人类异染色质蛋白1α促进推动染色质凝聚的核小体结合^*

核小体系统的制备

未经修改的重组，非洲爪蟾根据标准方案制备H2A、H2B、H3和H4组蛋白(22). 根据前面描述的方法，使用合成的H3 1–23肽（威斯康星大学生物技术中心）通过天然化学连接生成赖氨酸9的均匀三甲基组蛋白H3(23). 根据标准技术组装甲基化和非甲基化组蛋白八聚体(22). 分别使用EcoRV和ScaI从含有601-177-12的质粒中分离出601-177-11和601-177-1 DNA模板(24). 如前所述，通过PCR扩增制备载体DNA(25). 601-177-1单核小体通过快速稀释沉积制备，八聚体与DNA的摩尔比在0.8到1.2之间(26). 如前所述，601-177-12阵列通过盐步透析组装(24)，模板与载体的比率为1.0:0.3:1.1–1.3。

如前所述，通过天然PAGE分析表征单核小体组成/饱和度(26). 使用四种不同的技术对核小体阵列的组成/饱和度进行了表征。1） 阵列组成通过如上所述的天然PAGE分析通过ScaI消化产物的分辨率来确定(27). 2） 如前所述，使用Ultrascan（8.0版）中的增强型van Hold-Weischet方法，在Beckman XL-a ProteomeLab超离心机中以12000 rpm的转速测定阵列沉降系数的分布(28). 3） 通过蛋白质共轭分析测定核小体阵列中DNA和组蛋白组分的绝对平均分子量。在这种方法中，在50μl缓冲液（10 m）中加入～6μg阵列米HEPES，2.5米米氯化钠，0.1米米EDTA，pH 8.0）通过尺寸排除HPLC色谱（7.8×300 mm，5μ米，2000Å，Wyatt Technology），等度流量为0.5 ml/min的HPLC缓冲液（10 m米Tris，2.5米米氯化钠，0.1米米EDTA，pH 8.0）。洗脱的峰经过蛋白质共轭分析（Astra版本6软件，Wyatt Technology），其中峰通过紫外可见吸收（SPD-20A紫外检测器，岛津科学仪器）、折射率变化（Optilab T-rEX，Wyatt-Technology）、，和多角度静态光散射强度（Dawn Helios II，Wyatt Technology）。对于蛋白质共轭分析，使用两个摩尔消光系数（23.8 ml·mg⁻¹·厘米⁻¹对于DNA和0 ml·mg⁻¹·厘米⁻¹组蛋白八聚体）和差异折射率（DNA为0.178 ml/g，组蛋白八聚体为0.185 ml/g）。4） 为了直接计算每个阵列的核小体数量，低密度条件下（8 m）阵列的电子显微镜图像米NaCl），如正文所述。在这些图像中，只统计了明显是单个阵列的核糖体阵列。

EMSA分析

HP1型^Hsα在50米内透析米HEPES，pH值8150 m米氯化钠，1米米EDTA和10%甘油。对于我们的标准EMSA分析，核小体阵列或单核小体（8 n米核小体终末）与HP1混合^Hsα（500牛顿米最终），总体积为20μl（50 m米氯化钠，23.33米米HEPES，pH值8，0.067%三（2-羧乙基）膦，0.33 m米EDTA，最终缓冲液浓度）。HP1^Hsα-将含有核小体阵列或单核小体混合物在4°C下轻轻混合30分钟，然后涂抹在50 m制成的0.5%琼脂糖（IV型）凝胶上米HEPES，pH 8和150 m米NaCl缓冲液，并在70伏和0.4安培的相同缓冲液中在4°C下电泳2小时。对于离子强度不同的实验，将结合混合物和凝胶中的NaCl浓度调整为适当的浓度。用Sybr Gold（Invitrogen）观察凝胶。

以下模型用于计算HP1结合的12分子核小体阵列的EMSA半衰期如何与解离常数为K（K）_D类如果HP1的初始浓度远大于单核小体的初始浓度，则概率，P（P），一个特定的单核小体被HP1结合如下。

对于具有n个核小体，其中每个核小体可以结合HP1分子，如果1）每个核小体能独立地结合HP1，2）每个核小体能以与单核小体相同的亲和力结合HP1，P（P）HP1的初始浓度远大于核小体(即HP1不限制），则精确绑定的概率k个核小体，P（P）_k个，是数组可以具有的所有方式的总和k个核小体结合n个−k个核小体未结合。

如果k个或多个HP1分子需要结合才能观察到EMSA凝胶位移，最极限的情况是需要一个HP1结合到阵列才能产生凝胶位移，即凝胶位移发生在k个是一个或多个，则概率为k个等于一个或多个是简单的单位减去概率k个等于零。因此，对于12-mer阵列，请参见方程式3.

对于半阵列移位的情况，即50%的阵列具有一个或多个HP1分子结合

然后，

也就是说，如果只有一个HP1需要与阵列结合以产生凝胶位移，则HP1的初始浓度仅为K（K）_D类for和单个核小体需要半衰期，或者阵列的表观半衰期浓度是单核小体的16.8倍。

尽管所做的一些假设在实践中可能不成立，但与这些假设的合理偏差往往支持这样的观点，即阵列以与单个单核小体根本不同的方式结合HP1。例如，如果需要多个HP1来绑定阵列并生成EMSA偏移（非常合理的可能性），则表观半偏移浓度将小于16.8倍。再举一个例子，如果与阵列中的核小体结合不是独立的(即一个核小体的结合影响其他核小体的结合），或者核小体之间的结合不相同，那么根据定义，将单个核小体串联成阵列的行为会改变核小体与HP1的相互作用方式。最后，如果HP1是限制性的（在阵列HP1滴定中可能是这种情况），则半饱和浓度可能高于如果HP1不是限制性的则观察到的浓度。

电子显微镜样品的制备

HP1型^Hsα（500牛顿米)与阵列孵育（68–86 n米核小体）在50μl结合溶液（8或50 m）中米氯化钠，23.33米米HEPES，pH 8.0，0.33 m米EDTA）在4°C下保持30分钟。通过在4°C下对160 ml含有0.1%戊二醛和3.24%甘油的结合缓冲液进行透析4 h来固定样品。然后将样品通宵透析至2.5 m米氯化钠，10米米HEPES，pH 8.0，4°C。固定阵列用50米稀释了5至10倍米NaCl，施加在辉光放电碳薄膜上5分钟，用5米水洗米醋酸镁，用0.04%醋酸铀酰水溶液染色10s，然后用H清洗₂O并风干。使用Tecnai 12 TEM（FEI Co.，Hillsboro，OR）在100 kV下以倾斜暗场模式对电网进行检查，并使用2048×2048 CCD摄像机（TVIPS，Gauting，Germany）记录图像，并进行2×2装箱。最终像素大小为0.908 nm。盐浓度超过50 m米未对NaCl进行分析，因为阵列发生了显著聚集。对多个颗粒进行统计分析；在分析中只使用了与相邻阵列很好地分离的阵列。

差异沉积分析

HP1存在下核小体阵列的可逆自结合^Hsα使用前面描述的差异沉淀分析进行表征(29)简单地说，HP1^Hsα缓冲区内（150 m米氯化钠，50米米HEPES，0.2米米EDTA，pH 8.0）稀释至13.2μ米最终缓冲浓度为150 m米氯化钠，12.5米米HEPES和0.05 m米EDTA公司。在与阵列混合之前，HP1^Hsα添加到不同浓度的氯化镁中₂阵列内缓冲器（2.5 m米氯化钠，10米米Tris，pH 8.0，0.25 m米EDTA，0.1米米三（2-羧乙基）膦）生成2×MgCl₂和HP1^Hsα然后将溶液与核糖体阵列（9.1 ng/μl最终浓度模板DNA）等量混合。在室温下培养15分钟后，在14000×克持续10分钟。通过比较A类₂₆₀每个样品的A类₂₆₀不含MgCl的样品₂补充。

HP1的分子动力学模拟^Hsα构象动力学

人类HP1的分子动力学模拟^Hsα用二聚体评估CD的运动范围。使用Gromacs软件（版本4）进行了八种不同的显式固体分子动力学模拟(30,46)：人类野生型HP1的四个独立模拟^Hsα二聚体和铰链缺失ΔHP1的四个独立模拟^Hsα二聚体（删除残基Pro-81–Gly-116）。每个模拟都是用CD相对于二聚体CSD的不同起始几何形状进行的，每个模拟进行100 ns，坐标每1ps保存一次以供分析。为了评估二聚体内CD之间的距离，我们测量了形成每个H3K9Me3结合位点的三个残基（Tyr-19、Trp-40和Phe-43）芳香环的质心之间的距离。

HP1的硅建模^Hsα-染色质相互作用

所有模型的建立都是使用分子建模软件VMD完成的(31)视觉评估立体碰撞。至HP1型^Hsα，我们手动定位CD的高分辨率结构(32)和CSD(10)使得CDs靠近H3 N-末端尾部从核小体核心离开的位置，并且CSD足够靠近CDs，使得可以使用分子建模程序Loopy连接连接结构域(33). 然后我们用Loopy完成组蛋白H3的尾部。Loopy建模的区域没有违反原子键约束。以高分辨率的单核小体晶体结构为出发点，构建了单核小体和双核小体的完整原子模型(46). 鉴于HP1的构象灵活性很高，因此得到的模型仅代表了可能存在的多种结构中的一种。

果蝇培养

果蝇属砧木在标准蔗糖/玉米粉培养基上保持室温。LacI-HP1a和拉科重复的转基因库存在前面已经描述过了(34). 对于遗传互补性研究，建立了遗传杂交以将给定转基因的单个拷贝引入反式-杂合子HP1a突变背景，在整个发育过程中，产生的幼虫每天在37°C下热休克1小时。

HP1^HsαCD和CSD在体内外核小体相互作用中发挥重要作用

确定HP1的作用^HsαHP1野生型和突变型核小体结合、滴定研究中的结构域^Hsα已执行(图3A类). 一台HP1^Hsα具有氨基酸替代物W71A（CD突变）的突变体，可消除与组蛋白H3K9Me3肽的结合(图1C类) (36)未显示与甲基化阵列和甲基化（和非甲基化）单核小体的显著结合(图3,A类和B). 一台HP1^Hsα具有氨基酸替代物I195E的突变体（CSD突变体），废除HP1^Hsα二聚化（数据未显示），也未能显示与这些底物的结合(图3,A类和B). 因此，CD和CSD在结合甲基化单核小体以及甲基化核小体阵列方面都起着关键作用。

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图3。

HP1的功能决定因素^Hsα和HP1a与核糖体底物的结合。 A类HP1的EMSA分析^Hsα和甲基化(甲基)12-mer核小体阵列（8。0个米177bp的DNA重复序列）。用SYBR Gold染色检测阵列。注意野生型HP1的半饱和^Hsα16n时发生结合米而这两个突变体即使在500 n时也不能结合米.BHP1的EMSA分析^Hsα和32.0 n米非甲基化(Unmeth公司)或含组蛋白H3K9Me3的单核小体(单声道).C类HP1a有无铰链结构域的染色体定位。从野生型HP1a的表达拯救的幼虫中制备多聚体染色体(左侧面板)或HP1a缺少铰链（ΔH（H）;右侧面板)并用识别与HP1a融合的LacI标签的抗体染色。C类表示中心区域；31表示染色体2L上的细胞学区域31，这是一个已知与HP1a结合的常染色区域。

为了扩展我们的体外观察，我们执行体内分析使用黑腹果蝇，它提供了一个遗传系统来测试突变HP1蛋白的功能。我们选择的果蝇属基于人类HP1^Hsα拯救由基因突变引起的死亡苏（var）2-5，编码HP1a的基因(37). 表达标记的野生型和突变型HP1a的转基因果蝇，类似于用于体外进行了实验。

我们测试了这些HP1a转基因是否可以挽救Su（var）2-5反式-杂合突变体(表1)在三龄后期死亡(38). 标记的HP1a的野生型和突变型均通过每日热休克诱导的热休克启动子表达。Western分析显示，突变蛋白的表达水平彼此相似，并与内源性HP1a水平相当（数据未显示）。野生型HP1a部分抢救致死；根据孟德尔比率，42%的预期班级能活到成年(表1). 相反，含有V26M（CD突变体）的HP1a破坏了与组蛋白H3K9Me3的相互作用，未能挽救。同样，含有氨基酸替代物I191E（CSD突变体）的HP1a，导致HP1a同源二聚体缺乏，也未能挽救。为了确定CD和CSD是否足以维持生存能力，对含有铰链区域缺失（氨基酸83–131，ΔH）的HP1a突变体进行了测试。这个突变体拯救了18%(表1). 因此，HP1a的基本功能需要CD和CSD，而不是铰链。

铰链缺失挽救了致命性这一事实令人惊讶，因为染色体定位被归因于铰链(39). 为了确定铰链缺失的定位，用HP1a抗体对多烯染色体进行染色。定位模式与野生型HP1a拯救苍蝇中观察到的HP1a定位模式几乎相同(图3C类). 这些数据为铰链缺失的救援提供了解释。

高功率1^Hsα与核糖体阵列结合促进染色质凝聚

直接了解HP1的结构含义^Hsα结合核小体阵列，我们用电子显微镜（EM）观察了结合阵列。两种离子强度条件（8 m米和50米米使用NaCl）(图1A类)扩展阵列时，每个阵列可以观察到12个核小体，这证明了该方法的敏感性。对显微照片进行分析，以了解HP1引起的阵列冷凝变化^Hsα使用两个已发布方法绑定(40). 首先，包围核小体阵列的最小圆的半径，定义为最小边界半径(第页)，以任意单位报告被用作测量单位。每个的频率第页值以直方图格式显示(图4,C类和D类). 其次，计算每个阵列的可见粒子总数(图4,E类和F类). 其基本原理是，缩合会促进核小体的结合，从而减少粒子数。每个阵列的粒子总数因核小体饱和度的差异、EM网格上放置的核小体重叠以及核小体之间的结合相互作用而不同。每个阵列的粒子分布不是高斯分布，因此使用非参数Kolmogorov-Smirnov检验比较了分布。

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图4。

HP1的电子显微镜分析^Hsα-核糖体阵列复合物。 A类和B，HP1的代表性EM图像^Hsα与含有未修饰组蛋白H3和H3K9Me3的12聚体核糖体阵列结合(A类)或50米米(B)氯化钠。平均最小边界半径(第页)表示包含给定阵列的最小圆的半径（以任意长度为单位，美国。).C类和D类，频率直方图第页从8 m和50 m确定的值米NaCl条件。因为第页值是连续的，任意的阈值半径(下的值这个刻度线)已选定。含有第页将阈值之间的值制成表格，其中每个样品分析的颗粒总数由以下公式表示n个.本次装箱第页使用数值以图形方式显示此分布，但未用于统计分析。E类和F类，8米和50米处每个核小体阵列的粒子数频率直方图米NaCl条件。粒子从EM图像中计数，表示单个核小体或无法解析的致密核小体簇。

在不含组蛋白H3K9Me3、HP1的低离子强度下^Hsα没有显著改变数组的压缩(图4,A类和C类;第页= 0.300). 相反，含有组蛋白H3K9Me3的阵列在HP1上表现出致密性^Hsα添加(图4,A类和C类;第页= 6.7 × 10⁻⁵)，平均值为第页值从15.3±0.5个任意单位降至12.9±0.4个任意单位，表明HP1^Hsα促进甲基化核糖体阵列的凝聚。同样，甲基化和非甲基化阵列之间的颗粒计数在统计学上也没有显著差异(图4,A类和E类;第页= 0.285). 添加HP1后^Hsα，在非甲基化阵列中的分布向较少的颗粒转移，而甲基化阵列的变化更为明显。由于添加HP1，非甲基化阵列中的分布变化^Hsα具有统计学意义(图4,A类和E类;第页=0.014），与HP1一致^Hsα即使在没有核小体甲基化的情况下也能够促进核小体结合。添加HP1后的分布变化^Hsα甲基化阵列也有统计学意义(图4,A类和E类;第页= 4.3 × 10⁻⁸). 此外，HP1存在时甲基化和非甲基化分布的差异^Hsα具有统计学意义(第页= 3.3 × 10⁻⁴).

增加的离子强度已被证明会导致核小体阵列致密化(41). 事实上，随着离子强度的增加，甲基化和非甲基化阵列在视觉上更加浓缩(图4,B与…相比A类),第页价值(图4,D类与…相比C类)、和粒子数(图4,F类和E类). 添加HP1后^Hsα对于这些更致密的阵列，甲基化阵列显示出更强的致密性(图4,B和F类)：的第页数值和粒子数减少(第页=0.0012和6×10⁻¹¹分别）。这与预压缩非甲基化阵列形成对比，其中HP1^Hsα导致颗粒计数无明显变化(第页=0.148），并导致第页值从11.2±0.5到12.9±0.5(第页= 0.012). 因此，HP1^Hsα在含有组蛋白甲基化的阵列中增加现有的缩合。总之，EM分析表明HP1^Hsα促进阵列内核小体的结合，特别是当阵列容易凝聚时。

HP1型^Hsα促进阵列内和阵列间交互

核糖体阵列可以被诱导进行可逆的链间相互作用(29)，并绑定到HP1^Hsα可能会影响这种互动。为了直接测试这一点，进行了差异沉降分析(29). 随着HP1含量的增加培养非甲基化阵列^Hsα没有增强阵列的自关联倾向(图5A类,左侧面板). 相反，含有组蛋白H3K9Me3的阵列随着HP1浓度的增加而孵育^Hsα使阵列对镁诱导的缔合更敏感(图5A类,中间面板). 此外，这种增加的阵列自结合倾向需要二聚化，如HP1^Hsα二聚缺陷（CSD突变）并没有促进H3甲基化阵列的自结合(图5A类,右侧面板). 这些数据表明，体外，HP1型^Hsα二聚体与H3甲基化核小体相互作用，促进阵列内和阵列间相互作用。

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图5。

HP1诱导的阵列间相互作用^Hsα. A类、具有非甲基化和甲基化核小体、野生型和突变型的核小体阵列阵列间关联的差异沉降分析(静音)HP1的版本^Hsα.上清液中物质的百分比绘制为二价镁离子浓度的函数。误差线代表至少三个重复的S.D星星代表由学生的t吨使用测试分析第页截止值0.05。B，HP1a桥接遥远染色体位点的细胞学证据。LacI-HP1a融合蛋白在具有紫胶插入X染色体端粒附近的操作符重复(箭头)在其他野生类型的背景中。对三龄幼虫多线染色体进行固定，并用LacI抗体进行染色。HP1a系留导致36%的染色体折叠和环状。这些环是由HP1a醚化位点和一个遥远的染色体位点之间的相互作用形成的(两个右侧面板). 相反，将对照LacI-GFP连接到同一基因组位点产生了分离的线性染色体，这种相互作用的数量减少了(左侧面板).T型表示端粒。

系绳果蝇属HP1a对基因组中特定位点的作用导致染色体循环(42,43)，类似于我们的体外观察(图5B). 为了确定这种相互作用的需求，我们在遗传背景中表达了LacI-HP1a融合蛋白拉科插入特定基因组位点的序列(42). 固定多聚体染色体，用抗LacI抗体染色，并用光学显微镜检查。在这些制备中，36%与野生型HP1a结合的染色体表现出环状和/或折叠结构，其中HP1a系留位点与一个遥远的染色体位点相关(图5B). 相比之下，只有8%的对照组LacI-GFP结合染色体显示出折叠结构，其余染色体显示出HP1a系留位点，该位点与其他染色体区域没有相互作用(图5B). 此外，不能二聚化的HP1a突变体I191E仅显示16%的相互作用，这与CSD对体外核小体阵列相互作用(图5A类,右侧面板). 综上所述，这些数据表明HP1a二聚体可以促进核小体模板上的远距离相互作用。