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自然遗传学。作者手稿；PMC 2014年4月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
自然遗传学。2013年10月；45(10): 1160–1167.
2013年8月25日在线发布。 数字对象标识：10.1038/ng.2745
预防性维修识别码：项目经理3874936
NIHMSID公司：NIHMS512446号
PMID：23974870

定义囊性纤维化跨膜电导调节基因变异的疾病易感性

帕特里克·R·索斯奈,1,2,三 卡伦·西克洛西,三 弗雷德里克·范·古尔,4 凯尔·卡涅基,三，5 于海辉,4 尼拉杰·沙尔玛,三 阿纳贝拉·拉马略,6,7 玛格丽达·D·阿马拉,6,7 鲁斯兰·多夫曼,8,9 朱利安·齐连斯基,8 大卫·L·马西卡,10 雷切尔·卡钦,10 琳达·米伦,11 菲利普·J·托马斯,11 乔治·P·帕特里诺斯,12 玛丽·科里,13,14 米歇尔·刘易斯,15 Johanna M Rommens先生,8,16 卡洛·卡斯特拉尼,17 克里斯托弗·M·彭兰,18和Garry R切割三，19
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补充资料

摘要

致病基因的等位基因异质性给基因组变异转化为临床实践带来了巨大挑战。囊性纤维化跨膜电导调节因子的近2000个变体中很少有(CFTR公司)该基因有经验证据表明，它们会导致囊性纤维化。为了解决这一差距，我们收集了北美和欧洲注册和诊所中39696名囊性纤维化患者的基因型和表型数据。在这些患者中，159人CFTR公司变异的等位基因频率≥0.01%。对这些变异进行了临床严重程度和功能后果评估，其中127（80%）符合与疾病一致的临床和功能标准。对2188名囊性纤维化患者父亲的疾病外显率进行评估后，剩余32个变异中的12个被指定为中性，而其他20个变异仍不确定。这项研究表明，直接从表型良好的受试者获取数据可以解决我们解释临床相关基因组变异能力的差距。

孟德尔病和多基因疾病的基因检测的实用性受到大量不确定意义的DNA变体（VUS）的限制1-4.临床实验室中的下一代测序将显著增加潜在医学相关性变体的数量5因此，我们识别DNA变异的能力和解释其结果的能力之间可能会出现越来越大的差距6解决这一差距的一种方法是将临床和研究实验室确定的变异汇总到中央存储库中7,8在具有相同表型的个体中观察到相同的变异支持该变异可能有害。然而，医生出于多种原因要求进行临床检测，包括确认或排除特定诊断。在没有可靠表型和功能注释的测试设施中聚集变体可能会降低存储库的潜在临床价值9,10.

等位基因异质性挑战的一个主要例子是囊性纤维化基因，即囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR；NM_000492.3）。据报道，在CFTR公司编码和侧翼序列，但仅确定了几十种疾病的易感性11因此CFTR公司用于诊断目的的基因经常会发现VUS。不完全注释的临床意义CFTR公司序列变异远远超出了全球约70000名囊性纤维化患者，尤其是自CFTR公司基因检测通常是新生儿筛查的一部分12-15此外，基于人群的囊性纤维化携带者筛查越来越普遍，美国每年约有120万人接受检测。16,17如果发现一对夫妇中的一人携带已知的囊性纤维炎变异立方英尺通常对揭示VUS的其他成员进行分析18最后，大量未经临床验证的疾病相关变异阻碍了对CFTR结构变化如何导致功能障碍和产生囊性纤维化表型的理解。我们对疾病与中性等位基因的理解存在差距，这是基因组测序时代的一大挑战。

中央存储库CFTR公司变异称为囊性纤维化突变数据库（CFMD；http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/app)开始于1990年CFTR公司已识别。CFMD内容来源于研究实验室的发现以及遗传检测设施的额外贡献。在提供大量变化的同时CFTR公司CFMD几乎没有表型注释，功能结果主要来自基于核苷酸变化性质的预测。评估患者的疾病责任CFTR公司带有预测算法的变体已被证明效用有限19,20开发更精确的算法的一个关键弱点是缺少具有明确定义的功能后果的变体21.

由于CFMD构成了一个优秀的现有核苷酸变异库CFTR公司，采用了一种新的方法来全面解决CFTR公司变体。的临床和功能性T翻译CFTR公司（CFTR2）项目收集临床数据并随附CFTR公司来自24个国家的国家注册中心和大型临床中心登记的囊性纤维化患者的变异。通过将重点放在由专家临床医生确定的囊性纤维化诊断个体中存在的变异，该项目使用了“表型驱动”方法来收集数据，而不是基于实验室的“基因型驱动”方法。其次，微属性识别用于识别来源，并将构成CFTR2数据库的临床和遗传数据的贡献者记入贷方22,23为了确定评估的优先顺序，CFTR2项目从以下子集开始CFTR公司在收集的囊性纤维化患者中，变异的等位基因频率超过0.01%。使用患者的临床特征和每个变体的功能评估来定义致病变体。使用基于人群的方法评估不符合临床或功能阈值的变异体的疾病外显率。这里提出的表型驱动方法可用于告知广泛遗传疾病的疾病易感性分配。

结果

159CFTR公司变异代表96%的囊性纤维化等位基因

CFTR2中39696名囊性纤维化患者的数据(图1)从国家囊性纤维化患者登记处或囊性纤维化专科诊所收集(补充表1)在估计的70000名囊性纤维化患者中占57%24绝大多数（31727名有种族数据的患者中的95%）被列为白种人。壹仟肆佰肆拾肆元整CFTR公司在这些患者中发现了变异。最常见的变异，p.Phe508del，占这些患者已识别等位基因的70%。美国医学遗传学学会（American College of Medical Genetics）此前曾将另外22个变异定义为囊性纤维化，并报告称在囊性纤维化患者中发生频率为0.1%或更高，占等位基因的17.5%11另有136个变异发生频率超过0.01%，在CFTR2数据库中报告了至少9个等位基因(补充表2). 总之，这159个变体占CFTR2中确定的囊性纤维化等位基因的96.4%。我们的工作重点是评估这159个变体的疾病易感性，以最大限度地提高囊性纤维化基因检测的临床敏感性。

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为CFTR2项目收集的数据

在CFTR2中9个或更多等位基因中发现的159个变异，等位基因频率≥0.01%，优先进行进一步分析*分析时提交注册处提供的临床信息不完整。一10170名患者未报告氯化物汗液数据。236例患者的汗液氯化物值超出生理范围（>150 mmol/L或<5 mmol/L.），被排除在外。b条10197名患者的肺功能数据未见报道。5633名患者年龄在6岁以下，如果有测量结果，则排除在外。46例患者的肺功能测量值超出生理范围（预测值<3%或>150%），被排除在外。c胰腺状态的特征是充足（PS）或不足（PI）。未报告5083名患者的数据。

表型分析

CFTR2数据库中的所有患者均被临床诊断为囊性纤维化；然而，囊性纤维化是一种高度可变的疾病25为了评估囊性纤维化的严重程度，我们使用了一种诊断囊性纤维化不可或缺的生化指标来确定CFTR公司基于表型证据，变异导致囊性纤维化。汗液氯化物浓度的测定提供了CFTR功能的测量体内这是以标准化的方式广泛执行的，与非囊性纤维化人群的数值有明确的差异26-29。如果至少3名携带变体的患者的平均汗液氯化物浓度≥60 mmol/L，则根据临床标准将变体视为致病28,30.使用平均值可以调节因非CFTR因素导致的汗液氯化物浓度的个体差异(补充图1). 当只有两名患者的数据可用时，两种汗液氯离子浓度都必须超过90 mmol/L。为了将汗液氯浓度归因于研究中的变异，我们分析了携带另一种变异的患者CFTR公司已知导致CFTR功能完全或接近完全丧失的基因（方法）。在研究的159个变体中，140个符合临床标准(图2)其中138名患者的汗液氯化物浓度来自三名或三名以上患者，而两名患者的两种变体的测量值均超过90 mmol/L(补充表2). 14个不符合临床标准的变异体中有13个与临床“中间”范围为40-58 mmol/L的平均汗液氯化物浓度相关；其余变体的平均测量值为39mmol/L。囊性纤维化的个体变体数据和其他主要表型如补充表2.

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用于分配的流程CFTR公司基于生化检测的囊性纤维炎变异

对具有给定变异的患者的平均汗液氯化物浓度进行评估在trans中具有已知的囊性纤维瘤样变型（在ACMG小组最初确定的23种囊性纤维炎样变型中，16种常见的胰腺不足型）65五种变异体对感兴趣变异体患者的汗液氯化物值不足在trans中囊性纤维炎变异。

功能分析

内含子9多绒毛膜区长度的两个常见变异（普通人群中的频率>5%）(约1210-12T[5]和约1210-12T[7]；已被广泛研究的遗产名称（分别为5T和7T）在此未重新分析(补充说明). 其余157个变体中，预计有80个会将提前终止密码子（PTC）引入CFTR公司mRNA（无义变异体[n=35]，剪接供体/受体位点的典型核苷酸变异体[‘GT-AG’，n=15]，或导致移码的插入/缺失变异体（n=30]）；图3). PTC变异体的一个常见后果是无义介导的mRNA衰变（NMD），导致RNA严重减少，不产生蛋白质31,32然而，在极少数情况下，由于框内外显子的跳跃，影响剪接的变体可以产生稳定的框内转录物；翻译的蛋白质几乎总是无功能的（例如。c.1393-1G>A[传统名称1525-1G->A]）33因此，这80CFTR公司预计变异对临床有害4和囊性纤维炎(补充图2). 10个变体出现在剪接位点内或附近，但没有改变典型剪接供体/受体位点(图3). 其中五种变体之前已经过评估，并显示在相关组织中表达异常的交替分裂转录物，导致全长水平严重降低CFTR公司mRNA（野生型水平的0-8%）34-39(补充表3a). 使用微基因分析（方法和补充表3b). 异常拼接（<10%野生型[WT]CFTR公司在五个变体中的四个中观察到成熟CFTR蛋白减少（<10%WT-CFTR(补充表3c). 虽然还没有确定的基本功能水平，但WTCFTR功能的不到10%已被普遍接受为外分泌胰腺、汗腺和肺中存在囊性纤维化特征的保守阈值38,40,41总共，影响剪接的十个变体中有九个具有与疾病一致的有害后果的证据(图3).

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用于分配的流程CFTR公司基于功能分析的囊性纤维炎变异

变量按预测效果排序。那些预期破坏RNA数量或质量的变异包括导致提前终止密码子（PTC）的变异，因此没有蛋白质（引入终止密码子、影响剪接供体或受体位点的变异、引入移码的插入或删除变化）和变体预测会导致mRNA剪接效率改变，从而减少全长CFTR蛋白的产生。对预测产生全长CFTR蛋白但带有氨基酸替换、插入或缺失（不引入移码的错义和插入或缺失变化）的变体进行评估，以确定蛋白质水平（定义为存在成熟蛋白的百分比）或功能（定义为氯电流的百分比）。如果变异导致的WT-CFTR mRNA转录水平、WT-CFTR-蛋白或WT-CFTR-氯电流低于10%，则被视为致病。一内含子9中的两个常见变体对囊性纤维化表型有复杂的影响，并已被广泛研究，但被排除在进一步分析之外（见正文）。b条已知会导致额外后果的变量包括：c.1393-1G>A（遗留名称1525-1G->A），跳过框架内外显子；p.Glu831X，除了合成截短蛋白外，还导致选择性剪接mRNA；和p.Glu1418ArgfsX14，其中最后外显子的缺失预计不会导致无义介导的衰变（NMD）。每个变量都与60mmol/L以上的平均汗液氯化物浓度有关(补充图2).c文献中先前报道的五种变体具有异常剪接；minigene分析发现四个变体有异常剪接。d日变体p.[Gln359Lys；Thr360Lys]、p.Leu558Ser和p.Arg1070Gln。

67个变体预测了氨基酸替换（错义，n=65）或单个氨基酸缺失（帧内缺失，n=2）。由于这些变体可以合成稳定的RNA和全长蛋白，因此对每种变体进行了分离的实验研究，以确定对CFTR生物发生和功能的影响。在HeLa和Fischer大鼠甲状腺（FRT）细胞中表达带有错义或框架内变化的CFTR，以通过Western blotting评估糖基化状态，这是一种成熟的监测CFTR成熟的方法(补充说明)42,4367个变体中的63个（61个错义和2个帧内缺失）在这两种细胞系中测试其对CFTR处理的影响。两种细胞系的结果基本一致（r2=0.94，p<0.001；补充图3). 变异体分为三组：加工中断最小的组（两个细胞系中成熟形式的CFTR蛋白>80%；n=32），加工中断中等的组（至少一个细胞系成熟10%至80%；n=21），以及对加工有显著负面影响的组（在两个细胞株中成熟度≤10%；n=10）。在中间组中，11个变体在一个细胞系中造成了严重的处理缺陷，但在另一个细胞株中没有；剩下的10个变体在两种细胞系中都引起了中间缺陷。

为了评估错义变体对功能的影响，对表达CFTR的FRT细胞进行氯电流测量，每个FRT细胞分别携带63个变体（61个错义和2个框内缺失）。4个错义变体的氯电导未测定。囊性纤维化患者原代气道细胞的功能分析CFTR公司由已确定的致病变异体组成的基因型与10%CFTR功能与囊性纤维化相关的阈值一致(补充图4). 43个变体（41个错义和两个框内缺失）以低于WT-CFTR 10%的水平传导氯离子，被认为是致病的(图3). 包含其余20个错义变化的CFTR产生的氯电导在WT-CFTR的10.5%到147%之间。因此，这20种变体对CFTR功能的影响被归类为与囊性纤维化不一致，尽管它们可能导致其他表型。CFTR处理和氯电流的比较表明，HeLa或FRT细胞中的严重处理缺陷（C/（B+C）<0.1）与CFTR氯通道功能的相关性一直小于10%(补充说明). 在四个没有测到氯离子传导的变体中，一个（p.His199Tyr）在HeLa细胞中表现出严重的加工缺陷（<0.01），被归类为功能缺陷(图3). 其余三种变体（p.[Gln359Lys；Thr360Lys]、p.Leu558Ser和p.Arg1070Gln）表现出大于WT 10%的处理能力，未进行功能分类。

外显率分析

在研究的159个变体中，127个符合临床和功能标准，并被归类为囊性纤维瘤变异(图4和补充表2). 为了帮助对不符合临床或功能标准的变异体进行分类，对从北美和欧洲招募的2188名囊性纤维化患者的父亲进行了外显率研究(补充表4). 正常功能的存在CFTR公司囊性纤维化患者的父亲需要该基因，因为CFTR功能降低与先天性双侧输精管缺如（CBAVD）导致的男性不育相关44CBAVD导致的男性不育影响97-98%的囊性纤维化男性45,46自然孕育的囊性纤维化后代的父亲会将一个致病等位基因传递给其受影响的孩子。由于这些父亲是可生育的，所以非传递的等位基因不应包含有害变体。因此，任何CFTR公司发生在可育父亲的非传递等位基因上的变异被认为是囊性纤维化和CBAVD的非传递基因。为了排除样品处理过程中可能发生的错误，或者如果在我们不知情的情况下使用辅助生殖技术，则必须在未传输的样品上观察到一个变体CFTR公司至少有两个父亲的等位基因。

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使用三个标准将疾病责任分配给159种最常见的CFTR变体

127个变异体被认为囊性纤维炎符合临床和功能标准，并且没有证据表明存在非遗传性。在19个符合临床或功能标准但不是两者都符合的变体中，有14个没有非外显性的证据，被归类为不确定；在囊性纤维化后代的父亲中，在非传递CFTR等位基因上发现了5个变异，被归类为非囊性纤维化引起。剩下的13个变异体既不符合临床标准也不符合功能标准，其中7个被观察为非穿透性，被归类为非囊性纤维化引起。其余6个变异体没有非遗传证据，但证据不足，无法归类为非囊性纤维炎，因此被归类为不确定变异体。C类符合临床标准但不符合功能标准的变体。F类符合功能标准但不符合临床标准的变体。†已知为复杂等位基因的一部分或发现的变体顺式使用另一种变体。

159人的基因分型CFTR公司变异体产生了2062个适合外显率分析的样本，其中185个已鉴定出两个或多个变异体(补充图6和7). 经过进一步筛选，发现100名父亲携带159个变体中的至少一个在trans中先前接受的囊性纤维炎变异(补充图6). 在这100位父亲中，有10种被认为是非穿透性的变异体，因为每种变异体都发生在非穿透性“健康”的父亲身上CFTR公司至少两个父亲的基因(表1). 为了评估标记这些非穿透性变体的有效性，我们将父亲中每个变体的频率与1000基因组项目中可用的频率数据进行了比较47我们的第一个前提是，在健康的囊性纤维化携带者父亲中，非传递性等位基因的非穿透性和表型无关的变异应以与普通人群中观察到的相同频率发生。这是所有非穿透性变体的情况(表1). 第二个前提是，囊性纤维化患者发生非渗透性变体的频率应比普通人群低得多。事实上，在CFTR2登记的囊性纤维化患者中，每种非渗透性变体的频率至少比普通人群中的频率低10倍。除了这十种变体之外，约1210-12[7]（遗留名称7T）已被报告为非渗透性48在众多父亲中被确定为第二个变体，第十二个变体，p.Ile1027Thr，被认为是非穿透性的，因为它是唯一观察到的顺式更改了p.Phe508del。CFTR2数据库中存在非穿透性变体可能是由于基因分型不完整和/或缺乏等位基因分类分析。外显率研究中发现了多个复杂等位基因的例子，因此分类分析至关重要(补充说明)49.

表1

与不完全外显率相关的变异

变体#
等位基因
在里面
美国对外贸易总协定2		频率
在CFTR2中
（共个
70,777
已知
等位基因）		#发生的
在父亲中
带有CF-
造成
变体		#发生的
在trans中具有
一个CF-
造成
中的变量
父亲		频率in
父亲（出局）
第页，共4296页
总等位基因）		阿勒
频率输入
1000
基因组		笔记
符合临床标准但不符合功能标准的变体
p.精氨酸31Cys130.0002440.000930.001-
0.004
p.Ile148Thr（第148页）990.0014540.002090.013
（阿普拉
数据）		在CF中始终可见
患者
第1023页_第1024页*
p.Met470Val公司410.00061185不是
已分析		0.351960.087-
0.647
p.值754Met90.0001640.001630-0.003
不符合临床或功能标准的变体
p.Arg75Gln公司280.000457480.017230.009-
0.033
p.Gly576Ala公司420.000617120.004660.004-
0.009		在1000个基因组和
在父亲身上
顺式带有p.Arg668Cys
p.精氨酸668Cys490.000724160.006750.004-
0.009		在1000个基因组中，
始终可见顺式具有
p.Gly576Ala；看到
无p.Gly576Ala
父亲
p.Leu997Phe基因280.0004750.002090.001-
0.003
p.Arg1162亮氨酸90.0001三20.001400.001
p.Ser1235网址540.000818150.004890.005-
0.016
*变异体p.Ile148Thr出现在多个单倍型上，但只在出现时引起囊性纤维化顺式带有p.Ile1023_Val1024del66.

在父亲筛查中，一个未经研究的和47个变异体没有非继承性的证据（所有127个都符合临床和功能标准；8个变异者仅符合临床标准，6个仅符合功能标准，6个中无一个标准；图4). 在既不符合临床标准也不符合功能标准的变体中，包括那些以前与可变外显率相关的变体（例如p.Asp1152His），已报告为复杂等位基因的一部分的变体，其中每个变体的疾病易感性无法单独确定（例如p.Arg74Trp和p.Asp1270Asn对），以及临床或功能分析不完整的变体。

讨论

基因检测CFTR公司广泛用于症状个体的诊断29，用于一般人群中的携带者状态17越来越多地作为新生儿筛查的一部分50,51以及最近用于选择使用特异性变异分子疗法的治疗52CFTR2项目的主要目标是增加CFTR公司已被评估为致病倾向的基因。在项目启动时，23个变体被定义为致病11将表型证据与功能分析相结合，能够明确地将致病性分配给另外104个变体。对所有127个变体的检测估计占我们样本中囊性纤维化等位基因的95.4%，我们样本中只有0.21%的患者没有至少一种病理学改变立方英尺已识别变体。接受携带者筛查的夫妇也会受益，因为在筛查127个变异体时，检测有1/4风险的夫妇患囊性纤维化的敏感性应该从72%提高到约91%。应当指出，这些估计的检出率取决于不同分布和频率的区域和种族差异。该项目说明了将等位基因多样性转化为临床应用的可行性，也说明了在解释罕见DNA变化的疾病含义方面的挑战。

CFTR2项目收集了注册中心和诊所登记的患者的基因型和表型数据。虽然这种方法丰富了受影响个体的受试者库，但还使用了其他客观指标来区分导致寿命缩短的囊性纤维化的变异体和导致不太严重疾病的变种44值得注意的是，159个变体中有19个（12%）未达到我们的临床阈值，尽管熟悉该疾病的医学专业人员报告了囊性纤维化患者。这一发现揭示了即使在注释完善的临床数据收集中也存在表型异质性的程度。根据临床标准，140个变异体中有13个（9.3%）不符合功能标准。我们的研究强调了表型的重要性和对患者中发现的变异进行临床注释的功能分析表明，即使在多个无关受累个体中报告存在罕见变异，也不能保证其有害或致病。

疾病的表型和功能标准可以基于许多遗传病已有的指标。在本研究中，选择汗液氯化物浓度来定义表型，因为它依赖于CFTR功能，与疾病严重程度相关，经常以标准化的方式进行，并且在正常和疾病之间有很好的切分29,30类似地，变体的功能影响评估可遵循既定指南4例如，假设预测引入PTC的变体有害是普遍接受的做法4如前所述，携带预测PTC变异的患者的临床特征与疾病一致(补充图2). 错义变体的效果评估是最大的障碍；然而，相对简单的分析，如Western blotting可以揭示加工缺陷，这是氨基酸替换的常见结果。如本文所述，突变蛋白在多个细胞系中的表达可将细胞类型特异性影响降至最低。也许最具挑战性的问题是建立表型和功能测量的阈值。在本研究中，所采用的阈值由囊性纤维化研究的临床和功能领域的专家审查。蛋白质表达和氯离子电导的10%阈值（与WT-CFTR相比）不是疾病和健康之间的绝对界限，而是一个保守的阈值，与之前将CFTR功能与疾病相关的研究一致38,40,41如果公认共识代表了目前对发病机制的理解，那么如果未来的研究有必要，可以修改阈值，因为一些变体可能会以我们的方法无法捕捉到的方式影响CFTR。

符合临床和功能标准的127个变体被指定为囊性纤维炎；然而，剩下的32个变异（20%）需要进一步分析，以确定它们在疾病方面是否是中性的，或者与轻度表型或部分外显率相关。证明正常对照组样本中出现变异的频率与在患者中观察到的频率相同，是一种长期接受的确定中立性的方法53,54在隐性条件下，该测试只能在已知携带有害等位基因的“对照”个体中进行在trans中囊性纤维化患者的父亲是评估中立性的理想群体，因为他们具有功能性CFTR公司基因，因为它们的生育能力和一种致病的变异体被传递给了受影响的后代。证明正在研究的变异物发生在“健康”（非传递）CFTR公司可育父亲的基因为囊性纤维化的中性或非遗传性提供了令人信服的证据。这种方法的功效取决于人群中等位基因的频率和测试的“对照”数量。在对可育父亲的非传递性（非囊性纤维化）染色体进行测试时，由于其完全渗透性，因此未发现特定变体的信心随着等位基因频率的下降而下降。因此，我们更确信，与p.[Gln359Lys；Thr360Lys]、p.Phe1052Val和p.Gly1069Arg等位基因频率低于0.0002的变体相比，p.Gly551Asp等更常见的变体具有完全渗透性。在1000基因组项目中，观察到非渗透性囊性纤维化变异的发生频率与高加索受试者的报告频率相似，因此对变异分配有了额外的信心。外显率分析在临床应用中会变得更加有用，因为健康人群中罕见变异的频率变得更加稳健和完整（例如100000个基因组），并且能够更完整地描述我们无法获得的种族/地理队列。

由临床、功能和外显率标准确定的明显疾病责任不一致的情况值得特别关注。对于13个符合临床但不符合功能标准的变异体，一个常见的发现是存在其他变异体顺式消融或修改CFTR功能，从而解释囊性纤维化患者中存在这些变异。认识到复杂的等位基因可能导致表型和基因型之间的不一致，这在临床领域至关重要，因为错误识别可能导致不适当的医疗行动。这些发现强调，携带罕见或新等位基因的基因编码区的完整测序应用于识别所有潜在有害等位基因。最后，外显率分析有助于区分可能导致疾病的变异体和中性变异体。非囊性纤维炎组包括已知的多态性变体，如p.Met470Val55,56由于不完整的基因分型而进入患者登记CFTR公司携带非囊性纤维瘤样变异体（如p.Met470Val）并伴有囊性纤维症症状的患者可能受益于基因重组。相反，根据基因发现诊断为囊性纤维化的患者，如果其中一个或多个变异体目前被认为不会导致囊性纤维化，则应重新评估。

虽然这项研究确定了囊性纤维化患者中发现的大多数等位基因的疾病易感性，但仍有20个变异尚不确定。ACMG已经发布了除本研究中使用的变体之外的未知变体分类建议4,57; 然而，在广泛的临床、功能和外显率分析后，概率估计可能并不适用于所有被认为不确定的变异。作为本项目的一个目的CFTR公司变异分为定义明确的类别，对不确定变异的进一步分类将需要额外的分析来量化引起或不引起疾病的概率。例如，一个或多个不确定的变异体可能以与本研究中使用的功能评估不同的方式导致CFTR功能障碍，正如两个同样影响RNA剪接的错义变化所显示的那样（p.Gly576Ala58和p.Ile1234Val；出版物审查工作）。

不确定的变量以及1600多个CFTR公司未分类的变体仍然是一个诊断难题。预测疾病易感性的计算方法已应用于剪接位点59和错义变化19-21分类CFTR公司变体。这些方法缺乏明确的临床分类所需的特异性。预测剪接的算法对于高度保守的序列很有用，但对于保守度较低的核苷酸或一致剪接位点以外的核苷酸的变化，需要进行实验研究，如补充说明59,60考虑到全长CFTR蛋白（1480个残基）的结构庞大且多样，对算法训练的更多变体进行注释将大大提高分类器的预测性能。为此，机器学习方法可以优先考虑未来的实验测试。

在临床环境中，测序的使用越来越多，强调了罕见变异带来的医学挑战。虽然确定导致孟德尔病的所有变异体的疾病易感性似乎是一项艰巨的任务，但CFTR2项目证明了使用表型驱动方法完成这项任务的可行性。许多遗传疾病的患者登记册已经建立61-63这将有助于对患者基因型和相关表型数据进行详细分析。微属性可以识别数据源和组成，同时确认贡献者和数据完整性64对于隐性疾病，人类群体中每个基因的等位基因数量是有限且稳定的（极为罕见的除外从头开始变体）。因此，将疾病责任仔细分配给导致这些疾病的变异株，对当代和未来几代患者及其家庭成员来说将是有价值的。

方法（在线）

患者

从25个国家囊性纤维化登记处和未登记国家的主要临床中心收集匿名基因型和横断面临床信息补充表1). 从临床记录中记录基因型。对于13个数据集（7.5%的患者），仅为携带至少一种未纳入美国医学遗传学学院囊性纤维化筛查小组的变体的患者提供了临床信息11诊断时测得的汗液氯化物浓度，如果不止一次，则取平均值，以mmol/L（mEq/L）为单位记录。236名患者（1%的测量值）的结果下降，因为他们不在5-150 mmol/L的生理范围内29。胰腺状态是从提交注册表中记录的，不同于注册表的定义。原始FEV1使用Wang方程（对于18岁以下的个体）或Hankinson方程（18岁及以上）将单位为升的数据转换为使用患者年龄、性别、种族（如果已知）和身高预测的%67,68否则，FEV1%按规定使用预测值。使用了最近记录年份内的最新测量值。临床特征归因于CFTR公司变异来自携带变异的患者在trans中囊性纤维炎患者的变异先前显示有最小的残余功能65并对具有该特定基因型（感兴趣的变异/已知的囊性纤维瘤样变异）的患者进行平均。所有数据收集均由约翰·霍普金斯大学机构审查委员会和美国囊性纤维化基金会注册咨询委员会批准。

预期影响RNA剪接的变体分析

CFTR公司预测会改变先前未研究过的剪接效率的变体(补充表2)如前所述，使用微基因构建物进行检测，以确认其有害性质，并进行了一些修改69简而言之，采用了五步走战略；（i） 使用KOD热启动DNA聚合酶（Novagen）扩增感兴趣内含子区域的5′受体和3′供体剪接位点序列以及基因组DNA的侧翼外显子。可根据要求提供引物序列。（ii）使用外显子引物对第一步产生的扩增子进行融合PCR，仅产生带有5′受体和3′供体剪接位点序列的融合扩增子，其两侧各有外显子。（iii）使用融合PCR扩增子作为引物对pcDNA5/FRT/CFTR进行粘足突变，以产生pcDNA5/RRT/CFTR-小基因70（iv）定点突变（QuikChange II XL，安捷伦科技）c.579+3A>G（传统名称711+3A>G），c.579+5G>A（传统名称711+5G>A），c.1585-8G>A（传统名称1717-8G>A），c.2657+2_2657+3英寸A（旧名称2789+2insA），以及约2988G＞A（传统名称3120G>A）变体(补充表3c)在各自的微基因中。其他拼接位点变体c.579+1G>温度（传统名称711+1G>T）和c.2988+1G>A（遗留名称3120+1G>A）被创建为分析中的阳性对照。可根据要求提供引物序列。（v） 最后，重新克隆全长CFTR公司WT和突变小基因构建到pcDNA5FRT载体中，以忽略在突变步骤中引入核苷酸错误的机会71在ABI 3100遗传分析仪（应用生物系统）上对WT和突变小基因进行了序列确认。将WT和突变小基因质粒转染到人类胚胎肾（HEK）293（ATCC）和囊性纤维化支气管上皮（CFBE 41o-）细胞（加州大学旧金山分校D.Gruenert教授慷慨捐赠）。所有使用的细胞系均在马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学细胞核心中心和生物资源库进行支原体污染测试。转染后48小时制备总RNA和全细胞裂解物。使用i-Script cDNA合成试剂盒（BioRad，USA）或SuperScript RT III逆转录酶和随机六聚体（Invitrogen，UK）合成第一链cDNA。使用来自感兴趣区域的外显子引物直接将得到的cDNA产物用于PCR扩增。可根据要求提供引物序列。用琼脂糖凝胶（1.5%）电泳分析RT-PCR产物，并在凝胶提取后对转录物进行测序。所有样本中的RNA质量通过编码TATA盒结合蛋白（TBP）的转录物的扩增进行验证。包括不含逆转录酶和RNA的对照组。如前所述，根据测序数据计算每个CFTR突变小基因相对于相应WT小基因的正确拼接产物量72Western blot检测复合糖基化（C带）CFTR的含量。使用小鼠单克隆抗体570（R结构域或590（NBD2；美国囊性纤维化基金会治疗学资助的UNC抗体分发计划）和/或MM13-4（N末端；美国Chemicon）检测CFTR。以GAPDH或微管蛋白作为负荷对照。使用Image J软件（NIH）量化印迹，以确定每个实验样品相对于WT小基因的处理CFTR（C带）量。

分析可能改变蛋白质加工和/或功能的变体

将导致氨基酸替换或帧内缺失的变体分别引入CFTR公司如前所述，使用定点突变的cDNA73.工作小组-CFTR公司所含克隆取自一名非囊性纤维化患者，并含有已知的中性变异体p.Val1475Met。如前所述，在HeLa细胞（Clontech）中实现了CFTR的瞬时表达43CFTR在Fischer大鼠甲状腺细胞（FRT；爱荷华州爱荷华大学Michael Welsh赠送的礼物）中的稳定表达是通过整合每个突变的立方英尺如前所述，使用Invitrogen Flp-In系统™将cDNA作为单个拷贝复制到相同的基因组位置73,74.选择并确认CFTR公司带有所需变体的cDNA，异源人类的水平CFTR公司测定每个细胞系的RNA。mRNA水平>0.5或<3倍于表达WT的四个独立FRT细胞系平均水平的细胞系-CFTR公司进行了测试。使用C带CFTR与B带+C带CFTR的比率量化CFTR成熟度和蛋白质表达水平（如前所述归一化为WT-CFTR）43通过短路电流（I供应链)在使用室中。我供应链每个细胞系重复测量3~14次，取平均值。所有读数均为I平均值的百分比供应链野生型表达CFTR的FRT细胞系75对四个分离的FRT细胞系进行测量，以确定野生型CFTR的平均电流和方差。从非囊性纤维化和囊性纤维化受试者中分离出人支气管上皮（HBE）细胞，并如前所述测量短路电流76.

MassArray测定

筛选159种药物的分析CFTR公司使用开放平台矩阵辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-ToF）质谱仪，发现≥0.01%的患者出现变异77使用从美国（n=99）、法国（n=18）、加拿大（n=22）、捷克共和国（n=2）和塞尔维亚（n=1）的可用研究库存中获得的基因组DNA（gDNA）对照验证了该分析。当gDNA不可用时（n=11），使用QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit（安捷伦科技公司）创建质粒DNA。由于延伸引物（p.Gly330X）存在问题，无法获得阳性对照（p.Glu1418ArgfsX14），因此无法确认两个变体。该分析通过Sanger测序进行验证。在验证研究中，确定了35/35个变体，并确认了29/29条WT染色体。

多重分析设计最初使用assay Designer软件4.0版（Sequenom Inc.，San Diego，CA）来构建扩增和延伸引物，然后根据阳性对照的结果进行优化。在384孔板中，分别以25 ng/ul、50 ng/ul或5 ng/ul.的浓度对基因组DNA、全基因组扩增（WGA）DNA或质粒DNA中高达300nt的区域进行多重PCR扩增。该反应包含来自iPLEX Gold SNP基因分型试剂盒（Sequenom）的试剂。由于扩增子长度的变化和形成引物二聚体的可能性，使用了不同的引物浓度。使用NIST引物工具评估引物复合物中可能存在的二聚体和发夹

(http://yellow.nist.gov:8444/dnaAnalysis/primerToolsPage.do)并随后进行调整。可根据要求提供底漆序列和浓度。使用iPLEX金试剂盒（Sequenom）中的试剂中和未结合的dNTP。

使用iPLEX金试剂盒（Sequenom）中的试剂从每个纯化的PCR反应中生成单碱基延伸（SBE）产物。制备得到的SBE PCR产物用于质谱分析，并将其分配给SpectroCHIP（Sequenom）。使用MALDI ToF光谱仪（Sequenom）对数据进行分析。在MassARRAY光谱仪（Sequenom）上使用3.0版SpectroACQUIRE软件生成数据，然后使用4.0.22版Typer软件（Sequeno）进行分析。该检测用于检测囊性纤维化后代父亲的DNA，以确定怀疑是囊性纤维化引起的变异。父亲为遗传研究提供了知情同意书，并匿名进行分析。每个父亲都应该只携带有害物质CFTR公司变异遗传给了他的后代。在父亲身上检测到的其他变异代表一个复杂的等位基因，其中有两个CFTR公司变体出现在同一染色体上，或CFTR公司变体在trans中带有传播的变异体，这种变异体没有足够的有害物质使父亲不育。患有囊性纤维瘤变异和第二种变异的父亲在可行的情况下（n=145）对其后代进行基因分型，以确定其发育阶段。

统计分析

使用中冷Stata版本11（StataCorp，USA），使用METAREG插件进行统计分析78采用荟萃分析方法比较PTC与非PTC变异患者的临床特征，并对每个细胞系的聚合数据进行回归分析。我们合并了每个变异体在受试者之间观察到的方差，并考虑到变异体之间的方差异质性，以比较各组。在随机效应模型下比较各组平均值（氯电流），该模型考虑了不同组内和不同组之间测量值的统计方差。所有报告的回归系数均未标准化。

补充材料

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三

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致谢

作者感谢参与国家/临床登记的患者。这项工作得到了NIDDK（5R37DK044003至G.R.C.）、NIH（DK49835至P.J.T.）、囊性纤维化基金会治疗公司（至P.J.T）、美国囊性纤维化协会（CUTTING08A、09A、10A至G.R.C；SOSNAY10Q至P.R.S.）的资助，来自FCTPortugal（PIC/IC/83103/2007和PEstOE/BIA/UI4046/2011至M.A和BioFIG）。Elizabeth Johnson、M.Brad Drummond、Dave Cutler和Dan Arking提供了统计分析方面的帮助。作者得到了CFTR2临床专家组的大量指导：克里斯蒂安·德·博克、彼得·杜丽、斯图亚特·埃尔本、菲利普·法雷尔、迈克尔·诺尔斯和伊莎贝尔·塞尔梅特；来自CFTR2功能研究专家小组：Robert Bridges、Gergely Lukacs和David Sheppard；还有莫莉·谢里丹的评论。

脚注

URL 1000基因组浏览器，网址：http://www.1000genomes.org/; ClinVar公司，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/; 囊性纤维化突变数据库，http://www.genet.sickkids.on.ca/app; 欧洲，网址：http://www.eurordis.org/; NIH全球罕见疾病患者注册和数据存储库，http://www.grdr.info网站/; 莱顿开放变体数据库，http://www.lovd.nl/3.0/home网站; 国家罕见疾病组织，http://www.rarediseases.org/.

父亲DNA样本的贡献者：Teresa Casals（西班牙Bellvitge生物医学研究所）、Garry Cutting（美国约翰霍普金斯大学）、Cristina Dechecchi（意大利维罗纳大学医院）、Ruslan Dorfman（加拿大儿童医院）、Claude Ferec（法国中央医院大学）、Enmanuelle Girodon（法国GH Henri Mondor）、Milan Macek，Jr.（布拉格查尔斯大学）、Dragica Radojkovic（塞尔维亚分子遗传学和基因工程研究所）、Martin Schwarz（英国圣玛丽医院）、Manuela Seia（意大利IRCCS基金会CáGranda Ospedale Maggiore Policlinico）、Manfred Stuhrmann（德国汉诺威医学院）、，Maria Tzetis（希腊雅典国立卡波迪斯特里亚大学）和Julian Zielenski（加拿大病童医院，根据研究协议2004-OGI-3-05，由Genome Canada通过安大略省基因组研究所提供部分支持）

CFTR2患者数据的贡献者：塞莱斯特·巴雷托（葡萄牙圣玛利亚医院）、戴安娜·比尔顿（英国皇家布罗普顿和哈菲尔德医院）、约瑟夫·博格（马耳他大学）、卡拉·科伦坡（意大利米兰大学）、斯塔夫罗斯·杜杜纳基斯（希腊阿吉亚·索菲亚儿童医院）、赫尔穆特·埃勒蒙特（奥地利因斯布鲁克医科大学）、，Godfrey Fletcher（爱尔兰囊性纤维化登记处）、Ivanka Galeva（保加利亚亚历山大罗夫斯卡大学医院）、Silvia Gartner（西班牙Quistica Vall de Hebron Unidad de Fibrosis）、Vincent A.M.Gulmans（荷兰囊性纤维化基金会）、Elpis Hatziagorou（希腊亚里士多德大学），Lena Hjelte（瑞典卡罗林斯卡研究所）、Tiina Kahre（爱沙尼亚塔尔图大学）、Nataliya Kashirskaya（俄罗斯医学科学院）、Anna Katelari（希腊阿吉亚·索菲亚儿童医院）、Paul Laissue（哥伦比亚罗萨里奥大学）、Lydie Lemonnier（法国Vaincre La Mucoviscidose协会）、，Anders Lindblad（瑞典Sahlgrenska大学医院）、Vincenzina Lucidi（意大利Ospedale Bambino Gesö）、Milan Macek，Jr.（捷克共和国布拉格查尔斯大学）、Halyna Makukh（乌克兰医学院）、Bruce Marshall（美国囊性纤维化基金会）、Ian McIntosh（加拿大囊性纤维化）、，Meir Mei-Zahav（以色列特拉维夫大学）、Predrag Minic（塞尔维亚妇幼保健研究所）、Hanne Vebert Olesen（丹麦奥胡斯大学医院）、Nika Petrova（俄罗斯医学科学院）、Tania Pressler（丹麦哥本哈根大学）、Danijela Radivojevic（塞尔维亚妇儿保健研究所，Sophie Ravilly（法国Vaincr La Mucoviscidose协会）、Nicolas Regamey（瑞士伯尔尼大学医院）、Gabriela Repetto（智利德萨罗罗大学）、Maria Teresa Sanseverino（巴西阿雷格里港诊所医院）、Christian Scerri（马耳他大学）、Anne Stephenson（加拿大囊性纤维化）、，Martin Stern（德国图宾根大学）、Vija Svabe（拉脱维亚里加斯特拉丁斯大学）、Muriel Thomas（比利时囊性纤维化登记处）、John Tsanakas（希腊亚里士多德大学）、Vera Vavrova（捷克共和国莫托尔查尔斯大学和大学医院）、，和Paul Wenzlaff（德国卫生保健质量和管理中心）

数据访问所有数据均可通过CFTR2网站访问。单个变体rsID（由单核苷酸多态性数据库[dbSNP]创建）列于补充表2变量已提交给ClinVar和Leiden开放变量数据库（LOVD），可在NCBI下搜索CFTR公司基因ID 1080。的RefSeq登录号CFTR公司为NM_000492；CFTR的UniProt注册号为P13569。

作者贡献P.R.S.联合监督研究，收集和整理临床数据，进行统计分析，分析数据，并撰写手稿。K.R.S.整理临床数据，分析数据，并撰写手稿。F.V.G.和H.Y.构思、设计并执行了氯离子传导实验，并对数据进行了分析。K.K.构思、设计、执行外显率分析并分析数据。N.S.、A.S.R.和M.D.A构思、设计并进行了拼接分析，并对数据进行了分析。R.D.和J.Z.整理了CFMD的变量数据。D.L.M.和R.K.进行了算法分析。L.M.和P.T.构思、设计并执行了CFTR处理实验，并对数据进行了分析。G.P.P.建议并协助微属性过程的设计和实施。M.C.联合监督研究并分析数据。M.H.L.联合监督研究并分析数据。J.M.R.为CFMD管理数据，联合监督研究并分析数据。C.C.协调临床数据的收集，共同监督研究，并分析数据。C.M.P.联合监督研究并分析数据。G.R.C.监督研究，构思和设计实验，分析数据，并撰写手稿。

竞争性金融利益F.VG.受雇于Vertex Pharmaceuticals。H.Y.受雇于Vertex Pharmaceuticals，并持有该公司的股票。P.J.T.对Reata Pharmaceuticals的研究有经济利益，并由其赞助。G.R.C.是囊性纤维化基金会、Vertex Pharmaceuticals、Illumina、aTyr Pharma和Canon Biosciences的顾问。

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