入比例尺，50μm。D.软或硬PA凝胶上培养的hMEC的核和细胞质PTEN蛋白。结果归一化为pHistone H3（核）或Gapdh（细胞质），并相对于软组织进行绘图。E.FVB小鼠（WT）、经LOX抑制剂（WT+LOX-i）治疗的FVB鼠、对照PyMT小鼠（肿瘤）和经LOX抑制物（LOX-i）治疗的PyMT鼠的PTEN mRNA。将结果归一化为18S，并绘制出与WT相关的图表（n=10/组）。F.FVB小鼠（WT）乳腺的Pten（顶部，红色）、pS473-Akt（底部，红色）和DAPI（蓝色）的免疫荧光图像，经LOX抑制剂（WT+LOX-i）治疗的FVB鼠，恶性PyMT小鼠（肿瘤）和经LOX抑制剂（LOX-i”）治疗的PyMT鼠。比例尺，20μm；插入比例尺，50μm。G.在软或硬底物上培养的hMEC的PTEN蛋白表达，表达microRNA antagomiR对照物（ant-CTL）、antagomi R to miR-18a（ant-18a）或antagomiR to miR-19b（ant-19b）。结果归一化为β-肌动蛋白，并相对于软向量绘制图表。在表达控制载体（miR-CTL）、miR-18a或不表达表达载体（hMEC）的软底物上培养的hMEC的H.PTEN蛋白表达。将结果归一化为β-肌动蛋白，并绘制出与hMEC相关的图表。I.原位PyMT肿瘤的Pten mRNA表达，表达microRNA antagomiR对照物（ant-CTL）或miR-18a的antagomi R（ant-18a，n=5/组）。将结果归一化为18S，并绘制出与ant-CTL相关的图表。原位PyMT肿瘤表达微RNA控制载体（miR-CTL）或miR-18a的Pten mRNA表达（n=6/组）。将结果归一化为18S，并绘制与miR-CTL相关的图表。总共在体外条形图，结果是至少3个独立实验的平均值±标准误差。对于体内条形图，结果为平均值±S.D.（*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）< 0.001)
为了直接将miR-18a与PTEN调制联系起来，我们测试了antagomiR介导的miR-18a-敲除是否可以恢复在刚性ECM上生长的hMEC中的PTEN水平。与表达miR-19b拮抗剂的hMEC中观察到的适度增加相比，即使在坚硬的PA凝胶上生长，表达miR-18a拮抗剂的hMEC（ant-18a）也保留了PTEN的表达(). 在软ECM培养的hMEC中，当miR-18a体外升高时，PTEN水平降低(). 重要的是，在miR-18a减少的PyMT肿瘤中PTEN mRNA增加，我们注意到在miR-18增加的PyMTs肿瘤中PTEN mRNA减少(). 这些发现表明，ECM硬度通过增加miR-18a抑制PTEN并促进PI3K依赖性乳腺恶性进展。
ECM硬度通过诱导miR-18a减少HOXA9而促进恶性肿瘤
miRNA通常具有多个靶点，miRNA靶点预测软件还确定了同源盒转录调节器HOXA9的3′UTR中miR-18a的假定结合区域(补充图2)20–23我们之前报道过HOXA9限制乳腺癌细胞的恶性行为在体外和体内，人类乳腺癌中HOXA9水平降低，可预测患者预后不佳25因此，我们探索了miR-18a对HOXA9的影响。
报告者使用HOXA9的一个3′UTR区域进行分析，该区域包含假定的miR-18a结合区域，证实miR-18a与HOXA9表达相互作用并抑制HOXA9，并且表明突变该区域可以消除这种调节(). 免疫印迹显示，生长在硬底物上的hMEC中HOXA9蛋白表达显著下降，而mRNA无变化(). 免疫荧光分析显示，HOXA9和PTEN仅在软ECM上生长的乳腺细胞中进行了稳健的联合染色，当hMEC在硬ECM上生长时，这两种蛋白同时丢失(). 此外，乳腺组织的免疫荧光染色在正常乳腺组织中检测到高水平的HOXA9，并表明，虽然这种表达在僵硬的乳腺肿瘤组织中丢失，但抑制组织僵硬缓和了HOXA9的丢失，对mRNA表达几乎没有影响(，补充图3D，3E). 这些数据表明miR-18a也可以通过调节HOXA9来调节乳腺恶性肿瘤。
ECM硬度通过诱导miR-18a减少HOXA9而促进恶性肿瘤A.添加1μg控制载体（miR-CTL）或miR-18a后，对野生型或突变HOXA9 3′UTR活性进行荧光素酶报告分析。将结果归一化为各个miR-CTL组。在软（<400Pa）或硬（>5kPa）PA凝胶上培养hMEC的B.HOXA9蛋白。将结果归一化为Gapdh，并相对于软件绘制图形。在软硬PA凝胶上培养的hMEC的HOXA9 mRNA。将结果归一化为Gapdh，并绘制相对于SOFT的图形。D.软或硬PA凝胶培养的hMEC中HOXA9（红色）、PTEN（绿色）和DAPI（蓝色）的免疫荧光图像。比例尺，20μm；插入比例尺，50μm。FVB小鼠（WT）、对照PyMT小鼠（肿瘤）和用LOX抑制剂（LOX-i）治疗的PyMT鼠的E.HOXA9 mRNA。将结果归一化为18S，并绘制出与WT相关的图表（n=10/组）。F.FVB小鼠（WT）、经LOX抑制剂治疗的FVB鼠（WT+LOX-i）、对照PyMT小鼠（肿瘤）和经LOX抑制剂治疗的PyMT鼠的HOXA9（红色）和DAPI（蓝色）免疫荧光图像。比例尺，20μm；插入比例尺，50μm。用于培养在软或硬底物上的hMEC的G.HOXA9蛋白，表达microRNA antagomiR对照物、antagomi R to miR-18a（ant-18a）或antagomiR to miR-19b（ant-19b）。结果归一化为β-肌动蛋白，并相对于软向量绘制图表。在表达控制载体（miR-CTL）、miR-18a或不表达表达载体（hMEC）的软底物上培养的hMEC的H.HOXA9蛋白。将结果标准化为β-肌动蛋白，并相对于hMECs绘制图表。I.原位PyMT肿瘤的Hoxa9 mRNA表达，表达microRNA antagomiR对照（ant-CTL）或antagomi R至miR-18a（ant-18a，n=5/组）。将结果归一化为18S，并绘制出与ant-CTL相关的图表。J.原位PyMT肿瘤表达微小RNA控制载体（miR-CTL）或miR-18a的Hoxa9 mRNA表达（n=6/组）。将结果归一化为18S，并绘制与miR-CTL相关的图表。总共在体外条形图，结果是至少3个独立实验的平均值±标准误差。对于体内条形图，结果为平均值±S.D.（*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）< 0.001)
为了直接将miR-18a与HOXA9调制联系起来，我们测试了antagomiR介导的miR-18a-敲除是否可以恢复在刚性ECM上生长的hMEC中的HOXA9水平。一致地，即使在坚硬的PA凝胶上生长，表达miR-18a拮抗剂的hMEC也保持HOXA9的表达(). 此外，当miR-18a在软ECM上培养的hMEC中异位升高时，HOXA9水平降低(). 我们还观察到，在miR-18a被敲除而PTEN被恢复的PyMT肿瘤中HOXA9 mRNA增加，而在miR-18 a增加而PTEN减少的PyMTs肿瘤中HOXA9 mRNA减少(). 这些发现暗示了miR-18a对HOXA9和PTEN的协同调节，表明ECM硬度通过诱导miR-18a-减少HOXA9与PTEN而促进恶性肿瘤。
ECM僵硬通过阻止HOXA9-依赖性PTEN转录促进恶性肿瘤
我们先前发表的微阵列结果表明HOXA9在乳腺癌细胞中诱导PTEN25与HOXA9和PTEN之间的预测联系一致，我们注意到，即使在PTEN水平升高的软ECM上生长非恶性hMEC，shRNA介导的HOXA9减少也会导致PTEN mRNA的显著丢失(). 此外，使用缺乏3′UTR的质粒增加HOXA9的水平，可以恢复在硬ECM上生长的非恶性hMEC中的PTEN水平，并增加两个乳腺癌细胞系中PTEN mRNA的水平(). 此外，FVB小鼠原位注射PyMT肿瘤细胞中Hoxa9的异位表达增加了PTEN mRNA的表达，减少了生长和最终肿瘤体积，而不影响miR-18a水平(). 这些发现表明HOXA9通过调节PTEN调节乳腺肿瘤的发生。
ECM僵硬通过阻止HOXA9-依赖性PTEN转录促进恶性肿瘤A.hMEC中PTEN mRNA的表达，表达对照shRNA（载体）或HOXA9 shRNA（HOXA9-i），并在软（<400Pa）底物上培养。将结果归一化为18S，并相对于Vector绘制图形。B.在软（<400Pa）或硬（>5kPa）底物上培养的hMEC中PTEN mRNA的表达，体外表达控制载体（vector）或HOXA9。将结果归一化为18S，并绘制相对于软的图形。C.PTEN mRNA在恶性hMEC（T4-2或MDA-MB-231细胞）中的表达，体外表达对照载体（vector）或HOXA9。将结果归一化为18S，并绘制相对于软的图形。D.定量表达控制载体（vector）或Hoxa9的PyMT原发肿瘤细胞的肿瘤生长和最终肿瘤体积，并将其原位注射到FVB宿主的#4乳腺中（n=5/组）。原位PyMT肿瘤表达E.miR-18a，表达对照载体（vector）或Hoxa9（n=5/组）。将结果归一化为18S，并相对于Vector绘制图形。原位PyMT肿瘤表达控制载体（vector）或Hoxa9的F.Pten和Hoxa9（n=5/组）。将结果归一化为18S，并相对于Vector绘制图形。G.添加野生型HOXA9后PTEN启动子活性的荧光素酶报告分析。H.添加2μg HOXA9后PTEN启动子活性的荧光素酶报告分析，HOXA9在保守DNA结合域中含有N255T（DNA BM）突变或添加2μg/HOXA10。I.响应1μg HOXA9和2μg PBX1或MEIS1a的PTEN启动子活性的萤光素酶报告子分析。J.hMEC中ChIP研究的代表性凝胶，揭示HOXA9与PTEN启动子的共沉淀。定量HOXA9在PTEN近端启动子上的染色质免疫沉淀结果，用于表达shRNA控制（载体）或shRNA至HOXA9（HOXA9-i）的非恶性hMEC。K.描绘了通过miR-18a直接抑制PTEN和通过HOXA9的miR-18a调节间接抑制PTEN的模型的图形。总共在体外条形图，结果是至少3个独立实验的平均值±标准误差。对于体内条形图，结果为平均值±S.D.（*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）< 0.001)
报告者分析，使用PTEN的近端启动子区域26，27含有同源异型盒共识结合位点，证实了荧光素酶活性在联合转染后随着野生型而非DNA结合域突变体N255T HOXA9（DNA BM）或HOXA10数量的增加而增强()并且HOXA9诱导PTEN的表达独立于HOX辅因子PBX1和MEIS1(). 使用内源性HOXA9作为诱饵进行的ChIP研究（在软ECM上生长的MEC中，它们表达高水平的HOXA9蛋白）证实HOXA9直接与PTEN启动子结合(左）。当通过shRNA降低HOXA9水平时，这种影响显著降低(右侧）。研究结果表明，HOXA9直接与PTEN启动子结合，调节其表达并抑制乳腺细胞恶性肿瘤。结果还表明，增加机械刚度通过miR-18a靶向和间接通过miR-18靶向HOXA9抑制PTEN表达().
组织僵硬参与机械传导信号通路促进miR-18a依赖性恶性肿瘤
miRNAs在乳腺癌亚型中表现出差异表达28miR-17-92簇的MYC原癌基因刺激调节肿瘤的发生和发展29因此，我们假设MYC-驱动的miRNA表达可明显受机械微环境控制。非恶性和恶性hMEC的MYC mRNA和蛋白水平均随着基质硬度的增加而增加(，补充图4A). MYC表达与机制之间的功能联系通过显示药物抑制MYC在硬底物培养的hMEC中降低miR-18a而被揭示(). 与野生型腺体相比，小鼠乳腺肿瘤（肿瘤）中MYC mRNA的表达增加（与未经治疗的肿瘤相比，LOX抑制降低了mRNA和蛋白的表达()尽管细胞增殖水平相似(补充图1C、3F、3G). 这些结果表明，MYC通过增加培养基硬度和体内在mRNA和蛋白质水平。
组织僵硬参与机械传导信号通路促进miR-18a依赖性恶性肿瘤A.在刚度增加的PA凝胶上培养的hMEC中MYC mRNA和蛋白的表达。将结果归一化为GAPDH，并绘制相对于软（<400Pa）的图形。B.MYC mRNA在软（<400Pa）和硬（>5kPa）PA凝胶培养的恶性T4-2 hMEC中的表达。将结果归一化为GAPDH，并相对于软件绘制图形。在软底物（<400Pa）或硬底物（>5kPa）上培养的hMECs在含有10μM MYC抑制剂10058-F4（MYC-i）的软底物上的C.miR-18a表达。将结果归一化为RNU48，并绘制相对于软件的图形。D。左侧：FVB小鼠（WT）、经LOX抑制剂治疗的FVB鼠（WT+LOX-i）、恶性PyMT小鼠（肿瘤）和经LOX抑制剂治疗的PyMT鼠（LOX-i。结果标准化为18S，并相对于WT绘制图表（n=10/组）。赖特：恶性PyMT小鼠（肿瘤）和经LOX抑制剂（LOX-i）治疗的PyMT鼠乳腺中Myc蛋白的表达。结果与肿瘤相关（n=5/组）。E.公司。左侧：在刚度增加的PA凝胶培养的hMEC中，活性β-catenin蛋白表达归一化为总β-catentin。将结果归一化为总β-catenin，并绘制与软质相关的图表。赖特：在刚度增加的PA凝胶上培养的hMEC中β-catenin（红色）和DAPI（蓝色）的免疫荧光图像。比例尺，50μm；插入比例尺，5μm。F.恶性PyMT小鼠（肿瘤）和接受LOX抑制剂（LOX-i）治疗的PyMT鼠乳腺中活性β-catenin蛋白表达归一化为总β-catentin。结果与肿瘤相关（n=5/组）。G.pFAK公司397在刚度增加的PA凝胶上培养的hMEC中的蛋白质表达。将结果归一化为GAPDH，并相对于软件绘制图形。在含有或不含1μM FAK抑制剂FAK抑制剂14（FAK-i）的硬底物（>5kPa）上培养的hMEC的H.miR-18a表达。将结果归一化为RNU48，并绘制与CTL（无抑制剂）相关的图表。I.在含有或不含1μM FAK抑制剂14（FAK-I）的硬底物（>5kPa）上培养的hMEC的HOXA9和PTEN蛋白表达。将结果归一化为GAPDH，并绘制与CTL（无抑制剂）相关的图表。J.pFAK的免疫荧光图像Y397年FVB（WT）和转基因V737N小鼠（n=6/组）中的（红色）和DAPI（蓝色）。比例尺，20μm。K.β-catenin在FVB（WT）和转基因V737N小鼠（n=6/组）中的核表达。将结果归一化为总β-catenin表达，并绘制与WT相关的图表。比例尺，20μm；插入比例尺，5μm。L.Myc mRNA和miR-18a在FVB（WT）和转基因V737N小鼠（n=6/组）中的表达。将结果分别归一化为18S和sno202，并绘制FVB（WT）和转基因V737N小鼠（n=6/组）中WT.M.Pten和Hoxa9蛋白表达的图表。比例尺，20μm；插入比例尺，5μm。总共在体外条形图，结果是至少3个独立实验的平均值±标准误差。对于体内条形图，结果为平均值±S.D.（*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）< 0.001)
先前的工作将MYC确定为β-catenin信号的下游靶点31在硬基质上生长的hMEC中，核β-catenin水平持续增加(补充图4B)活化β-catenin蛋白与总β-catentin蛋白的比值随着底物硬度的增加而增加(左侧，补充图4C). 免疫荧光还显示ECM僵硬增加了总核β-连环蛋白(右侧）。此外，与对照PyMT肿瘤相比，LOX被抑制的腺体中总β-连环蛋白和β-连环素活化的核定位降低(，补充图4D、4E).
在文化和体内在模型中，β-catenin mRNA水平因ECM硬度而保持不变(补充图4F). 然而，FAKY397年磷酸化（表明FAK激活）、GSK3α/β磷酸化（表示GSK3失活）和Akt第473页磷酸化（表明Akt活性）随着硬度的增加而增加，表明整合素依赖性信号激活β-连环蛋白(，补充图3G，). 一贯地，抑制FAK降低miR-18a表达，增加HOXA9和PTEN蛋白表达(). 此外，抑制miR-18a可降低硬底物培养hMEC中GSK3α/β和Akt磷酸化(补充图5C、5D). 这些数据表明，组织硬化通过β-catenin和MYC的整合素依赖性激活调节miRNA-依赖性PTEN的表达。
促进整合素聚类体内，表达条件型V737Nβ1整合素聚集突变体的转基因小鼠，该突变体再现了张力依赖性整合素的聚集并促进局部粘附信号2，用乳腺特异性MMTV-核心转基因株系培育而成。与焦点粘附组装和信号增强一致，FAK397突变体V737N腺体磷酸化增加(). 在V737N腺体的乳腺上皮中，β-catenin核定位也增加()MYC mRNA和miR-18a水平(). 总之，HOXA9 mRNA和蛋白的表达与正常乳腺和V737N突变乳腺中的miR-18a呈负相关(，补充图5E). 最后，与WT对照组相比，V737N乳腺中PTEN mRNA和蛋白表达降低(，补充图5F). 这些结果表明，机械微环境影响β-catenin信号通路整合素激活下游PTEN的表达。
乳腺癌与miR-18a增加和PTEN表达降低相关
通过评估临床上不同的人类乳腺癌和正常组织中HOXA9和PTEN的RNA和蛋白质表达，研究了ECM硬度诱导的miR-18a和PTEN抑制的临床相关性。miR-18a在乳腺癌患者样本中的表达明显高于正常人，无论是基底样还是管腔样B样本的表达都明显高于正常或管腔样A样本(). miR-18a的表达与正常和转化乳腺组织中的乳房僵硬相关（R2=0.7197,P（P）<0.001,)，管腔B样品硬度高于管腔A样品(). 与正常乳腺组织相比，管腔B癌中PTEN和HOXA9 mRNA减少，基底样癌中进一步减少(). 事实上，HOXA9与正常和转化乳腺组织中PTEN的mRNA（R2=0.8979）和蛋白质，这与我们的研究结果一致，即PTEN受HOXA9调节(). 正常乳腺的上皮细胞共同表达大量的核HOXA9和细胞质PTEN蛋白，分化程度更高的腔内A型乳腺肿瘤也是如此(). 相反，分化程度较低的管腔B、基底样和HER2+肿瘤中HOXA9和PTEN的表达水平降低，活化AKT（pAKT底物）、磷酸化S6和失活pGSK3的表达水平升高(，补充图6A). 这些临床发现，以及我们的实验数据，与miR-18a和HOXA9通过与多种在人类乳腺肿瘤中差异表达的阴性和阳性调节因子协同调节PTEN表达的观点一致13。
乳腺癌与miR-18a增加和PTEN表达降低相关人类非恶性乳腺样本（正常）和乳腺肿瘤样本（管腔A、管腔B、基底样和HER2）中的A.miR-18a+). 将结果归一化为RNU48，并相对于Normal绘制图表。B.miR-18a表达与人类患者样本（包括非恶性和肿瘤样本）的弹性模量（上四分位数）之间的相关性。C.腔A和腔B乳腺肿瘤样本的弹性模量（上四分位数）。D.PTEN（左）和HOXA9（右）mRNA在人类非恶性乳腺（正常）样本和乳腺肿瘤样本（管腔A、管腔B、基底样和HER2+）中的表达。将结果归一化为18S，并绘制相对于Normal的图形。E.人类患者样本（包括非恶性和肿瘤样本）中HOXA9和PTEN mRNA水平之间的相关性。F.HOXA9（顶部，红色）、PTEN（中部，红色），pAKT底物（底部，红色）和DAPI（蓝色）用于人类非恶性乳腺样品（正常）和乳腺肿瘤样品（管腔A、管腔B、基底样和HER2+）。比例尺，100μm。G.Kaplan-Meier图（左）显示，与最低四分位（黑线）的患者相比，肿瘤表达最高miR-18a水平（最高表达四分位；红线）的管腔型乳腺癌患者的无转移生存率显著降低。Kaplan-Meier图（右）显示基底样和HER2+乳腺癌患者的肿瘤表达最高miR-18a水平（最高表达四分位；红线）和最低miR-18a水平（黑线）。H.描绘了通过β-catenin刺激MYC-驱动的miR-18a直接抑制PTEN和间接通过miR-18a-调节HOXA9抑制PTEN的模型的图形。(*,P（P）<0.05; **,P（P）<0.01; ***,P（P）< 0.001)
接下来，我们分析了公开的基因表达数据集，以寻找miR-18a与临床结果之间的相关性32，33在没有PTEN突变的患者样本中，我们发现PTEN的表达与miR-18a的表达相关，但仅当HOXA9未甲基化时(P（P）<0.0001,补充图6B). 我们发现，miR-18a与远处无复发生存时间（DRFS）呈负相关，患者的肿瘤在最初诊断时表达最高的miR-18a水平（最高四分之一），并且无论其亚型如何，都会发生远处转移(P（P）=0.0173，补充图6C). 在两种不同的模型中加入多个PTEN靶向miRNAs，我们发现miR-18a表达水平可以预测腔内乳腺癌患者的预后（p=0.017和p=0.049，，补充图6D). 这些数据表明，miR-18a在基底样乳腺癌中上调，其表达与管腔型乳腺癌患者未来疾病侵袭性增加相关。综合起来，这些发现确定了一种可能促进恶性肿瘤的机械调节分子回路，并表明基质硬度可能影响乳腺癌发病机制().
讨论
在这里，我们证明了miRNA的表达对ECM硬度有反应。我们出席在体外和体内有证据表明，一种miRNA，miR-18a，可介导乳腺上皮的硬度依赖性恶性肿瘤。通过证明升高的ECM刚度参与miR-18a电路，通过肿瘤修饰物HOXA9直接或间接靶向肿瘤抑制因子PTEN，促进PI3K依赖性恶性进展，我们确定miRNAs是肿瘤机制的关键介导物。鉴于肿瘤中的组织力学经常发生改变，我们的发现为多种癌症类型中miRNA表达的频繁改变提供了一个合理的解释6事实上，整合素粘附和离子通道活性是机械传导的中心参与者，在恶性肿瘤中发生改变，并受miRNAs调节7，34，35重要的是，ECM硬度是组织力学的多个方面之一，它也会影响组织结构、间质压力和质量传递，这些物理线索也会影响miRNA的表达，从而强化了miRNA是力调节信号网络的一部分的概念1，38–40。
超声和剪切波弹性成像检查组织硬度作为检测癌症的被动特征41–43然而，在实验模型中的研究表明，组织力学在肿瘤进展中起着不仅仅是乘客的作用2，三，38在患者活检中，我们的数据表明miR-18a水平可以区分管腔A和管腔B肿瘤，并预测管腔型乳腺癌患者的临床结局。我们的研究与乳腺癌患者的弹性成像数据一致，表明宏观肿瘤硬度可能与侵袭性平行，肿瘤大小、级别和亚型是影响组织力学的独立因素42–44我们扩展了这些观察结果，以表明ECM硬度可以参与PTEN和HOXA9的miR-18a调节的特定分子途径，这可以在临床上加以利用。在这方面，管腔型乳腺癌在基因表达、突变、拷贝数变化和患者预后方面存在异质性差异，这对鉴别侵袭性和惰性肿瘤患者是一个重大挑战33，45，46我们的工作将ECM硬度确定为一个生物物理参数，可以区分管腔a和管腔B肿瘤，miR-18a、PTEN和HOXA9是易处理的生物标记物。
方法
抗体和试剂
抗体和试剂如下：PTEN（Cell Signaling），HOXA9用于免疫荧光（日本东京日本癌症研究基金会T.Nakamura捐赠），HOXA9用于western blotting（Santa Cruz），phospho-AktSer473系列（细胞信号传导）、β-肌动蛋白（西格玛）、Gapdh（细胞信号）、MYC（Abcam）、活性b-catenin（细胞信号传递）、总β-catenin（细胞信号转导）、磷酸-GSK3α/β（细胞信号发送）、磷酸-FAK蒂尔397（Invitrogen）、磷酸氢istone H3（Cell Signaling）、二级AlexaFluor山羊抗鼠和抗兔（Invit罗gen）和Matrigel重组基底膜（BD Biosciences）。抑制剂包括MYC抑制剂10058-F4（10μM，Calbiochem）和FAK抑制剂14（1μM，Tocris）。
聚丙烯酰胺基板和细胞操作
HMT-3522 S-1和T4-2 MEC的培养和操作如前所述47，48MCF-10A和MDA-MB-231细胞根据制造商的建议进行培养（ATCC）2BM结合聚丙烯酰胺水凝胶的制备如前所述49只需一次改性：N-丁二酰亚胺丙烯酰胺基己酸（N6）交联剂使用0.01%双丙烯酰胺、0.025%伊尔加cure 2959、0.002%二（三羟甲基丙烷）四丙烯酸酯（Sigma）和0.01%N6与聚丙烯酰胺底物偶联。如前所述进行软琼脂分析25。
载体构建与基因表达
已描述了β1整合素野生型、β1整合素聚糖楔组成活性和β1整整素聚集突变体V737N结构2miR-18a、antagomiR-18a和antagomiR-19b构建体，以及miRNA和antagomiR对照构建体，已在先前进行了描述19，50。
小鼠和治疗
FVB/N和FVB/N-Tg（MMTV-PyMT）小鼠（Jackson实验室）按照加利福尼亚大学动物护理和使用委员会的指南进行饲养。为了产生FVB/N-Tg（MMTV-V737N）小鼠，在ROSA 26靶向结构中的漂浮新霉素磷酸转移酶表达盒下游克隆β1整合素的V737N突变。表达条件型V737N整合素β1聚集突变体的转基因小鼠与乳腺特异性MMTV-Cre转基因小鼠杂交，产生FVB/N-Tg（MMTV-V737N）小鼠（年龄，6周；每组6只）。对于LOX抑制研究，动物在饮用水中接受BAPN（3 mg/kg；Spectrum）治疗（每组10例）或每周两次腹腔注射LOX功能阻断多克隆抗体（3 mg/kg:OpenBiosystems，D8746）（每组5例）。治疗开始于4周，11周后处死小鼠。通过触诊检测病变，用卡尺评估肿瘤体积。在献祭时，乳腺被切除，成像，并快速冷冻或副甲醛混合。
对于原位注射研究，从PyMT肿瘤（年龄，11周）中分离原代PyMT肿瘤细胞。1×106将异位表达miR-18a的原代细胞（每组n=6）、miR-18a的拮抗剂（每组n=5）、Hoxa9（每组n=5）或相应的适当对照注射到6-7周龄的宿主FVB小鼠的4号乳腺脂肪垫中。当肿瘤达到1-2厘米时，处死小鼠。通过触诊检测病变，用卡尺评估肿瘤体积。在牺牲时，肿瘤被切除、成像并快速冷冻或副甲醛固定。对于尾静脉研究，从PyMT肿瘤中分离出原代PyMT瘤细胞（年龄11周）。5×105将体外表达抗gomiR-miR-18a（ant-18a）或抗gomiR对照（ant-CTL）的原代细胞悬浮在PBS中，并注入6-7周龄宿主FVB小鼠（每组6只）的尾静脉。28天后处死小鼠。转移负荷通过湿肺重量评估。
miRNA阵列和定量PCR
如前所述，进行Affymetrix miRNA标记、阵列杂交和数据预处理51对于hMECs微阵列实验，在相同条件下进行了两到四个独立实验。对于体内微阵列实验，每组4个。使用Affymetrix的miRNA QC工具软件从图像中提取数据，进行分位数标准化、汇总（中值抛光）和log2转换。对于miRNA定量PCR分析，特定miRNA的逆转录（来自总RNA的10ng）根据说明，使用每种微RNA的RT-loop引物和Applied Biosystems的TaqMan微RNA RT试剂盒进行检测。根据说明，使用此步骤获得的cDNA，使用提供的实时引物进行实时定量TaqMan PCR。在归一化为U6 snRNA、RNU48或sno202后，Ct值转换为倍表达变化（2–ΔΔCt值）。对于靶miRNAs的鉴定，人们关注的是在僵硬微环境中培养的hMEC中上调的miRNA，在PyMT小鼠的乳腺中上调的（与非恶性FVB乳腺相比），以及LOX抑制的PyMT乳腺中下调的（与对照PyMT腺体相比）。此外，先前的研究表明，细胞中最丰富的microRNA介导靶向抑制52miRNA丰度在微阵列分析中进行了估算，如表1和表2所示。
对于mRNA分析，使用随机引物（Amersham Biosciences）逆转录总RNA，并使用GAPDH或18S引物控制每个样本单独PCR反应中的cDNA浓度。将LightCycler Fast Start DNA Master SYBR Green Mix（Roche）与cDNA和1pmol引物一起添加到每个PCR反应中，总体积为10μl。
原子力显微镜
如前所述，使用安装在尼康TE2000-U倒置荧光显微镜（庇护研究所）上的MFP3D-BIO倒置光学原子力显微镜进行原子力显微镜和分析53。
免疫染色、免疫印迹、ChIP和报告分析
按照说明对培养物和组织进行免疫荧光成像2细胞在RIPA或Laemmli缓冲液中进行裂解，并通过免疫印迹法进行分析54染色质免疫沉淀分析如前所述进行25荧光素酶报告基因测定通过SEAP表达进行量化，并如前所述进行24，25对于V737Nβ-catenin核定位分析，如，通过ImageJ确定β-catenin和DAPI的共同定位，并从显示的图像中删除非核β-catentin。
人体样本
使用定义的临床病理标准对乳腺癌亚型进行近似55，56简而言之，管腔A肿瘤定义为ER和/或PR阳性，HER2阴性，Ki-67低（<14%）；内腔B型肿瘤呈ER和/或PR阳性，HER2阴性，Ki-67高（或任何Ki-67状态和HER2扩增）；ER和PR阴性的基底样肿瘤，HER2未过度表达或扩增；以及HER2过表达肿瘤为ER和PR阴性、HER2过表达或扩增。
福尔马林固定、石蜡包埋的人类乳腺组织切片和新鲜分离的RNA，缺乏任何患者识别信息，经患者同意或商业化（Biomax或OriGene），获得加州大学旧金山分校IRB批准。如前所述进行免疫荧光25对于miRNA和mRNA分析，检查了15个非恶性、25个管腔A、25个管腔B、25个基底样和15个HER2+样本。为了分析石蜡包埋切片，检查了10个非恶性、20个管腔A、20个管腔B、20个基底样和35个HER2+样本。
生物信息学
为了生成热图图像，我们通过计算所有患者的归一化表达估计值或未转换DRFS值之间的成对Spearman相关系数，估算了mRNA和miRNA丰度与患者预后之间的相关性，并利用欧氏距离对得到的相关矩阵进行聚类。我们通过对数据进行多元cox回归模型拟合，将一组乳腺癌中miR-18a的表达与DRFS相关32，33在该模型中，我们按亚型对患者进行分层55，56包括独立协变量，将miR-18a表达、患者年龄和肿瘤大小建模为连续变量，将肿瘤分级和淋巴结存在作为二元因素。在回归模型的框架内，我们使用Wald检验估计了每个协变量与DRFS的关联性的重要性，以生成P（P）-值。我们通过绘制miR-18a表达的上四分位数和下四分位数内患者的存活率随时间的变化曲线，将每个亚组的患者存活率可视化为Kaplan-Meyer曲线。
统计
采用非配对学生t检验、双向方差分析、一般线性模型、Fisher精确检验或Mann-Whitney U检验（如适用）进行统计分析。用Kolmogorov-Smirnov检验分析小提琴图中的表达估计值。我们使用Minitab软件对数据进行统计分析。P（P）-小于0.05的值被认为是显著的。
