直接连接DNA末端的末端连接准确性
我们将首先在两个生物模型中讨论NHEJ，草履虫属以及哺乳动物细胞，在这些细胞中，这种途径特别重要。草履虫属提供了C-NHEJ对数千个发育程序化DSB精确修复的有效贡献的生理学示例[45]在哺乳动物细胞中，C-NHEJ是一种显著的DSB修复机制，在建立免疫储备的基本过程中至关重要。NHEJ的准确性将在酵母、细菌和植物中以及在剪切和粘贴换位过程中得到解决。
与其他纤毛虫类似，草履虫属细胞质中有两个不同的细胞核。在营养生长期间，二倍体微核（MIC）通过有丝分裂分裂，但在转录上保持沉默，而高度多倍体大核（MAC）确保基因表达。在性爱过程中，MAC被分割并最终丢失。合子核的后续分裂产生下一代的新MIC和MAC(). 在MAC发育过程中，生殖系基因组被扩增到～800 n的最终倍性。同时，大规模基因组重排发生[46]：i）以异质方式消除重复序列，包括转座子或小卫星，以及ii）删除至少45000个短的非编码干预序列，即IES（内部消除序列）[47](). IES切除在规定的时间窗口内每1-2 kb产生一个染色体DSB[48]因此，由于内复制发生在重排过程中，估计有106必须在每个正在开发的MAC中修复DSB[49]尽管数量巨大，但DSB修复保留了MAC染色体的线性组织。IES切除位点的高度精确修复通过C-NHEJ途径发生，连接酶IV和Xrcc4的绝对需求证明了这一点[50]，但需要有限的DSB处理(). 因为MIC中47%的基因被至少一个IES中断[47]端接的精确性对于新MAC中功能基因的恢复至关重要，因此对于细胞生存也至关重要。
连接兼容端的端部连接精度。
A类)这个
草履虫属
性周期。两种类型的性过程是通过饥饿诱导的草履虫：自交、自受精过程（如图所示）以及兼容交配类型之间的结合（未显示）。在自交过程中，两个生殖系二倍体MIC（红色）进行减数分裂，产生八个单倍体细胞核（粉红色），单个细胞核迁移到一个专门的细胞室，分裂一次，产生两个相同的配子核。剩下的七个减数分裂产物被降解，旧的MAC（黑色）变得支离破碎。在核配期间，两个配子核融合形成二倍体合子核。合子核随后经历两次连续的有丝分裂；第二次分裂后，两个细胞核成为有性子代的新MIC（红色），而另两个细胞核分化为新发育的MAC（红色和灰色），并进行程序性基因组重排。在第一次细胞分裂时，新的MIC以有丝分裂的方式分裂，两个正在发育的新MAC中的每一个都分离成一个子细胞，在那里它继续将重新排列的基因组扩增到~800 n的最终倍性。在结合过程中，MIC减数分裂是通过两个兼容的性伴侣的交配触发的，单倍体配子核相互交换。因此，每个伴侣中的合子核是通过一个常驻的单倍体核和一个迁移的单倍体核融合而形成的。交换结合子在合子核的第一次和第二次分裂之间分离，MAC的发育如自体受精细胞所述。B类)MIC和MAC染色体的一般结构。在MIC染色体上，基因（黑匣子）和非编码区（细线）被短的内部消除序列（红色IES）中断。重复的种系序列（例如转座子和小卫星）用黄色双头箭头表示。在MAC发育期间，每个MIC染色体被扩增至400倍，以产生异质MAC染色体群体。重复DNA的不精确消除与以下可选重排有关：i）染色体断裂和端粒添加到新的MAC染色体末端（灰色方块），ii）位于被消除生殖系区域侧面的两条染色体臂的不精确连接。C)IES切除机制。显示IES切除过程中形成的连续DNA中间产物，IES显示为红色，两侧MAC-目的DNA显示为黑色。反应的第一步是根据PiggyMac驯化转座酶，在每个IES端引入4个碱基交错双链断裂。导致染色体连接修复的分子步骤如左图所示，这可能发生在配对的中间产物中，通过对每个5′突起内的中央TA进行退火。证明了5′末端核苷酸的去除体内（虚线箭头），但所涉及的核酸酶尚未确定。对于3′-加工步骤，连接酶IV（Lig4）招募或激活填隙DNA聚合酶，该聚合酶在最后结扎之前向隐性3′-末端添加一个核苷酸。对于切除的线性IES分子（右）的循环，提出了类似的机制，前提是这些分子足够长。IES循环不复制，并且正在积极降级。D类)完全端接
与
非完全互补端。
1)我-
Sce公司
I直接定位的站点（箭头）。解理产生3′-悬垂（红色nt），它们是完全互补的。C-NHEJ促进精确结扎（左图），A-EJ删除四个突出的核苷酸，导致密封连接处至少4 bp的缺失（右图）[1],[2],[11].2)我-
Sce公司
I位置反向（箭头）。解理产生3′外伸（红色nt），这不是完全互补的。同样，A-EJ删除了3′-突起nt，导致重新密封接头（左侧面板）处至少4 bp的缺失。C-NHEJ根据三类事件（右侧面板）退火四个突出nt中的两个（红色nt）。这种不完美的退火会产生间隙（在I类中为蓝色）、失配（在I类和II类中为蓝色）或3′-单链尾（在III类中为蓝色）[1],[2],[11].
在哺乳动物细胞中，不同的研究分析了在无细胞提取物或转染细胞中被限制性内切酶切割的质粒的末端连接，所有这些研究都得出结论，NHEJ是准确的[6],[51]–[53]任何C-NHEJ部件中的缺陷都会导致容易出错的端接[6],[52],[53]证实了A-EJ中的诱变终接结果，至少部分是这样。然而，在这些研究中，DSB修复没有在染色体环境中进行监测。因此，基于含有巨核酶I裂解位点的染色体内底物的使用，不同的系统-Sce公司一、 已经过研究。值得注意的是，这些实验有助于在活细胞染色体的背景下，在精确的分子水平上对A-EJ进行表征[1],[2],[11],[21],[23],[54],[55]从这些研究中得出的结论（见下文）得到了证实体内在小鼠的生理过程中，如类别转换或V（D）J重组[5],[10].
因为我-Sce公司我的卵裂部位不是回文，使用两个顺式站点()信息丰富[2]; 随着这些地点的直接定向-Sce公司I介导的卵裂产生两个完全互补的末端，可以很容易地连接，而在反向方向上，只产生部分互补的末端(). 请注意，在这些情况下，DNA末端没有化学修饰，因此可以用于结扎机制；差异来自四个突出核苷酸的退火，这四个核苷酸是否完全互补。在后一种情况下，末端连接无法恢复初始序列，从而产生明显的诱变事件。值得注意的是，不完全互补端的连接效率与完全互补端相似，这是NHEJ适应能力的基础[2].
端部完全互补（I-Sce公司I站点直接定向），无错误事件恢复一个I-Sce公司I解理位点。因此，使用这些基板，无误差端接的频率被低估，因为残余I-Sce公司I蛋白可以重新离开修复的连接，增加容易出错的修复的可能性，并引入有利于不准确修复的偏见。根据I水平，野生型细胞中无错误事件的频率始终在35%到75%之间变化-Sce公司I表达式和表达式I的半衰期-Sce公司I蛋白质[1],[2],[11]然而，无错误事件的高频率（高达75%，这可能被低估了）表明C-NHEJ在哺乳动物细胞中不应该主要容易出错。Ku80或Xrcc4中的缺陷消除了无错误事件，表明C-NHEJ产生了准确的末端连接事件。剩余的末端连接事件（即A-EJ）对应于连接处的缺失，经常使用远离DSB位点的微同源性[1],[2],[11]在野生型细胞中，突变事件表现出类似的特征，表明它们是由a-EJ引起的，因此C-NHEJ不负责易出错的DSB修复。
对于非完全互补端，端接无法恢复可劈开的I-Sce公司I站点；因此，该基板监测单个解理/连接事件。有趣的是，90-95%的末端连接事件涉及由I产生的3′-突出核苷酸-Sce公司I乳沟()[2]引人注目的是，尽管两端的四个3′-突起核苷酸不是互补的，但观察到四个3〃突起核苷酸中有两个核苷酸的退火，这对应于最大可能的互补性。因此，C-NHEJ以最少的遗传修饰适应不完全互补的末端。一个系统的在体外对人类细胞提取物中大多数DNA末端可能性的分析始终得出类似的结果[6]重要的是，在Ku80或Xrcc4缺陷的哺乳动物细胞中，修复事件不涉及任何3′-突起核苷酸，所有生成的产物在修复连接处显示缺失，频繁使用远离DSB的微同源性。
这些数据可归纳如下：无论DNA末端的结构如何（完全互补或不互补），A-EJ至少去除所有3′-突起核苷酸（通常更多），而C-NHEJ保留至少一个3′-突出核苷酸，因此占使用3′-凸起末端的事件的90-95%。
重要的是，这些分析揭示了两种不同类型的微同源性（MH）：1）DSB本身的MH引导不完全互补端的退火过程；然后由C-NHEJ以保守方式进行端接；和2）远离A-EJ中涉及的断裂的MH，在修复连接处产生扩展缺失().
这些综合数据表明，C-NHEJ不容易出错就其本身而言但它用途广泛，能够适应非完全互补端，最大化潜在互补核苷酸的退火过程，从而限制遗传改变。因此，在修复连接处，C-NHEJ是保守的，末端连接的精度取决于DNA末端的结构。
在酿酒酵母对转染线性化质粒的末端连接事件的序列分析表明NHEJ非常准确。相反，扩展的删除在yku70型突变株[19],[56],[57]另一种末端连接途径（MMEJ）在Ku缺失时增加，也已在染色体背景下描述[7]此外，NHEJ可以产生相互易位，但在yKu80缺失的情况下，断点连接与缺失相关[58]在裂变酵母中也发现了另一种末端连接途径[59].
内切酶的连续表达，如HO或I-Sce公司一、 在一条基本染色体上持续导致多个分裂/修复周期，导致仅0.1%的存活率。这个结果表明NHEJ至少99.9%没有错误，因为它恢复了一个可恢复的站点[60]–[62].NHEJ也适用于酿酒酵母事实上，HO产生的绝大多数末端都是由涉及四个3′-突起核苷酸的事件修复的，不完美悬垂的结扎以Ku依赖的方式起作用[62],[63]最后，提出了一种酵母DNA 3′-磷酸酶Tdp1，通过防止DNA末端的修饰来提高NHEJ机器的准确性[64].
C-NHEJ和A-EJ也在细菌中被描述[65].英寸耻垢分枝杆菌，绝大多数Ku-independent连接具有微同源性介导的缺失，表明在DSB修复过程中A-EJ取代C-NHEJ[66]经典细菌模型中没有.Ku和连接酶D大肠杆菌，A-EJ是该物种中最活跃的末端连接途径[67]最后，在植物中也提出了保守的C-NHEJ和诱变的A-EJ途径的证据[12],[68]–[70].
大量II类转座子通过剪切粘贴机制进行转座，在剪切粘贴机制中，转座子从其供体部位被切除，并整合到另一个位点，在新整合的元件两侧产生靶位点重复（TSD）。转座子切除在供体部位留下一个DSB，每个断裂端有一个初始TSD的拷贝；通过末端连接的DSB修复通常产生一个特征足迹，其中两个TSD与转座子相隔几个bp（综述于[71]). 剪切粘贴转座子的切除，如睡美人
[72],[73],摩斯1
[74]，或P（P）要素[75]已在不同宿主中用于在特定基因组位点诱导DSB。这些研究表明，在没有Ku的情况下，侧翼序列的大量缺失可以在转座子切除位点恢复。这一结果证实了Ku-dependent C-NHEJ在哺乳动物中是一种保守但多功能的修复途径，秀丽线虫在一定程度上，果蝇属然而，在后者中，染色体分析表明，最活跃的终接通路独立于连接酶IV[35].
末端连接需要DNA末端处理：多才多艺的重要性
有效的免疫应答绝对需要免疫球蛋白基因位点的遗传多样性。第一级多样性是通过与普遍存在的C-NHEJ机制相关的淋巴特异性Rag1和Rag2蛋白诱导的（V）、（D）和（J）片段的重排产生的[76]–[79]V（D）J复合产生编码和互易信号接头()两个步骤增加了编码节点的多样性。首先，Rag1/Rag2介导的切割在断裂的编码端（而不是信号端）产生发夹，发夹解析在末端产生不同序列的组合。其次，通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）添加N（非模板化）核苷酸，增加编码关节的连接多样性[80]–[82]注意，多样性不是通过C-NHEJ本身产生的，而是通过辅助机制产生的（即通过发夹分辨率和TdT）。产生多样性的额外过程的要求支持了C-NHEJ不是，就其本身而言，在编码关节处具有足够的诱变性。此外，直接结扎钝端导致的信号关节修复在很大程度上是无误的[76],[77]这一结果表明，当DNA末端直接适合结扎时，C-NHEJ是无错误的。
结扎前处理DNA末端。
A类)通过V（D）J重组实现连接多样性。
1)Rag1-Rag2蛋白加入V（D）J重组位点（突触步骤）。由Rag1-Rag2解理产生圆形信号接头和线性编码接头（包含编码序列）；然而，卵裂在四肢产生发夹，无法直接结扎。发夹的开口（阿耳特弥斯）产生了不同DNA末端（细线）的组合，从而创造了第一级连接多样性。2)TdT随后在3′端或钝端添加N-核苷酸，创造了第二层次的连接多样性。B类)IR之后。
1)IR在DNA末端产生多重损伤（彩色框）。这些改变的DNA末端与连接酶IV的酶连接不相容。切除受损结构（虚线）导致连接后核苷酸缺失。2)Ku在DNA末端的作用。
一)DSB的碱性位点（红圈）抑制NHEJ。Ku移除了这些位点，允许处理后的DNA末端进入NHEJ。这种反应导致有限的缺失（在重新封装的接合处有一到三个nt）。b条)远离DSB的基本场地（红色圆圈）不会影响NHEJ。BER可以修复重新密封分子上的碱性位点。请注意，Ku在这些底物上的活性降低可防止长时间的缺失（从碱基位点到末端），这将导致重新密封的连接处的大量缺失，并避免在重新密封的分子中产生新的断裂（改编自[97]).
严格限制在完全互补端的端部连接过程将无法连接编码接头。相反，一个多功能但保守的过程，如C-NHEJ，能够连接这些DNA末端并产生高度多样的免疫储备，同时防止侧基因组不稳定。值得注意的是，DNA末端在类开关重组期间不是互补的，因此，C-NHEJ的多功能性对完成这一过程至关重要。
IR产生具有化学改变末端的DSB，其具有不适合酶结扎的复杂损伤。这种情况与不完全互补端的情况不同，因为连接酶在这些类型的化学修饰端上是不活跃的。因此，在结扎前必须处理IR诱导的DSB(). 因此，IR诱导的DSB重新密封接头处的突变是由这一初步“清洁”步骤而非C-NHEJ本身引起的。值得注意的是，Ku具有专门针对DSB的5′-dRP/AP裂解酶活性，可以限制末端核苷酸的丢失()从而保持基因组的稳定性[83].
IR-induced DSB的“清洗”产生非互补端。因此，非通用修复过程将无法修复IR诱导的DSB，并且该生物体对IR高度敏感，即使在低剂量下也是如此。因此，C-NHEJ的适应性对IR抗性至关重要。这种适应性对内源性DSB和低外源性剂量（如环境或医学（放射检查）暴露）的反应具有重要影响。
