一小时酵母蛋白质组^*

摘要

测量蛋白质表达差异的能力已成为理解生物现象的关键(1,2). 由于成本、速度和可获得性，转录组分析经常被用作蛋白质组的替代物(三,4). 也就是说，mRNA是一种遗传中介体，不能为无数翻译后调控过程提供信息(5–7). 在过去十年中，人们在成熟的蛋白质组技术上投入了大量精力，以与转录组技术相当的速度和成本提供信息。

历史上，酵母具有6600个开放阅读框，一直是首选的蛋白质组技术试验台(8). 2003年，Weissmann及其同事使用GFP或TAP标签测量了每个酵母基因的近似表达水平(9). 这项开创性的工作确定了约4500个蛋白质在对数期酵母生长期间表达。随后的基于质谱的研究证实了这一早期估计(9–12). 根据这一知识，我们将综合蛋白质组分析定义为检测约90%的表达蛋白质组（酵母≥4000个蛋白质）的实验。注意，其他人为此使用了“几乎完成”一词；我们假设综合具有相同的含义(即包括许多、大多数或所有事物）(13).

利用多种分离和质谱技术，对酵母进行了基于质谱的蛋白质组学初步分析，每种分析可鉴定多达数百种蛋白质(14–16). Yates及其同事于2001年报告了第一次大规模酵母蛋白质组研究，在～68小时的质谱分析后鉴定出1483个蛋白质，即每分钟鉴定0.4个蛋白质(17). 他们的方法-二维色谱结合串联质谱-为过去十年的大规模蛋白质分析提供了模板(18–20). 通过将离线第一维度的分离与更广泛的分馏（80对15） 吉吉等。2003年扩大了这项工作(21). 也就是说，鉴定出的蛋白质（1504）的适度增加需要135小时的分析，将每分钟的蛋白质计数降至0.2。2006年，曼恩及其同事利用一种能够准确测量质量的快速混合质谱仪，在48小时内（0.7蛋白质/分钟）检测出2003种酵母蛋白质(22).

从这三项开创性的研究中，我们开始看到质谱仪采集速度对蛋白质组分析深度和速度的影响。然而，这项技术在酵母蛋白质组中的最新应用，曼恩的工作使用了一种混合线性离子阱离子回旋共振傅里叶变换仪器（LTQ-FT），该仪器可以传递MS²以～650 ms的速度扫描(23). 早期的研究，即Yates和Gygi依赖于相当慢的扫描速度（1–3s/扫描）三维离子阱技术。2008年，利用新型Orbitrap混合质谱仪，Mann及其同事首次对酵母蛋白质组进行了全面分析，鉴定了近4000种蛋白质(10). 广泛分馏(24)每一组分的三份分析使研究在～144个分析小时（0.5个蛋白质/分钟）时花费了大量时间。2010年，我们的团队使用分馏和多种蛋白酶实现了类似的综合分析，但提高了序列覆盖率(24). 然而，这项工作需要更长的分析时间（0.2蛋白质/min）。

这是三年前最先进的技术。毫无疑问，我们蛋白质组学界已经实现了一个重要的目标——全面覆盖酵母蛋白质组。尽管如此，获得这个深度并不是例行的，因为它需要数天的MS分析和大量的专家劳动。2012年，利用新的、更快的扫描速度、四极油轨道技术（Q-OT、Q-Exactive），Mann和同事提出了分馏概念，提高了样品制备质量，并强调了更高质量的在线分离(25). 通过他们的流线型方法，他们在四个小时的MS分析后检测到了略多于3900种酵母蛋白。更令人印象深刻的是，该策略转化为每分钟识别16.3个蛋白质，比下一个最佳综合研究提高了33倍。这一成功是一项了不起的成就，说明全面的蛋白质组技术确实可以以一种高效的方式执行。

当然，飞行时间混合系统可以提供非常高的MS²采集速率，在某些报告中高达100 Hz。2011年，Muddiman及其同事报告了使用四极杆-TOF系统进行酵母蛋白质组分析(即三重TOF）以低得多的速率（20 Hz）MS运行²扫描速率(26). 即使在这种降低的速度下，只有16%的光谱被映射到独特的序列，并鉴定出1112种独特的蛋白质。由于MS降低²光谱质量(即低信噪比（S/N），在高MS下实现的独特肽识别更少²收购率。其他使用TOF技术的研究报告了类似的结果(27,28). 对于最大的蛋白质组深度，我们得出结论，扫描速度的提高决不能以光谱质量的降低为代价。最近，介绍了一种新型Orbitrap混合质谱仪，该质谱仪具有一个质量过滤器、一个碰撞池、一个高场Orbitrat分析仪，以及一个双池线性离子阱分析仪（Q-OT-qIT，OrbitrapFusion）(29,30). 该系统提供高MS²20赫兹的采集速度是曼恩及其同事使用的Q-OT系统的两倍。我们假设，这个新鲜的系统具有快速的扫描速度，可以在记录时间内提供全面的蛋白质组分析。为了最大限度地提高性能，我们开发了一种优化的细胞裂解方法，采用胰蛋白酶消化，并使用二甲基亚砜（DMSO，5%）作为LC添加剂，以增加酸性肽的丰度并统一电荷状态(31,32). 使用该新系统，我们报告了在1.3小时的nLC-MS后对酵母蛋白质组（4002和1%FDR）的综合分析²分析（70分钟梯度）。这些实验每分钟提供了非凡的67种蛋白质，并证明酵母蛋白质组的完整分析可以在大约一小时内完成。

实验程序

结果

在过去的十年里，蛋白质组分析的深度和速度都取得了相当大的进步(参见上文). 这些改进的结果源于常规使用高质量精度和分辨率，也源于MS的稳定增加²收购率。在2001年开创性的Yates出版物和Mann的单次蛋白质组工作的十年间等。2012年，MS²采样率从～0.75 Hz上升到近10 Hz(17,25). 这里我们报道了一种新一代质谱仪，它包括质量分辨率四极杆、轨道探测器、碰撞电池和线性离子阱（Q-OT-qIT、Fusion、，图1) (29,30). 在该系统中，MS采集速率不仅因为存在快速扫描的双电池线性离子阱，还因为控制环境具有多个独立的处理单元。新系统配备了一个复杂的控制系统，该系统将离子注入、前体分离、碎片化和质量分析过程并行化，以实现约2倍的采集率提升。我们推断，此Q-OT-qIT配置及其20 Hz MS²获取率可以为快速、完整的蛋白质组分析提供相当大的收益。

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图1。

Q-OT-qIT混合质谱仪（Fusion）示意图。该系统不同于前几代四极离子阱/轨道阱混合器，它引入了分辨率四极质量过滤器，并重新排列了几何结构，将线性离子阱放置在碰撞电池的后部。重新配置的几何结构解除了前体离子隔离和解离这两种功能的线性离子陷阱。其结果是改进了操作并加快了操作。

Q-OT-qIT系统

为了验证这一假设，我们首先使用一种复杂的酵母胰蛋白酶肽混合物进行参数评估，该混合物以70分钟的梯度洗脱到系统中。我们检查了包括碰撞激活模式在内的几种设置(即HCD或陷阱CAD），MS¹分辨率、碰撞能量、最大注入时间和动态排除设置。补充信息中包含了强调这些结果的详细绘图。简单地说，我们发现MS²使用HCD进行分析，然后进行离子阱质量分析（低分辨率HCD；80626 MS²与离子阱CAD和离子阱质量分析（CAD；75973 MS²具有31820个唯一PSM的事件）。这并不奇怪，因为HCD倾向于提供更多的随机主干碎片，并且使用Q-OT-qIT几何结构可以稍微更快地完成。使用MS操作系统¹分辨率设置为60000(@米/z（z）200）使检测到的独特肽增加20%，分辨率超过15000(补充图S1). 我们得出的结论是，提高的分辨率提高了前兆信噪比，从而改进了低丰度前兆的选择，并可能分离出其他未解决的前兆，从而使多个MS²可以获取事件。当然，在这种情况下，这种紧密间隔的前驱体将被共同隔离（0.7米/z（z）隔离宽度）；然而，选定的前体米/z在MS中添加注释²扫描会有所不同，有助于从嵌合MS中识别²扫描。MS增加¹60000以上的分辨率并没有为增加身份提供任何明显的好处。35毫秒是最佳的最大注射时间(补充图S2). 将最大注射时间减少到30毫秒，或将其增加到45毫秒，会导致肽识别减少10%。我们发现在30、45和60秒的动态排除设置中，肽识别只有轻微变化(补充图S3). 四极隔离宽度从0.5到1.5米/z（z）经检验，最佳结果为0.7米/z（z）(补充图S4). 微软¹和MS²自动增益控制（AGC）目标值分别为500000和7000，产生了最大数量的肽识别(补充图S5和S6).

溶解、色谱和添加剂

酵母细胞裂解是实现全面蛋白质组检测的关键步骤，必须谨慎执行。洗涤剂，如SDS或打珠是酵母菌裂解的典型方法(37–39). 曼氏酵母研究中使用的SDS方法产生了极好的结果，但需要在MS取样之前去除洗涤剂。珠击法将玻璃珠和酵母细胞混合在缓冲浆液中，在30赫兹下振荡三次，1–4分钟。然而，这种方法可能过于温和，无法充分溶解酵母，而且在我们手中，无法有效提取所有蛋白质。我们的目的是避免使用洗涤剂，并研究了更有力的打珠程序。通过简单地将循环次数增加到8次（每次4分钟），我们取得了显著改善的结果(补充图S7). 最后，我们注意到，当裂解物没有清除不溶性物质时，鉴定增加。Zubarev及其同事最近报告了哺乳动物细胞培养样本的类似发现(40).

以前的单次激发酵母蛋白质组分析使用长毛细管液相色谱柱（50厘米）和长梯度（240分钟）(25,40,41)我们的目标是使用更短的梯度（70分钟）实现类似或更好的覆盖。我们发现，30 cm的毛细管液相色谱柱填充1.7μm BEH颗粒（Waters Corporation），以350–375 nL/min的流速运行，在一小时的梯度上提供了一致的洗脱。为了适应这种流速，在整个分离过程中，将自制的柱加热器保持在60°C的温度。样品直接装入色谱柱以避免损失。

库斯特最近的工作等。描述了向流动相溶剂中添加～5%二甲基亚砜提高了前体S/N，使蛋白质鉴定增加了20%(31,32). 我们通过比较添加或不添加二甲基亚砜在70分钟梯度上获得的酵母肽和蛋白质鉴定数量，测试了在色谱溶剂中添加二甲基亚砜的情况。在我们手中，二甲基亚砜的存在增加了平均前体信号，从～2.8×10⁷至4.8×10⁷（任意单位）并将总离子电流增加170%(补充图S8). 这个放大的信号使独特的肽鉴定增加了9%，蛋白质增加了5%。我们得出的结论是，二甲基亚砜确实可以提高性能，没有明显的缺点，并将其用于所有后续实验。

全酵母蛋白质组分析

为了验证我们的假设，即快速扫描Q-OT-qIT杂交可以在～1小时内提供全面的酵母蛋白质组分析，我们连续分析了五份胰蛋白酶消化的酵母细胞裂解物。每次复制开始时，加载～1.4μg样品，然后在70 min梯度上进行分析。考虑到样品加载、柱清洗和平衡，五次连续分析需要～8小时；然而，每次实验的实际仪器采集时间为~1.3h。正如预期的那样，Q-OT-qIT混合软件发布了大量扫描：平均13447 MS¹和80460毫秒²每次运行的事件数。作为参考，Gygi于2003年进行了最先进的分析等。，记录162000 MS²MS操作135小时后的事件。Q-OT-qIT混合型在两个半小时内完成了这么多扫描！接下来，我们在最新引进的四极线性离子阱Orbitrap系统上分析了酵母样品(即qIT-OT或Orbitrap Elite），使用相同的色谱条件(42). 那台质谱仪只产生了大约四分之一的质谱¹扫描，与Q-OT-qIT（3635）相比，MS的一半²事件（39447）。

图2呈现一系列MS²Q-OT-qIT MS在1s内采集的扫描。在本例中，为MS选择了22个前体²MS分析¹扫描#59211。在1s内分别获得了所有22个产物离子光谱，并显示在图2在这22个扫描中，有19个被映射到序列（1%FDR）。在数据库搜索方面，每一个小时的实验（Q-OT-qIT系统）产生43400个($\stackrel{<trans\; data-src="̄">̄</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="x">x个</trans>}}$)肽谱匹配（PSM）和34255($\stackrel{<trans\; data-src="̄">̄</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="x">x个</trans>}}$)具有独特氨基酸序列的肽（1%FDR，表一). 对五个实验进行分批分析，得到47624个独特的肽。在每次分析中，80460 MS的一半以上²扫描符合序列（54%）。尽管Q-OT-qIT扫描速度很快（～20 Hz），但我们得出结论，该系统通常能提供高质量的光谱。

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图2。

Q-OT-qIT扫描周期概述。在57.88分钟扫描#59211时，MS¹获得并呈现了MS的几个光谱特征²分析。三角形表示为后续MS选择的22个前体²对所有这些样本进行采样，这些样本都是在扫描#59211的1秒内采集的。22个MS中的19个²随后将光谱映射到序列。

表一

使用Q-OT-qIT质谱仪进行五次一小时酵母蛋白质组实验的鉴定结果总结。注：SGD来源于酿酒酵母基因组数据库(网址：www.yeastgenome.org)

实验	PSM公司	肽类	蛋白质	SGD已验证	SGD无特征	新加坡元可疑
1	43, 423	34,535	4002	3630	337	8
2	43,622	34,495	3966	3608	331	7
三	42,339	33, 450	3959	3595	334	三
4	43,326	34,347	3968	3602	337	8
5	43,343	34,449	3991	3623	341	4
总计	216,256	47,624	4395	3976	381	16

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平均而言，每个五倍分析都检测到3977个蛋白质（1%FDR），13.5%（538个，$\stackrel{<trans\; data-src="̄">̄</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="x">x个</trans>}}$)其中来源于单肽(图3A类). 综合这些数据，单肽蛋白质减少到460个，同时将覆盖范围扩大到4395个蛋白质组。其中3643个蛋白（83%）出现在所有五个1-h实验中，3853个蛋白（88%）出现于五个实验中的四个(图3B类). 单个实验和组合实验的中位数序列覆盖率分别为18.4%和23.7%(图3C类)每种蛋白质的肽序列中位数为7个。酵母含有约800个可疑ORF。这些ORF被认为不编码相应的蛋白质，通常用于验证蛋白质组数据集的FDR。在一个小时的实验中，每个数据集识别出三到八个可疑ORF(表一)，证实这些数据确实远低于1%FDR阈值。

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图3。

使用Q-OT-qIT杂交对酵母胰蛋白酶消化物进行五次一小时分析的性能指标。平均而言，每个实验中鉴定出3977个酵母蛋白（1%FDR），只有13.5%（538个，$\stackrel{<trans\; data-src="̄">̄</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="x">x个</trans>}}$)来源于单肽鉴定(A类). 在所有实验中检测到4395个蛋白质，其中3643个在所有5个1小时实验中出现(B类).C类，给出了单个和组合实验的中值序列覆盖率。天，显示我们识别的蛋白质中的重叠对已知的表达水平信息来源于已发表的标签实验。

为了直接对比Q-OT-qIT杂交与最新的综合酵母分析的性能，我们使用240分钟梯度分析了相同的样品。这个较长的方法模仿了曼恩及其同事2012年的研究(参见下文). 在扩展梯度条件下，Q-OT-qIT系统识别出46381个独特的肽序列，对应4392个蛋白质组（1%FDR），提供24.1%的中位数序列覆盖率（平均序列覆盖率=28.0%）。

为了估计一小时实验的动态范围，我们将基于质谱的鉴定与串联亲和性（TAP）或绿色荧光蛋白（GFP）标记实验绘制的鉴定进行了比较。从我们一小时的实验数据中，我们确定了89%的蛋白质具有丰富的数据，包括73%的蛋白质存在于125拷贝/细胞以下(图3天) (9). 我们还注意到886种蛋白质的检测缺乏丰富的数据。接下来，我们将全球分析的动态范围以最近的多反应监测（MRM）研究为基准。好了，Aebersold等。利用合成肽和三重四极杆MRM技术，靶向152个酵母蛋白，跨越整个浓度范围，包括公共蛋白质组数据集中从未观察到的几种蛋白质(43). 一个一小时的Q-OT-qIT实验、所有五个一小时实验的批处理分析以及我们的四小时分析分别获得了152个Aebersold目标中的122、133和132个。Aebersell的工作检测到了137个这样的蛋白质靶标，可能是经过几十次MRM实验。我们的结论是，我们使用Q-OT-qIT杂交的一小时方法提供了与最新MRM研究相当的动态范围和灵敏度，但具有整个蛋白质组深度。我们还注意到，该系统及其四极质量过滤器为并行反应监测提供了相当大的前景(44,45).

讨论

上述数据提供了对酵母蛋白质组的深入了解。同样重要的是，这一深度是在前所未有的时间尺度内实现的。为了了解这些增益是如何实现的，我们绘制了每秒已识别肽序列的数量作为洗脱时间的函数(图4A类)用于Q-OT-qIT（红色）和上一代qIT-OT（黑色）杂交。值得注意的是，该图显示Q-OT-qIT杂交（Orbitrap Fusion）每秒常规识别约8个肽，在单个1s窗口中检测到多达19个肽序列。这些惊人的指标大约是qIT-OT（Orbitrap Elite）的两倍。此外，Q-OT-qIT的速度允许更深的MS²MS取样¹Q-OT-qIT采样的平均前兆深度为349^第个最丰富的米/z（z）MS中的峰值¹扫描，而qIT-OT系统的平均深度仅为202(图4B类). Q-OT-qIT频繁采样米/z（z）强度等级为800或更低的峰值。

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图4。

使用Q-OT-qIT（Fusion）与qIT-OT（Orbitrap Elite）和Q-OT杂种进行酵母蛋白质组分析的分析指标。Q-OT-qIT（面板A、，红色）实现了每秒多达19个肽的鉴定，相比之下，qIT OT系统实现了每秒多达10个肽的鉴定(A类，黑色）。由于MS速度更快，峰值深度也更高²Q-OT-qIT系统的扫描速度(B类).C类，绘制了三种仪器的独特酵母肽识别速度。在一小时的分析中，Q-OT-qIT发布的独特肽鉴定数量几乎是qIT-OT的两倍。除了独特的蛋白质外，类似的数据显示在天.

为了进一步研究Q-OT-qIT扫描速度的影响，我们绘制了独特肽序列识别的累积数量与保留时间的函数关系(图4C类，消除I/L歧义）。Q-OT-qIT（固体红）在70分钟梯度和洗涤期内以比qIT-OT（固体黑）-8.3快得多的速度积累独特的肽识别，几乎呈线性对每秒4.3个唯一序列（线性拟合在10到80分钟之间）。在同一系统上使用四小时梯度略微降低了斜率（每秒3.7个唯一序列，10到200分钟之间的线性拟合，红色点），但允许进行相当深入的分析，并再次超过了qIT OT系统（每秒2.3个唯一序列，黑色点）。作为参考，我们绘制了2012年曼恩等。使用Q-OT杂交（Q-Exactive，点蓝色）进行研究。与Q-OT-qIT（Orbitrap Fusion）相比，该系统在相同的分析时间内发布最浅的斜率（每秒1.7个唯一序列）和大约一半的唯一肽序列。请注意，Mann在这项工作中使用了Lys-C摘要图4比较相同数据集的独特蛋白质识别率。同样，Q-OT-qIT系统是表现最好的，即使将一小时的分析（红色实线）与其他系统（黑色和蓝色虚线）上的四小时实验进行比较。

在这里，我们描述了新的质谱仪技术，该技术能够在前所未有的时间范围内实现酵母蛋白质组的全面覆盖。毫无疑问，在过去十年中，样品制备、色谱和MS硬件的许多改进都有助于实现这一目标。其中，我们认为质谱扫描速度的提高是蛋白质组分析速度和深度加快的主要原因。图5说明了几项大规模酵母蛋白质组分析的蛋白质鉴定速度，作为质谱仪MS的功能²扫描速率。注意蛋白质鉴定率的快速上升与MS的增加相关²扫描速率。

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图5。

在过去十年中，选定的大规模酵母蛋白质组分析的蛋白质鉴定率与质谱扫描率的函数关系。每个数据点都标有年份、对应作者、所用MS系统类型和参考号。

中描述的相关性图5我们感到有些惊讶，因为我们预计，随着组成整个蛋白质组的复杂肽混合物在较短梯度上分离，低丰度肽的电离抑制将变得越来越重要-即从四个小时到一个小时(46,47). 换句话说，随着在线色谱的分离时间缩短，必须增加共洗脱。随着共同洗脱的增加，人们可能会预计，无论MS的速度或灵敏度如何，电离抑制都会阻止相当一部分肽变成气相离子，这是MS检测的必要条件。此处显示的结果驳斥了这一假设，并证实MS灵敏度和速度的进一步提高将继续缩短整个蛋白质组分析时间，对于相对简单的蛋白质组，如酵母，最有可能不到一小时。

最后，我们得出结论，在几个小时内对哺乳动物蛋白质组进行全面分析现在已经在我们的技术范围内。考虑到最近的估计表明，在任何给定的时间，在培养的人类细胞中都会表达10000到12000个蛋白质(48–50). 这大约是酵母蛋白质组复杂性的三到四倍。因此，我们目前的努力旨在在短短几个小时的分析内实现对哺乳动物系统的全面覆盖。展望未来，MS再翻一番²收购率，即从20到40赫兹，有潜力在一到两小时内检测整个人类蛋白质组。而且，考虑到MS创新的历史和速度，这种能力可能只有几年的时间了。

补充材料

致谢

脚注

参考文献