清除^T型：一种用于神经元和非神经元组织的清洁剂和无溶剂清洁方法

试样的制备和清理程序

小鼠的护理和繁殖程序遵循哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会的监管指南。发现塞子的当天中午被认为是E0.5。C57BL/6J野生型和肌动蛋白-从用氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉的母亲处取出GFP小鼠胚胎（分别为100和10 mg/kg，置于0.9%盐水中）；出生后野生型，胸腺1-GFP（M-line）（美国纽约哥伦比亚大学J.a.Gogos赠送）和成人Tcf/Lef:H2B-GFP小鼠（美国纽约哥伦比亚大学E.Laufer赠送）用氯胺酮-木聚嗪（分别100和10 mg/kg，置于0.9%盐水中）麻醉，在4%多聚甲醛（PFA）/PBS（pH 7.4）中固定过夜，或在4°C下用PBS灌流和清洗。胚胎经心灌注以达到最佳清除效果。所有清除程序均在室温下进行。

清除^T型和清除^T2段组织清除法

每个溶液中的培养时间根据组织厚度而变化，以获得所需的透明度（参见表1详细信息）。

表1。

清算程序

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Sca公司我eA2已在前面介绍过(Hama等人，2011年). E14.5胚胎用Sca清除我eA2持续14天；DiI-标记的胚胎或CTB标记的切片分别治疗过夜或2小时。

BABB已描述(Dodt等人，2007年). DiI-标记的胚胎或CTB标记的切片在分别用30%、50%、70%和100%乙醇脱水1小时和己烷脱水1小时后，用BABB处理过夜或2小时。

DiI和CTB标记视网膜轴突

前面已经描述过顺行DiI标记(Plump等人，2002年). 将眼睛放回视杯中，并将头部在含有0.1%叠氮化钠的PBS中孵育如下：E14-E16，室温下5-7天；E17-P0，37°C下5-7天。如前所述，用CTB标记视网膜原体投射(Jaubert-Miazza等人，2005年；Rebsam等人，2009年)如前所述，在CTB标记的dLGN中进行单神经元标记(Krahe等人，2011年).

免疫组织化学

在室温下，在PBS（pH 7.4）中的5%BSA/1%吐温（Sigma-Aldrich）中封闭振动组和冷冻切片1小时。小鼠单克隆抗RC2（IgM）抗体（发育杂交瘤库）（1:4）和鼠单克隆抗神经丝（IgG）抗体（2H3）（美国纽约哥伦比亚大学T.Jessell和S.Morton捐赠）（1:5）在PBS中的1%BSA/1%吐温中4°C孵育过夜。用1%吐温在PBS中洗涤后，应用Cy3-结合的抗鼠IgM和Cy5-结合的抗小鼠IgG（1:500）二级抗体（Jackson），在4°C下在1%BSA/1%吐温的PBS中培养过夜。使用Hoechst 33258（分子探针）进行核染色。以前已经描述过用抗神经丝抗体对胚胎进行全程免疫标记(Huber等人，2005年).

成像

在蔡司AxioImager M2显微镜上用Apotome、AxioCam MRm相机、Neurouscida软件（V10.40，MicroBrightField Systems）对全脑或DiI、CTB或免疫标记切片或GFP标记小鼠切片进行成像；带5×物镜（FLUAR，NA=0.25，工作距离=12.5mm）、20×物镜(图2B、C；图2D，底部；图3C、D、F；补充材料图S3B，图S4）。利用结构照明原理，Apotome通过外荧光成像提供共焦样分辨率。Apotome通过获取光学部分的三幅图像并减去背景荧光信号来提高信噪比。使用蔡司解剖显微镜StemiSV11、Axiovision软件和AxioCam摄像头对整个头部和大脑进行成像(图1；图2A；图3A、B；补充材料图S1；图S2A）。使用尼康SMZ 1500变焦立体显微镜和DS-Qi1Mc相机对整个胚胎进行免疫标记成像(图3E). 使用蔡司Axioplan 2显微镜、AxioCam相机和Axiovision软件，使用10×物镜（PLAN-NEOFLUAR，NA=0.3）或20×物镜(补充材料图S2B、图S3A、图S5）。使用自制载玻片对厚样品进行成像，使组织浸没在甲酰胺溶液中，并用常规玻璃盖玻片覆盖：将塑料或硅橡胶的方形边缘超粘到常规玻璃载玻片上。

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图1。

快速组织清除清除^T型. (A类)整夜清除固定的完整胚胎（E14.5）和解剖的出生后大脑（P0）。通过清除的组织可以看到网格清除^T型. (B类)E14.5胚胎清除清除^T型或Sca我eA2分别在1天或14天内达到完全透明。(C类)清除^T型不会导致卷更改。P0截面（800μm），测量表面积：预先清除，红线；清除^T型，蓝线。(D类)用PBS（30分钟）可进行可逆清除。比例尺：1 mm。

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图2。

脑组织中的视网膜轴突投射被清除清除^T型. (A类)E15.5眼睛贴上DiI标签，下颌和舌头被切除，头部被清除清除^T型用DiI-标记的对侧（C）和同侧（I）视网膜轴突和视交叉在用清除^T型. (B类)E14.5 DiI-标记生长锥（GC）（箭头）和同侧视束轴突（箭头）的合并堆栈（41张图像，5μm步长）；在清除前后，从200μm脑切片的腹侧表面进行成像(C类)在E18.5处，DiI-标记的对侧RGC投射到丘脑和上丘。大脑在中线处进行矢状切割，并用清除^T型。合并堆栈（51张图像，20μm步长），从中线查看。丘脑（TH）和上丘（SC）dLGN中DiI-标记的RGC轴突在预先清除的组织中无法检测到，但清除后很容易看到(D类)将与Alexa Fluor 488或594结合的CTB注射到每只眼睛中，并用清除^T型。显示了组织切片表面以下250μm、450μm和600μm的光学切片（从71张图像中，10μm步长）。与清除前的相同组织相比，在清除的dLGN中，两个CTB标记都是可观察到的，尽管更深。比例尺：C中的1 mm（顶部）；A和C、D底部100μm（底部）；B中为10μm。

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图3。

清除^T2段用荧光蛋白或免疫组织化学方法清除组织。(A类)清除^T型清除E14.5肌动蛋白-GFP胚胎，但GFP荧光降低。甲酰胺（50%）保持荧光，但未能清除胚胎。清除^T2段清除胚胎并保持荧光。(B类)P0切片（800μm）在清除^T2段，没有音量变化。(C类)第11页您的1-GFP（M-line）海马切片（800μM），用清除^T2段; 38张图像，20μm台阶（顶部和中部）。GFP公司⁺清除后CA1区锥体神经元（箭头）和树突（箭头）明显可见；52张图像，2.5μm步长（底部）。GCL，颗粒细胞层；ML，分子层。(D类)E14.5视交叉（200μm）切片，用放射状神经胶质标记物RC2免疫标记，用清除^T2段; 51幅图像，3μm步长；显示了三个光学切片。RC2号机组⁺与预先清除的组织相比，清除后的组织染色更深。蓝色表示Hoechst染色。(E类)E11.5全胚胎，用神经丝抗体（NF）免疫标记并用清除^T2段.NF型⁺轴突在清除胚胎中更为明显（上图）；放大三叉神经轴突到达上皮靶点（底部）。(F类)出生后小鼠脑切片（300μm），dLGN顺行标记有与Alexa Fluor 594偶联的CTB。用生物细胞素填充单个神经元，并用链霉亲和素Alexa Fluor 647进行免疫染色。使用清除清除^T2段增强了神经元树突树突的分辨率和可见性。合并堆栈，55张图像，2μm步长。CTB标签为红色；充满生物细胞的神经元呈假绿色。比例尺：A、B、E中的1 mm；40μm；D、F中为20μm。

组织中DiI或CTB标记轴突的可视化清除^T型

通过亲脂性染料的顺行标记，可以显示正在发育的轴突的投射、连接和生长锥（GC）形态(Little等人，2009年；Bielle等人，2011年). 在这里，我们使用鼠标视觉系统，这是一个研究神经回路发展的经典模型，来演示使用清除^T型保存亲脂性荧光染料标记。我们用DiI顺行标记胚胎第14.5天（E）胚胎的视网膜神经节细胞（RGC）轴突，并用DiI处理胚胎清除^T型、Sca我eA2或BABB治疗1天。DiI标记的视神经和视交叉中的视网膜轴突在使用清除^T型，但用Sca治疗我eA2或BABB降低了荧光信号(补充材料图S2A）。

然后，我们检查了E15.5视交叉处清除组织中DiI-标记的RGC轴突(图2A). 在清理之前，DiI-标记的视网膜投影不可见，但可以通过清理后的头部的背部和腹部看到，颌骨和舌头被切除，但皮肤和头骨完好无损(图2A). 我们检查了清除前后同侧近端视束E14.5处DiI-标记轴突和GC精细形态学细节的分辨率(图2B). DiI-标记轴突和GC过程（如丝状足和足爪足）的数量和分辨率在清除后显著增加清除^T型(图2B). 此外，当从矢状窦旁半切面中线成像时，E18.5 DiI-标记的RGC轴突在清除前在丘脑和上丘中不可见，但用清除^T型，即使深度为～1 mm(图2C).

CTB广泛用于分析dLGN中出生后RGC轴突的靶向性(Jaubert-Miazza等人，2005年；Rebsam等人，2009年). 测试CTB与清除^T型，我们用与Alexa Fluor 488或594结合的CTB顺行标记P5幼崽的每只眼睛。CTB标记在清除^T型和BABB治疗，但BABB使组织大小减少一半（清除前=1±0，清除前=0.50±0.02，P（P）<0.05时，n个=4段），而标记在Sca后呈弥漫状态我eA2治疗(补充材料图S2B）。CTB标记可在用清除^T型，而在清除之前，在250μm以外无法看到荧光(图2D). 此外，在不损害组织或标签完整性的情况下，可以连续清除、不清楚（PBS中）和重新清除DiI或CTB标记的样品(补充材料图S3A、B）。

清除^T2段用荧光蛋白和免疫组织化学标记清除组织

我们的原件清除^T型方案降低了E14.5中绿色荧光蛋白（GFP）的强度肌动蛋白-GFP胚胎(Ikawa等人，1995年). 因为聚乙二醇（PEG）稳定蛋白质构象(Rawat等人，2010年)，我们研究了PEG是否能稳定GFP在甲酰胺中的表达。虽然50%的甲酰胺不能清除大脑，但20%聚乙二醇/50%甲酰胺混合物成功清除了脑组织并保留了荧光。此修改的方法名为清除^T2段也需要浸泡在一系列分级的甲酰胺/PEG溶液中（25%甲酰胺/10%PEG，然后50%甲酰胺/20%PEG）(表1B,图3A). 尽管组织透明清除^T2段与相比不太完整清除^T型，应用清除^T2段诱导厚厚的P0脑切片的稳健透明性，且无体积变化（清除前=1.0 vs清除^T2段=0.98±0.02,n个=6，不显著）(图3B). 用处理的截面清除^T2段1天或2天的变化略大于预先清除的切片，但这些变化明显小于Sca我eA2[1天，清除^T2段=1.30±0.02与Sca我eA2=1.81±0.05，P（P）<0.01; 2天，清除^T2段=1.30±0.01与Sca我eA2=1.83±0.06，P（P）<0.01,n个=6 (清除^T2段),n个=4个截面（Sca我eA2）](补充材料图S1）。清除^T2段还成功地维持了轴突中的DiI和CTB标记清除^T型(补充材料图S2A，B）。

接下来我们研究了神经元是否被荧光蛋白基因标记，如您的1-GFP（M系）小鼠(Feng等人，2000年)，可以用可视化清除^T2段(图3C). 用清除^T2段，您的1-GFP公司⁺颗粒细胞层内较深处可见神经元(图3C，顶部）和GFP详图⁺CA1区锥体神经元树突比未清除的更明显(图3C，底部）。确定是否清除^T2段可以应用于成人或非神经组织，我们使用Tcf/Lef:H2B-GFP小鼠，从胚胎早期到成年阶段，在神经元和非神经元组织中检测到报告基因表达(Ferrer-Vaquer等人，2010年). 大脑皮层神经元、海马颗粒细胞和分子层内细胞、小肠祖细胞和骨骼肌卫星细胞中的H2B-GFP核标记在用清除^T2段(补充材料图S4）。

免疫组织化学用于可视化蛋白质表达，但标记通常仅在厚组织切片中可见。为了检测免疫组织化学标记是否与组织清除兼容，我们通过视交叉用放射状胶质细胞标记物RC2抗体对E14.5冰冻切片进行免疫染色，并用清除^T型，清除^T2段、Sca我eA2或BABB(补充材料图S5A、B）。清除^T型和Sca我eA2干扰RC2免疫标记，BABB维持荧光信号，但在骨和细胞核中产生不应表达RC2的标记伪影。作为清除^T2段成功保存的免疫标记(补充材料图S5A-E），我们将其应用于E14.5处200μm RC2免疫标记的视交叉振动切片(图3D). RC2号机组⁺清除组织中的胶质突起深约120μm，是预先清除组织的两倍(图3D). 最后，清除^T2段用抗神经丝抗体（NF）免疫染色的整只小鼠胚胎处理后，可以完整地观察中枢神经系统中的轴突束和轴索，以及远端附件中的PNS(图3E).

最后，我们检查了清除^T2段与多个荧光标签兼容。申请后清除^T2段在带有CTB标记的dLGN的厚脑切片上，与清除前相比，生物细胞填充的中继神经元被显示得更深入，分辨率更高，两种标记都成功保持(图3F).

我们感谢梅森实验室的成员和哥伦比亚大学的同事韦斯·格鲁贝尔（Wes Grueber）的建议和阅读手稿，感谢约瑟夫·戈戈斯（Joseph Gogos）您的1-GFP（M-line）小鼠，Ed LauferTcf/Lef:H2B-GFP小鼠，以及Tom Jessell和Susan Morton的抗神经丝抗体。威廉·圭多（William Guido）实验室的托马斯·克拉赫（Thomas E.Krahe）为dLGN中充满生物细胞的细胞制作了额外的切片制剂（未显示）。