阿尔茨海默病TDP-43病理分期

摘要

介绍

2006年，两名独立研究人员报告称，43 kDa的TAR DNA结合蛋白（TDP-43）在额颞叶退行性变（FTLD）和运动神经元病（MND）患者的脑部病理学上积累[2,31]. 随后，我们证明，在阿尔茨海默病（AD）患者的大脑中也检测到TDP-43病理学[1]. 这一发现已被许多不同研究小组证实[三,4,9,14,15,18,20,22,33,37]. 当评估50多名AD患者的研究被回顾时[1,三,4,9,37] (表1)，患有TDP-43的AD患者的比例在19-57%之间，研究中的一个共同发现是TDP-43与死亡时的高龄相关。

我们之前已经证明TDP-43在AD中的分布是可变的，并且可以显示两种模式之一[1]. 在第一种模式中，TDP-43免疫反应仅限于海马的内嗅皮层和齿状回，枕颞皮层（OTC）很少或没有受累，而在第二种模式中免疫反应更广泛，涉及OTC和颞下回。虽然我们将前者称为边缘回，随后对29例AD病例进行的一系列独立研究发现，TDP-43可以沉积在杏仁核中，而不会额外累及海马齿状回或其他部位[15]. 事实上，很明显，评估杏仁核的研究发现，TDP-43免疫反应阳性的AD患者比例较高(表1). 此外，对局灶性杏仁核受累的识别提出了一个问题，即AD中TDP-43的沉积是否从杏仁核开始有一个连续的过程。

FTLD中神经元内含物的形态和分布的多样性导致了泛素对FTLD进行亚型的两种独立方法[25,34]. 这两种分类系统得到了协调[26]尽管这些方案没有提供对AD和其他疾病（如肌萎缩侧索硬化症（ALS））中发生的TDP-43进行分类的方法。共识别出三个主要亚型：A型以多形性神经元胞质内含物（NCIs）为特征，有时伴有神经元核内内含物（NIIs），以及上皮层中数量最多的营养不良性神经节（DN）；B型以NCI和胞质TDP-43为主，不形成定义明确的内含物（“前内含物”）和最少的DNA；C型DNA占优势，通常比a型DNA长且厚，并且在所有具有最小NCI的皮质层中都发现。B型和C型NII均不常见。不幸的是，在这些分型方案中，特征描述仅限于评估海马体和新皮质。

本研究的目的是制定AD患者TDP-43进展的分期方案，并确定临床、神经影像学和病理特征是否支持该方案。为了实现我们的目标，我们评估了195例具有TDP-43免疫反应的AD患者的临床、神经影像学和病理特征，包括TDP-43分型。

材料和方法

根据国家老龄研究所和里根研究所标准（NIA-Reagan），342例中高概率AD患者[40]和IV–VI期Braak神经纤维缠结（NFT）[6]本研究中使用了。在这342例患者中，195例有TDP-43免疫反应性，其余无。所有病例均于1992年至2005年间在梅奥临床阿尔茨海默病研究中心（ADRC）或阿尔茨海默氏病患者登记处（ADPR）进行前瞻性招募和随访。在本研究中，我们评估了教育程度、性别、发病年龄、死亡年龄、精神状态检查（MMSE）[12]，盒临床痴呆评分总和（CDR-SB）[29]，痴呆评定量表（mDRS）的记忆子核心[27]波士顿命名测试（BNT）[21]和载脂蛋白E(APOE的复数)e4状态[8,17].

简言之，神经病理学检查是根据建立AD注册协会（CERAD）的建议进行的[28]由两名委员会认证的神经病理学家（DWD或JEP）之一进行。每个病例都被划分为布拉克神经原纤维缠结（NFT）阶段[6]采用改良的贝尔肖夫斯基银染法，在NFT病理学最早出现的基础上。用α-同核蛋白染色法记录杏仁核外路易体的存在。在苏木精和伊红染色的切片上，海马硬化症（HpScl）被诊断为海马下叶和/或CA1区神经元缺失，与这些区域的NFT负荷不成比例[10].

对于TDP-43分析，对每个感兴趣区域的福尔马林固定石蜡包埋组织进行TDP-43免疫染色（识别25-kDa C末端片段中肽序列的多克隆抗体MC2085[42])以DAKO-自动染色器（加利福尼亚州卡宾里亚的DAKO-Cytomaton）和3，3'-二氨基联苯作为染色原。切片用苏木精轻微复染。本研究对以下区域进行了综述：杏仁核、内嗅皮层、副脑室、海马齿状回、OTC、颞下皮层、额叶中皮层和基底神经节。对于基底神经节，我们评估壳核、苍白球和尾状核。两名观察员（DWD、KAJ）同时检查了所有载玻片，他们同意在任何区域都存在TDP-43免疫反应性，定义为NCIs、DN或NIIs（TDP-阳性）。杏仁核中TDP-43沉积的严重程度按四分制评分（1=不足[仅一到两个内含物]，2=稀疏，3=中等，4=频繁）。根据协调标准对海马或新皮质TDP-43免疫反应性内含物患者进行TDP-43分型[26].

二百四十八例患者根据标准化方案进行了尸检体积MRI扫描，如前所述[16]. 在这项研究中，使用了最接近死亡的MRI扫描。预处理步骤包括校正梯度非线性和强度不均匀性[35]. 在SPM5和自动解剖标记（AAL）图谱中使用基于图谱的分割方法测量杏仁核、海马、内嗅皮层、OTC、颞侧叶和额叶外侧的灰质体积[36]，如前所述[38]. 选择这些区域来反映病理分析中包含的区域。对每个区域的左右体积进行平均。如前所述计算颅内总容积[39]，用于校正头部大小的差异。

使用分类变量的齐方检验和连续变量的方差分析来评估人口统计学和病理学变量。显著性设置为p<0.05。如果方差分析显著，则进行方差不等的事后t检验。用方差分析和logistic回归评估临床和神经影像变量，并将测试时的年龄和从发病到测试的时间作为协变量。临床和神经影像连续变量与分期方案之间进行配对相关。利用JMP（JMP软件，9.0.0版；SAS Institute Inc.，北卡罗来纳州卡里市）进行统计分析。结果报告为中位数（四分位数范围）。

结果

AD分段方案中的TDP-43

在195例TDP阳性病例中，有3例缺少一些石蜡块，因此被排除在进一步分析之外。因此，对192例患者进行了分期。根据AD中TDP-43区域沉积的序列进展，确定了五个阶段(表2).

表2

各期区域TDP-43免疫反应模式

	扁桃形结构	内脏	Subiculum公司	牙齿	非处方药	劣质 世俗的	中部 正面的	基础 神经节	N（%）以内 阶段
第一阶段	+	−	−	−	−	−	−	−	32 (97%)
	+	−	−	−	−	−	−	+	1 (3%)
第二阶段	+	+	+/−	−	−	−	−	−	43 (90%)
	+	−	+	−	−	−	−	−	5 (10%)
第三阶段	+	+	+	+	+/−	−	−	−	55 (93%)
	+	+	+	−	+	−	−	−	2 (3%)
	+	+	−	+	+	−	−	−	1 (2%)
	+	−	+	+	−	−	−	−	1 (2%)
第四阶段	+	+	+	+	+	+	−	−	38 (97%)
	+	+	+	−	+	+	−	−	1 (3%)
第五阶段	+	+	+	+	+	+	+	+/−	12 (92%)
	+	+	+	+	+	−	+	+	1 (8%)

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OTC=枕颞皮质

第一阶段包括33例（17%），杏仁核很少或很少受累(图1). 这33例患者均未表现出内嗅皮层、脑室下层、海马齿状回、OTC、颞下皮层或额叶中皮层受累。然而，有一例患者的杏仁核和基底神经节中缺少TDP-43免疫反应性内含物(表2).

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图1

五个阶段代表性病例的病理结果

在第一阶段，仅在杏仁核中观察到少量解析TDP-43免疫反应性内含物。在第二阶段，包涵体在杏仁核中较为常见，并延伸至内嗅皮层，但在齿状、OTC、颞叶或额叶皮层中未发现。在第三阶段，包涵体延伸到海马和OTC，但在颞叶或额叶皮质中未发现。在第四阶段，包涵体延伸到颞下皮质。在V期，TDP-43免疫反应广泛，影响额叶皮质或基底神经节。巴=30微米。所有图像的放大倍数都相同。箭头指向NCI。

II期包括48例（25%），均累及杏仁核和内嗅皮质或黑质(图1). 在这些病例中，TDP-43在杏仁核中的沉积频率较低。48例患者中有43例TDP-43沉积在内嗅皮层，其中29例还累及副脑室。II期5例患者未显示内嗅皮层受累，但杏仁核和黑质中有TDP-43免疫反应(表2).

III期59例（31%）。所有III期病例均累及杏仁核，除2例外，所有病例均累及其内嗅皮质和副脑室(表2). 所有III期病例均显示累及海马齿状回或OTC(图1). 这59例病例中的大多数（n=51）同时累及海马齿状回和OTC。然而，有6例患者表现为海马齿状回受累，但未涉及OTC，有2例表现为OTC受累，而齿状回未受累(表2).

IV期39例（20%）。所有病例均累及杏仁核、内嗅皮质、副脑室、OTC和颞下皮质(图1). 除一例外，所有病例均累及海马齿状回(表2).

V期13例（7%）。除一例外，所有V期患者均受累于杏仁核、内嗅皮质、副脑室、海马齿状回、OTC和颞下皮质。所有V期病例均累及额叶中皮层或基底节(图1). 在这13例患者中，11例同时累及额叶中皮层和基底神经节，2例仅累及额叶中皮层。1例患者未显示颞下皮质受累(表2).

AD I-V期TDP-43与TDP-阴性AD的比较

我们还比较了五个阶段中每个阶段的临床和神经影像学特征，以及147例没有TDP-43免疫反应性内含物（TDP-阴性）的AD患者(图2). 与上述结果一致，临床变量和海马体积存在分级差异，与TDP阴性AD相比，I期差异最小，其次是II期、III期和IV期。内嗅皮层体积也随着阶段的增加而下降，尽管在第三阶段与TDP阴性AD的差异最大，但第五阶段的临床表现、海马和内鼻容积与第四阶段相似，尽管p值不太显著。第一阶段AD患者与TDP阴性AD患者之间唯一表现出显著差异的变量是BNT。相反，除了第二阶段的内嗅皮层外，第二阶段、第三阶段、第四阶段和第五阶段AD患者和TDP阴性患者之间的所有变量都存在差异。

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图2

折线图显示TDP阴性病例与所有五个阶段之间存在显著差异

数据点表示每个变量的中值*p<0.05**p<0.01***p<0.001海马和鼻内MRI体积显示为体积/TIV×100。MMSE=迷你精神状态检查，CDR-SB=临床痴呆评分框总数；mDRS=痴呆评定量表的记忆分量表；BNT=波士顿命名测试。

讨论

在我们的大型患者队列中，我们确定了显示TDP-43在AD中沉积的定型进展的五个不同阶段。AD中TDP-43的沉积首先发生在杏仁核（阶段I），然后发展到内嗅皮质和下室（阶段II），然后是海马齿状回和OTC（阶段III），然后到达颞叶（IV期）和额新皮质和基底神经节（V期）。该分期方案通过与临床和神经影像学变量的显著相关性进行了验证，对AD未来的临床、神经影像学、病理甚至基因分析都很重要。

根据对AD中TDP-43系统性进行性区域性沉积的观察，制定了分期方案。本研究中的所有病例均累及杏仁核，大部分病例仅累及杏仁体，表明沉积首先发生在杏仁核，然后在其他部位进行。根据这一区域受累的概念，内嗅皮层和黑质是次常见受累区域。然而，很难准确确定内嗅皮层在黑色素瘤发生之前是否受到影响，反之亦然，因为我们有例内嗅受累但不累及黑色素瘤，有例内鼻腔受累但未累及黑素瘤。虽然我们观察到内嗅皮层受累的病例数多于内嗅皮质，但另一项研究发现，内嗅真皮受累的患者数多于内鼻皮质受累的案例数[三]. 我们观察到海马齿状回和OTC的进一步进展。这两个区域似乎同时涉及，因为绝大多数病例显示这两个地区都涉及。下一个明显受累的区域是颞叶皮层。有大量颞皮质受累的病例，但并未显示额叶皮质或基底神经节受累。此前曾报告过两起类似病例[三]. 在扩散到颞叶皮质的病例中，我们观察到大约三分之一的病例涉及额叶皮质和基底神经节。事实上，除两例外，所有病例中，只要额叶皮质受累，基底神经节也会受累。这种观察到的从杏仁核到额叶皮层和基底神经节的进展模式几乎占了100%的病例，只有少数异常值缺失了之前的区域，还有一例杏仁核和基底神经节受累。虽然很难确定顶叶受累是在额叶受累之后还是之前，但在之前的两项研究中已经对顶叶进行了评估[三,15]. 先前的研究表明，RNA结合蛋白，如TDP-43，具有朊蛋白样的特性，因此可以在细胞间传播[5,23]. 电子显微镜分析表明TDP-43具有丝状特性[24]TDP-43在AD中确实以定型方式进展，这一事实支持了这一假设。然而，尚不清楚为什么AD的区域进展与ALS中TDP-43的区域进展不同[7]以及为什么两者的进展都没有遵循既定的解剖路径。

分期方案扩展了先前研究的结果，这些研究报告了区域TDP-43参与AD的不同模式。在Amador-Ortiz等人的最初研究中，描述了两种模式；边缘和弥散[1]. 前者的定义是海马齿状回和内嗅皮质受累，而OTC很少受累。后者的定义是OTC和颞下皮质受累。因此，第三阶段最接近边缘组，而第四阶段和第五阶段最接近弥漫组。这与之前报道的边缘组比弥漫组更常见的事实相吻合[1]最常见的阶段确实是第三阶段。随后的研究确定了仅累及杏仁核的病例，但这些研究受到少数病例的限制，因此无法充分评估进展情况[三,13,15,22]. 类似地，以前只报道过两例杏仁核和内嗅皮质受累的病例[三].

通过证明所有五个阶段之间存在差异，我们确定了有助于验证TDP-43在AD分期方案中的临床、神经影像和病理差异。首先，第一阶段和其他四个阶段、第二阶段和第三阶段、第三阶段和第四阶段以及第四阶段和第五阶段之间存在显著的临床和/或神经影像学差异。这些发现不太可能是由发病年龄决定的，因为第三阶段的病例实际上是最老的，在我们的分析中，年龄是一个协变量。同样，就病程而言，与III期病例相比，II期病例的病程更长，但临床评分也没有更差。第二，HpScl的频率存在显著差异，第一阶段和第二阶段的频率较低，第三阶段、第四阶段和第五阶段的频率较高。事实上，第四和第五个阶段的频率明显高于所有其他阶段，除一个阶段外，所有第五阶段病例都患有HpSc1。海马硬化先前被证明与TDP-43沉积有关[1,9,11,18,22,30,32,37,41]，但在本研究中，我们进一步证明了这种关联是由阶段III-V驱动的。此外，第一阶段和第二阶段杏仁核TDP-43负荷存在差异，第一阶段显示少量分裂内含物，第二阶段显示中度频繁内含物。这一发现进一步证实了第一阶段与第二阶段的分离。我们没有观察到不同阶段APOE基因型频率的差异，这表明AD患者TDP-43的进展与APOE无关。

除了证明所有五个阶段之间的差异外，我们还证明了所有五个阶段与一大群TDP-43阴性的AD受试者之间的差异。此外，与没有TDP-43的AD患者相比，我们发现认知障碍的分级恶化，包括记忆丧失和命名困难，以及海马体和内嗅皮层的体积损失。临床和神经影像学变量的下降也与I期至V期的进展相关。

有趣的是，第一阶段出现显著下降的唯一变量是BNT；对抗性命名测试。虽然MMSE、CDR-SB和mDRS之间缺乏差异可以用I期病例中无内嗅和海马萎缩来解释，但尚不清楚为什么BNT出现异常。一种可能是，与其他认知测试检测其他认知领域细微变化的能力相比，BNT检测语言细微变化的敏感性。事实上，在我们之前的一项研究中，受试者数量要少得多，因此功率较小，我们评估了TDP-43对AD的影响，只有BNT在有TDP-43和无TDP-43的AD病例中存在差异[18].

以前，我们和其他人已经将TDP-43分型应用于AD病例[三,18,37]关于输入的结果有些矛盾。我们最初在29例小样本中报告说，大多数病例为B型[18]而另外两项研究报告称，最常见的类型是A型[三,37]. 在本研究中，在我们能够应用分型的海马或新皮质受累患者（III、IV和V期）中，A型病理学确实是最常见的，在IV期观察到的A型比例最高。V期的两例患者和III期的一例患者具有C型FTLD-TDP的特征。有趣的是，一例临床诊断为AD的V期C型患者在神经影像学上有明显的失语症和前内侧颞叶萎缩（让人想起语义性痴呆），TDP-43的病理负荷与FTLD中观察到的相似(图3). 因此，无论何时在伴有显著失语症和颞叶前内侧萎缩的患者中确定AD病理，都应评估TDP-43病理。我们无法将分型方案应用于I期和II期病例，因为分型方案基于海马和新皮质TDP-43沉积。然而，通过利用一项研究中的信息，在额颞叶退行性变的TDP-43类型中评估包括杏仁核在内的皮层下区域的TDP-44形态，可以进行分型[19].

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图3

一例AD和TDP-43 C型病变的神经影像学和病理学表现

顶部面板显示三个冠状T1加权MRI切片，突出显示左前内侧颞叶萎缩。底部面板显示与FTLD C型一致的TDP-43免疫反应性内含物，包括额叶（a）和岛叶（b）皮质中的长而厚的DNA，以及壳核（C）和海马齿状回（d）中的Pick体样NCI。Bar=30微米

总之，我们已经确定了AD中TDP-43免疫反应的五个不同阶段。基于这些发现，我们建议从评估杏仁核开始对AD中的TDP-43沉积进行病理筛查。如果阳性，我们建议根据各阶段涉及的区域进一步进行序贯筛查。现在需要进一步分析以确定额外的皮层、皮层下和脑干区域与这五个阶段的关联，以及各阶段之间是否存在生化差异。

确认

脚注

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