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癌症发现。作者手稿；PMC 2014年11月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
癌症发现。2013年11月；3（11）：10.1158/2159-8290.CD-13-0397。
2013年8月21日在线发布。 数字对象标识：10.1158/2159-8290.CD-13-0397
预防性维修识别码：项目经理3823822
NIHMSID公司：尼姆斯519230
PMID：23965987

自噬维持线粒体谷氨酰胺代谢和BRAF生长V600E型–驱动性肺部肿瘤

安妮·斯特罗赫克（Anne M.Strohecker）,1,2 杰西·燕翔（Jessie Yanxiang Guo）,1,2 Gizem Karsli-Uzunbas公司,1,2 桑迪·M·普莱斯,1,2 光华Jim Chen,1,2 罗宾·马修,1,2 马丁·麦克马洪,三和艾琳·怀特1,2,4
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摘要

线粒体缺陷的自噬消除可抑制氧化应激并保留线粒体功能。这里，重要的自噬基因附件7在BRAF小鼠模型中被删除V600E型-在存在或不存在肿瘤抑制因子TRP53的情况下诱发肺癌。附件7缺失最初诱导氧化应激并加速肿瘤细胞增殖，这与编号2消融。的复合删除附件7和编号2无加性效应，表明这两个基因通过调节氧化应激调节肿瘤发生，揭示了自噬介导的肿瘤抑制的潜在机制。在肿瘤发生的后期，附件7缺乏导致缺陷线粒体堆积、增殖缺陷、肿瘤负担减轻、腺瘤和腺癌转化为嗜酸细胞瘤，并延长小鼠寿命。自噬缺陷肿瘤衍生细胞系的呼吸能力、饥饿生存能力和谷氨酰胺依赖性受损，表明蛋白质降解产生的自噬底物维持BRAFV600E型-肿瘤生长和代谢。

关键词：自噬，BRAF，肺癌，线粒体，代谢，NRF2

介绍

自噬是一个由代谢应激激活的分解代谢过程，细胞蛋白质和细胞器被吞噬并靶向溶酶体进行降解。这一过程通过回收细胞内成分用于大分子合成来维持新陈代谢，并防止可能有毒的受损蛋白质和细胞器的积累。自噬在癌症中的作用是复杂的，目前尚不清楚(1). 基本自噬基因等位基因缺失的小鼠贝克林1肿瘤易发性和马赛克或肝脏特异性缺失附件5或附件7产生良性肝癌，提示自噬在肿瘤抑制中的作用(2–4). 然而，自噬定位于实体肿瘤的代谢应激、缺氧区域，使肿瘤细胞存活(5–7). 事实上，KRASG12D系列-驱动性肿瘤上调了维持功能线粒体、饥饿时存活和肿瘤生长所需的自噬(8,9). 在缺乏自噬的情况下，有缺陷的线粒体积累，导致线粒体呼吸减少，最终与增殖不相容。这损害了应激耐受性，促使我们将这些肿瘤标记为“自噬成瘾”(8–10). 最近在KRAS基因工程小鼠模型中证实了自噬成瘾G12D系列–驱动型非小细胞肺癌（NSCLC），自噬缺失将腺瘤和腺癌转化为嗜酸细胞瘤，这是一种与缺陷线粒体积聚相关的良性肿瘤类型(11–14). 因此，新出现的情况是，自噬在癌症中的作用与环境有关。在某些情况下，自噬可能通过保存蛋白质和细胞器质量控制（防止氧化应激和组织损伤）来限制肿瘤的发生，而在其他情况下，自噬促进新陈代谢、适应应激和肿瘤生长。在调节自噬成为癌症的有效治疗策略之前，需要全面了解该途径在不同组织类型中的作用，以及由特定致癌事件驱动的肿瘤中自噬依赖性的空间和时间变化(15–17).

自KRAS以来G12D系列驱动肿瘤对自噬抑制非常敏感，我们将注意力转向其下游效应器BRAFBRAF公司在许多人类肿瘤中发现，包括黑色素瘤（65%）、肺（3%）、甲状腺乳头状瘤（40%）、卵巢癌（4%）和结直肠癌（18%）(18–20)最常见的变化是缬氨酸在残基600处被谷氨酸取代（BRAFV600E型)导致激酶的组成性激活和RAS独立性。检测自噬在BRAF中的作用V600E型–诱发肺癌，患有Cre活化BRAF的小鼠V600E型有无必要的自噬基因的条件等位基因附件7通过鼻内注射腺病毒Cre重组酶诱导肺肿瘤的发生，并随时间随访产生的肿瘤。此外，肿瘤抑制因子的条件等位基因Trp53基因被培育成布拉夫和附件7复合突变小鼠评估Trp53基因失去了维持小鼠肺部代谢和肿瘤发生的自噬需求。

我们在此报告，BRAF的生长需要自噬V600E型–驱动肺部肿瘤，并确定自噬成瘾的代谢改变。此外，我们提供了直接证据，证明自噬的肿瘤抑制功能可以通过肿瘤发生早期活性氧（ROS）的缓解来解释。最重要的是，自噬的主要促肿瘤功能可以通过保存线粒体功能和提供代谢底物来解释，代谢底物赋予持续肿瘤发生所必需的应激耐受能力。因此，自噬可以防止代谢功能障碍并确保BRAF的健康V600E型-驱动肺部肿瘤。

结果

删除附件7阻断BRAF中的自噬V600E型–导致肺癌

为了检测自噬在肿瘤形成和进展中的作用，对Cre活性纯合小鼠进行了研究布拉夫加利福尼亚州等位基因(21)与…交配附件7flox/flox公司老鼠(22)，在这些动物中，鼻腔注射腺病毒Cre重组酶可同时使致癌BRAF表达V600E型删除floxed等位基因时发生变异附件7在小鼠肺部。BRAF公司V600E型模型的选择既考虑了其快速进展（2-4周内增生，6-8周内形成离散腺瘤），也考虑了与功能丧失和获得肿瘤模型配对时产生多种恶性肿瘤的能力。BRAFV600E型小鼠肺肿瘤模型产生良性腺瘤，除非与已知抑癌基因缺失的小鼠杂交INK4A/ARF公司或TRP53型此时病变进展为腺癌(21). 因此，BRAFV600E型小鼠肺肿瘤模型能够直接验证自噬作为肺肿瘤发生调节器的假设，并有可能揭示自噬对肿瘤生长的促进和抑制作用。

在这个肺癌的基因工程小鼠模型中，所有肿瘤都是由组成活性的BRAF启动的V600E型蛋白质(21).附件7通过聚合酶链式反应（PCR）（数据未显示）以及BRAF肿瘤发生的早期（5周和7周）和晚期（20周和30周）证实ATG7蛋白表达的缺失和缺失V600E型-免疫组织化学衍生肿瘤(图1A和图S1). 由于腺病毒Cre只感染一小部分肺细胞，并且只感染活化的BRAF，因此在肿瘤组织和非正常肺组织中检测到ATG7缺失V600E型形成肿瘤并扩大人口附件7野生类型或已删除的单元格。因此，在这种情况下，无法评估正常肺的自噬功能。附件7腺病毒-Cre单独缺失不会导致肿瘤(图S2以及(13). 所有肿瘤的表面活性蛋白c（II型肺泡上皮细胞的标记物）均为阳性，证实肿瘤在肺部发生(图1A). 肿瘤裂解物来自布拉夫V600E版本/+; 附件7−/−小鼠未能将LC3-I转化为LC3-II，并积累了自噬底物p62(图1B). 同样，在肿瘤组织中可以看到LC3点布拉夫V600E型/+; 附件7+/+小鼠肿瘤组织中只检测到弥散细胞质染色布拉夫V600E型/+; 附件7−/−老鼠(图1C). 综上所述，这些数据表明附件7缺失足以阻断BRAF中的自噬V600版本E类-驱动肺部肿瘤。

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附件7小鼠模型中的缺失阻断自噬吹牛V600E型–驱动肺部肿瘤发生

A.ATG7和表面活性剂蛋白C在7的代表性IHC(布拉夫V600E型/+; 附件7+/+和布拉夫V600E型/+; 附件7−/−)创建后。显示了这些数据的量化。晚期时间点（20、30周）ATG7表达的IHC在图S1.比例尺=10μm

B.LC3-I到LC3-II转化的Western blot分析，并评估布拉夫V600E型/+; 附件7+/+和布拉夫V600E版本/+; 附件7−/−Cre后10周肿瘤裂解物。数字指的是单个老鼠。在正常肺和肿瘤裂解物之间故意包括一条空白通道。另一个附件7出于美观原因，将零肿瘤裂解物拼接出来。

C.LC3斑点的代表性IHC染色布拉夫V600E型/+; 附件7+/+和布拉夫V600E型/+; 附件7−/−肿瘤感染后8周。比例尺=10μm。箭头表示点。请注意，在附件7无肿瘤。

自噬性消融导致肺部肿瘤早期形成

接下来，我们进行了时间进程分析，以评估长期携带布拉夫V600E型/+或者附件7+/+或附件7−/−肺部肿瘤。肺组织学检查显示肿瘤负担有显著差异。Cre后5周，附件7缺乏的布拉夫V600E型/+与之相比，肿瘤增加了近40%的肿瘤负担附件7+/+肿瘤(图2A-C). 这增加了布拉夫V600E型/+; 附件7−/−在Cre后3周和5周，在小鼠的micro-CT分析中也观察到小鼠(图S3). 因此，附件7缺乏促进早期BRAFV600E型–驱动肿瘤生长。

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附件7缺乏对肿瘤的形成和维持有明显的影响布拉夫V600E型–驱动性肺肿瘤，与嗜酸细胞瘤的出现和线粒体功能衰竭有关

A.Cre后指定时间肺叶的典型H&E染色。比例尺=3mm。全日制课程的H&E扫描幻灯片见图S2.

B.通过Matlab在指定的时间点通过H&E幻灯片量化肿瘤负担（两只小鼠/组，分析所有肺叶）。误差条表示SEM。全日制课程的扫描H&E幻灯片见图S2.

C.Cre后5、7、14周H&E幻灯片的代表性低倍图像。比例尺=100μm。插图中提供了更高放大率的图像。比例尺=50μm。

D.指定时间内肿瘤H&E染色的代表性高倍图像。请注意布拉夫V600E版本/+; 附件7−/−表明嗜酸细胞瘤的肿瘤。比例尺=10μm

E。布拉夫V600E型/+; 附件7−/−肿瘤有缺陷线粒体堆积。Tom20 IHC的代表性图像、电子显微照片和Cre后指定时间的酶细胞色素c氧化酶分析。对于Tom20，比例尺=10μm。对于EM，N=细胞核MT=线粒体。比例尺=500 nm。箭头指向肿胀的线粒体布拉夫V600E型/+; 附件7−/−肿瘤。对于细胞色素c氧化酶，箭头指向用虚线表示的肿瘤区域，其中线粒体缺陷位于布拉夫V600E型/+; 附件7−/−肿瘤。比例尺=100μm。

F.肿瘤裂解物中Cox-IV的Western blot布拉夫V600E/+；附件7+/+和布拉夫V600E型/+; 附件7−/−Cre后10周的小鼠。数字指的是单个老鼠。在正常肺和肿瘤裂解物之间故意包括一条空白通道。另一个附件7出于美观原因，将零肿瘤裂解物拼接出来。

G.Kaplan-Meier分析布拉夫V600E/+；附件7+/+和布拉夫V600E版本/+; 附件7−/−小鼠接种Cre。显示了每组动物的数量和平均存活率。

H.Kaplan-Meier分析布拉夫V600E/+；贝克林1+/+和布拉夫V600E型/+; 贝克林1+/−Cre后的小鼠。显示了每组动物的数量和平均存活率。

I.Ki67、p53和p21的代表性IHC来自布拉夫V600E/+；附件7+/+和布拉夫V600E型/+; 附件7−/−Cre后14周的小鼠。比例尺=10μm。Cre后5、7、14周IHC的量化如下所示。中提供了整个时间过程的图像图S4.

组织学上，布拉夫V600E型/+; 附件7+/+肿瘤在5周时表现为轻度增生，7周时进展为离散腺瘤，在Cre后14周时稳定生长为乳头状腺瘤，此后不久小鼠死亡(图2D). 等位基因缺失附件7在里面布拉夫V600E型/+; 附件7+/−Cre术后5周出现小的局灶性腺瘤，说明肿瘤适度加速生长（数据未显示）。重要的是布拉夫V600E型/+; 附件7−/−早在Cre术后5周，肿瘤就表现出严重的腺瘤形成，但到Cre术后10周，肿瘤表现出生长迟钝的迹象(图2A–C和S2系列).

自噬缺陷改变BRAFV600E型从腺瘤到嗜酸细胞瘤的肿瘤命运

组织学检查显示布拉夫V600E版本/+; 附件7+/+正如预期的那样，肿瘤是腺瘤，而布拉夫V600E型/+; 附件7−/−肿瘤由肿瘤细胞组成，其细胞质呈嗜酸细胞瘤的特征，呈颗粒状扩大(图2D). 瘤细胞瘤是一种罕见但主要为良性的肿瘤类型，其特征是线粒体缺陷堆积(12). 的确，附件7缺陷同样改变了KRAS的进展G12D系列-非小细胞肺癌转化为嗜酸细胞瘤(13).

符合附件7缺陷改变了从腺瘤到嗜酸细胞瘤的肿瘤命运，自噬缺陷肿瘤积累的线粒体明显多于它们附件7-表达IHC为Tom20测量的对应项(图2E). 电子显微镜（EM）显示布拉夫V600E型/+; 附件7−/−与正常线粒体相比，肿瘤肿胀变形布拉夫V600E型/+; 附件7+/+肿瘤。此外，线粒体在布拉夫V600E型/+; 附件7−/−与肿瘤细胞相比，肿瘤细胞色素c氧化酶（电子传递链的重要组成部分）的酶活性显著降低，表明肿瘤功能较差附件7-表达对等项(图2E). 在来自附件7-与表达附件7表明自噬消融导致这些肿瘤线粒体的功能缺陷(图2E、F). 因此，自噬缺陷足以改变BRAF中从腺瘤到嗜酸细胞瘤的肿瘤命运V600E型与KRAS患者相似的肺部肿瘤G12D系列突变。

附件7缺乏能延长BRAF小鼠的寿命V600E型–驱动性肺部肿瘤

侵袭性肿瘤，如由致癌H或KRAS驱动的肿瘤，依赖自噬生存(8,9,13,15). 根据这些发现，并与附件7-我们观察到，完全阻断自噬足以延长BRAF小鼠的生存期，并使其几乎加倍V600E型驱动性肺部肿瘤（p=0.017）(图2G). 老鼠布拉夫V600E型/+; 附件7+/+肿瘤是第一个死亡的，Cre术后平均存活16周。相比之下，布拉夫V600E型/+; 附件7−/−荷瘤小鼠的中位生存期为31周。肿瘤特异性等位基因缺失附件7或重要自噬基因的全身等位基因缺失贝克林1，显著削弱但不能消除自噬(23)未改变BRAF小鼠的存活率V600E型肺肿瘤(图2G、H)表明完全而非部分消融自噬对抑制肿瘤生长和提高小鼠生存率是必要的(23). 值得注意的是贝克林1+/−荷瘤小鼠（15.1周）与荷瘤小鼠几乎相同附件7+/−肿瘤（15.8周）。重要的是，自噬底物p62的积累在布拉夫V600E/+；附件7−/−肿瘤与布拉夫V600E/+；贝克林1+/−肿瘤，与由附件7不足（数据未显示）。

提高小鼠的存活率附件7−/−与相比附件7+/+;布拉夫V600E型/+在给药14周后，通过核Ki67染色评估肿瘤细胞增殖减少，p53、p21和γ-H2AX水平升高(图2I,S4系列,第5章). 野生型和附件7-缺乏肿瘤衰老相关β-半乳糖苷酶阳性(图S6A)消除衰老是生长停滞和减少肿瘤负担的机制附件714周时缺乏。同样，Cre给药14周后，未检测到活性胱天蛋白酶-3的显著变化(图S6B).

p53诱导附件7-不足布拉夫V600E型肺部肿瘤限制肿瘤生长

p53和p21的诱导附件7-肿瘤缺陷导致我们质疑自噬缺陷抑制肿瘤增殖的机制是否是通过诱导p53反应。为了验证这一假设，我们删除了Trp53基因在里面布拉夫有或无肺肿瘤附件7并跟踪结果小鼠的肿瘤发生。删除附件7在里面Trp53基因-缺陷，BRAFV600E型肺肿瘤导致ATG7蛋白表达缺失（残留的ATG7蛋白质是由于肿瘤的基质成分没有被删除附件7)LC3的积累和自噬底物p62表明自噬失活(图3A). 烧蚀Trp53基因并没有改变附件7-肿瘤缺陷，表现为3周和5周时micro-CT定量分析中正常/健康肺体积减少(图3B)，或肿瘤负荷的最终减少，显示为与附件7野生型肿瘤(图3C). 在小鼠体内观察到Trp53基因-完整BRAFV600E型-活化肿瘤(图2I)，该表型与核Ki67染色减少显示的增殖缺陷有关(图3D). Kaplan-Meier分析表明，自噬缺陷可独立于p53状态延长荷瘤小鼠的寿命。然而，动力学是不同的；带有Trp53基因-有缺陷的肿瘤比完整的肿瘤更容易死亡Trp53基因(图3E). 因此，ATG7的缺失会导致BRAF中过早的p53诱导V600E型抑制增殖和肿瘤生长的肺部肿瘤。附件7-缺乏抑制生长Trp53基因-在统计学上有显著意义的缺陷肿瘤（p=0.04），显示第二个，Trp53基因独立的生长抑制机制对肿瘤特异性细胞丢失的反应附件7然而，我们注意到Trp53基因在抑制肿瘤生长和提高荷瘤小鼠的整体生存率方面起着重要作用附件7删除的肿瘤。

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p53缺失并不能消除携带布拉夫V600E型/+; 附件7−/−肿瘤

A.ATG7表达、LC3-I到LC3-II的转化以及p62在肿瘤裂解物中的积累的Western blot分析Trp53基因+/+; 布拉夫V600E型/+; 附件7+/+,Trp53基因+/+; 布拉夫V600E型/+; 附件7−/−和Trp53基因−/−; 布拉夫V600E型/+; 附件7+/+,Trp53基因−/−; 布拉夫V600E型/+; 附件7−/−Cre后14周。数字指的是单个老鼠。

B.典型的显微CT图像和3D重建Trp53基因−/−; 布拉夫V600E型/+; 附件7+/+和Trp53基因−/−; 布拉夫V600E型/+; 附件7−/−Cre后3周和5周的肿瘤显示Trp53基因−/−; 布拉夫V600E版本/+; 附件7−/−小鼠在早期的时间点。数字指的是单个老鼠。右侧显示了正常肺容量的量化。

C.典型的显微CT图像和3D重建Trp53基因+/+; 布拉夫V600E型/+; 附件7+/+,Trp53基因+/+; 布拉夫V600E型/+; 附件7−/−和Trp53基因−/−; 布拉夫V600E型/+; 附件7+/+,Trp53基因−/−; 布拉夫V600E型/+; 附件7−/−Cre后7周和10周的肿瘤显示Trp53基因−/−; 布拉夫V600E型/+; 附件7−/−在晚时间点的老鼠。数字指的是单个老鼠。右侧显示了正常肺容量的量化。

D.Ki67染色的代表性图像Trp53基因+/+; 布拉夫V600E型/+; 附件7+/+，Trp53+/+; 布拉夫V600E型/+; 附件7−/−和Trp53基因−/−; 布拉夫V600E型/+; 附件7+/+,Trp53基因−/−; 布拉夫V600E版本/+; 附件7−/−Cre后4周和14周肿瘤。比例尺=10μm量化显示在右侧。

E.Kaplan-Meier分析Trp53基因+/+和Trp53−/−;布拉夫V600E型/+; 附件7+/+和布拉夫V600E型/+; 附件7−/−小鼠接种Cre。每组小鼠的数量和中位生存率如图所示。注：当p值高度显著（p=0.0003）时，本研究于22周结束。

F.组织学（H&E）、Tom20 IHC、电子显微镜和Cre后指定时间的酶细胞色素c氧化酶分析的代表性图像。对于H&E，比例尺=10μm对于Tom20，比例栏=2μm。对于EM，N=细胞核MT=线粒体。比例尺=500 nm。箭头指向肿胀的线粒体Trp53基因−/−; 布拉夫V600E型/+; 附件7−/−肿瘤。对于细胞色素c氧化酶，箭头指向用虚线表示的肿瘤区域，其中线粒体缺陷位于Trp53基因−/−; 布拉夫V600E型/+; 附件7−/−肿瘤。比例尺=100μm

与嗜酸细胞瘤的出现一致附件7删除Trp53基因−/−; 布拉夫V600E型/+肺肿瘤，这些肿瘤的特征是有缺陷的线粒体堆积（线粒体标记Tom20的染色增强表明），线粒体超微结构异常，细胞色素c氧化酶的酶活性丧失(图3F). 事实上Trp53基因缺陷不影响BRAF的转换V600E型-细胞因子缺失诱导腺癌向嗜酸细胞瘤转移附件7提示自噬对防止缺陷线粒体的积聚和维持腺癌的命运至关重要。重要的是，尽管附件7缺乏，肿瘤生长最终受损，表明促进肿瘤发生的自噬需求占主导地位。因此，抑制自噬可能是一种重要的治疗工具，可以将肺肿瘤的进展改变为更良性的命运。

附件7缺乏导致Nrf2在布拉夫V600E型肺肿瘤

确立了BRAF中自噬的对抗肿瘤生长抑制和促进作用V600E型-在肺部肿瘤的驱动下，我们将注意力转向了识别潜在机制。肿瘤生长早期增强的一种解释附件7是异常线粒体产生的活性氧增加所致。为了验证这一假设，我们首先检测了抗氧化防御主调节因子NRF2的水平布拉夫V600E型/+; 附件7+/+和布拉夫V600E型/+; 附件7−/−肿瘤。NRF2通常通过与KEAP1的相互作用通过蛋白酶体泛素化和降解(24). 自噬缺陷导致自噬底物p62的积累，与NRF2竞争KEAP1上的结合位点。因此，在自噬缺陷的条件下，NRF2积累并转移到细胞核，在那里激活细胞抗氧化防御程序(25–29). 事实上，在附件7-通过IHC检测核NRF2水平和肿瘤裂解物的Western blotting检测缺陷肿瘤(图4A、B). 核NRF2的诱导与p62的积累相关附件7-预期的缺陷肿瘤(图4A). 然而，尚不清楚这种诱导是否是由附件7由于p62积累导致的缺失，或者更确切地说是由于线粒体质量控制失败导致的活性氧生成增加，这也会诱导NRF2(26). 为了解决这个问题，我们研究了编号2BRAF损失V600E型-存在或不存在驱动性肺肿瘤发生附件7。

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损失编号2表型模拟附件7与寿命延长有关

A.肺肿瘤中p62和NRF2的代表性IHC染色布拉夫V600E/+；附件7+/+和布拉夫V600E/+；附件7−/−Cre后指定时间的小鼠。比例尺=10μm。量化如下所示。误差线为SEM。

B.NRF2在从布拉夫V600E型/+; 附件7+/+和布拉夫V600E型/+; 附件7−/−Cre后10周的小鼠。数字指的是动物个体。在正常肺和肿瘤裂解物之间故意包括一条空白通道。另一个附件7出于美观原因，将零肿瘤裂解物拼接出来。

单肺叶的H&E染色显示肿瘤的大小和数量急剧增加编号2−/−Cre后4周，小鼠无自噬状态。比例尺=3 mm。右侧显示肿瘤负担的量化。这个编号2+/+和编号2−/−graph是自噬活性和缺陷braf肿瘤的集合。这些数据在下一个图表中单独绘制。两组患者的肿瘤负担差异编号2−/−;布拉夫V600E/+版本；附件7+/+和编号2−/−;布拉夫V600E/+；附件7−/−小鼠无统计学意义（p=0.63）。两组患者的肿瘤负担差异编号2+/+;布拉夫V600E/+；附件7+/+和编号2+/+;布拉夫V600E/+；附件7−/−小鼠在本实验中没有统计学意义（p=0.49）。请参考中的类似实验图2A–C,S3和3B.

D.Cre后4周的γ-H2AX的H&E和IHC分析的代表性图像。比例尺=10μm

E.Cre后17周的8 oxo-dG IHC代表性图像。比例尺=10μm

F.Kaplan-Meier分析Nrf2；布拉夫；附件7复合突变小鼠。显示每组小鼠的数量和平均存活率。请注意编号2−/−;布拉夫V600E/+；附件7+/+和编号2+/+;布拉夫V600E/+；附件7+/+小鼠只是忽略了统计意义（p=0.06）。

编号2缺乏会提早增强并阻碍后期BRAFV600E型肺部肿瘤生长

Cre-activible小鼠布拉夫V600E型有或没有条件等位基因附件7与…交配编号2敲除小鼠后，通过鼻内注射腺病毒-Cre重组酶在肺部诱导肿瘤发生，并随时间追踪产生的肿瘤。令人惊讶的是，编号2消融导致了独立于自噬状态的早期肿瘤生长的显著但可比较的增加，表明早期肿瘤生长是由抗氧化防御能力的丧失所驱动的(图4C). 两者的复合缺陷编号2和附件7与单个基因缺失相比，早期肿瘤生长没有额外增加(图4C). 刺激诱发的早期肿瘤发生编号2缺乏与DNA损伤反应（γ-H2AX阳性）的激活有关，与ROS产生和氧化应激的升高一致(图4D). 两者的复合损失编号2和附件7与两者单独缺失相比，磷酸化γ-H2AX的水平没有显著增加，表明它们在同一途径中发挥作用(图4D). 这些发现与肿瘤切片中ROS特异性DNA加合物8-oxo-2′-脱氧鸟苷（8-oxo-dG）在其中一种或两种缺失后的阳性率增加一致附件7和编号2但不在附件7和编号2Cre给药后17周的野生型肿瘤(图4D、E).

以下方面的不足编号2表型模拟附件7生存分析中的损失

尽管显著促进了早期肿瘤的发生编号2以与观察到的相似的方式延长小鼠的存活时间附件7先前缺失：中位生存率编号2完整小鼠为17.4周，而对照组为21.6周编号2删除小鼠（p=0.003）(图4F和​和2G）。2G（2G）). 关键的是，当两种情况都发生时，存活率没有进一步增加附件7和编号2被删除（p=0.61），表明编号2消融现象附件7这两个基因相互上位。进一步加强这一论点的是编号2+/+; 布拉夫V600E型/+; 附件7−/−（26.4周）和编号2−/−; 布拉夫V600E型/+; 附件7+/+（21.6周）小鼠（p=0.55）。因此，任何一方的损失编号2或附件7或如之前报道的那样，这两个基因的缺失会降低肿瘤生长并增加生存率编号2BRAF中的删除V600E型-诱发性肺肿瘤(30). 综上所述，这表明尽管氧化应激通过抗氧化防御能力丧失或自噬缺陷或两者兼而有之刺激肿瘤早期生长，但这种早期促进肿瘤细胞增殖的作用并没有持续下去，最终导致肿瘤生长缺陷。

损失附件7饥饿时损害线粒体代谢和存活

我们假设自噬缺陷肿瘤最终无法生长，因为它们进化为代谢受损的嗜酸细胞瘤。为了验证这个假设，我们生成了附件7-野生型和缺乏型Trp53基因−/−; 布拉夫V600E型/+肿瘤衍生细胞系（TDCLs），并引导我们致力于识别在自噬缺陷环境中观察到的导致肿瘤发生迟缓的代谢缺陷。蛋白质印迹分析证实ATG7在附件7−/−TDCL，但不包括从附件7+/+肿瘤(图5A). 在HBSS饥饿期间，自噬在附件7−/−TDCL表现为LC3-I的持续积累，未被处理为LC3-II(图5B)，确认附件7−/−TDCLs自噬缺陷(图5B).

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Atg7缺失会在饥饿期间损害线粒体代谢和存活

A.在Cre后9周分离的TDCL中ATG7表达的Western blot分析Trp53基因−/−;布拉夫V600E型/+; 附件7+/+或Trp53基因−/−; 布拉夫V600E/+；附件7−/−老鼠。数字是指单个克隆。另一个附件7出于美观原因，将零肿瘤裂解物拼接出来。

B.在3天HBSS饥饿时间过程中LC3-I转化为LC3-II的Western blot分析。数字是指单个克隆。显示了两对ATG7野生型和ATG7空派生TDCL。

C.在HBSS饥饿3天和在正常生长介质中恢复4天后，对自噬活性或缺陷TDCL进行克隆形成分析。

D.同种异体移植生长Trp53基因−/−; 布拉夫V600E/+；附件7−/−和Trp53基因−/−; 布拉夫V600E/+；附件7+/+TDCL。对每个基因型的8个肿瘤进行监测。

E.TDCL总线粒体质量和相对线粒体膜电位（MMP）的FACS分析。

F.海马测量正常生长条件下或4小时HBSS饥饿后自噬能力强和缺乏TDCL的基础和储备耗氧率（OCR）。

G.用RPMI、HBSS或补充外源谷氨酰胺（2mM）、丙酮酸钠（1mM）或葡萄糖（4.5g/L）的HBSS孵育的TDCL在HBSS饥饿3天和在正常生长培养基中恢复4天期间的克隆原性存活。

H.添加2mM谷氨酰胺（Q）前后，用HBSS孵育的TDCL中OCR的海马测量。喷油正时由箭头指示。

以下方面的不足附件7与附件7野生型对应物(图5C、D)概述基因工程小鼠的发现(图2G). 与观察到的线粒体缺陷一致附件7在基因工程小鼠的肿瘤缺陷中，自噬缺陷的TDCL拥有更多的线粒体，但与野生型相比，功能性线粒体的比例较小(图5E). 接下来，我们用HBSS（4小时）作为其代谢适应度的第一近似值，检测了在正常生长培养基（RPMI）中或短期饥饿后维持的自噬能力强和缺乏的TDCL的耗氧率（OCR）。自噬缺陷TDCL的基础和饥饿诱导OCR水平显著低于自噬活性TDCL测量的比率(图5F). 重要的是，自噬缺陷的TDCL在饥饿后几乎没有线粒体储备能力（注射解偶联剂三氟羰基氰化物苯肼FCCP后的OCR），这进一步支持了自噬提供维持线粒体功能的代谢物的假说(图5F).

接下来，我们确定了自噬提供的代谢成分，这些代谢成分能够在饥饿期间存活。添加外源性谷氨酰胺或少量丙酮酸钠（但不添加葡萄糖）或活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）足以挽救附件7-克隆形成试验中缺乏TDCL对饥饿（HBSS）的反应(图5G和第7部分). 这表明自噬缺陷使TDCLs谷氨酰胺依赖。NAC无法保护附件7-饥饿诱导死亡导致的TDCL缺乏表明，活性丧失并非由于ROS过量产生，而是由于代谢不足(图S7). OCR分析显示，自噬缺陷的TDCL能够利用谷氨酰胺来改变三羧酸（TCA）循环，与缺乏谷氨酰胺的情况相比，尽管它们在这方面的效率不如自噬能力强的TDCLs，但OCR增加(图5H). 综上所述，这些数据表明附件7-肿瘤生长不足是由于线粒体整体功能受损和剩余功能线粒体的底物限制（尤其是谷氨酰胺），共同导致与肿瘤持续生长不相容的代谢危机。

讨论

自噬在癌症中的作用是复杂的；它可以根据细胞环境抑制或促进肿瘤发生(1,15). 自噬的这些差异效应是否是由于所检测模型的人为因素造成的，或是发生在人类癌症中的，尚待确定。可能影响自噬在癌症中作用的因素包括组织类型、驱动基因突变的性质、生长和增殖引起的代谢需求、固有代谢应激水平以及参与的特定代谢途径。很明显，生理、遗传和体内需要采取措施来解决这些问题。

为了解决自噬在癌症中的上下文依赖性作用，我们消融了附件7在BRAF的Cre激活小鼠模型中V600E型-驱动性肺肿瘤发生通常导致良性肿瘤(21). 我们证明，通过丢失附件7线粒体质量控制的伴随损失会增加氧化应激，促进早期肿瘤发生，揭示了自噬限制肿瘤生长的潜在机制。然而，持续的线粒体功能障碍最终掩盖了这种最初的肿瘤生长优势，导致代谢障碍、肿瘤负担减轻、嗜酸细胞瘤的出现以及小鼠总体存活率的增加。

这些研究提出了几个重要观点。第一，附件7BRAF背景下的缺陷V600E型-驱动性肺肿瘤发生促进肿瘤早期生长。这种对肿瘤细胞增殖的初始刺激与氧化应激的增加有关，这表明它可能是ROS介导的事件。同样，失去抗氧化防御主调节器，Nrf2、，最初促进了BRAF的增殖V600E型-驱动性肺部肿瘤，以及两者的丧失附件7和编号2没有提供额外的增长优势。这表明，自噬或抗氧化防御能力丧失导致的氧化应激可能会刺激早期BRAFV600E型肺肿瘤的生长和附件7和编号2是遗传上位性的。

众所周知，活性氧会导致基因组损伤和突变，从而引发癌症，而自噬缺陷会增加活性氧水平、突变率和基因组不稳定性(6,7). 然而，ROS产生的这些后果不太可能在这里发挥作用，因为附件7或编号2损失是暂时的。ROS激活致癌信号通路，包括HIF、Wnt/β-catenin、Notch和ERK，这些信号事件更有可能是BRAF中观察到的短暂生长刺激的原因V600E型肺肿瘤缺乏附件7或编号2。肿瘤负担的最终减轻是否与附件7或编号2损失对应于线粒体功能的逐渐恶化和活性氧生成的损失。我们认为，自噬缺陷会导致功能失常的线粒体的积累，从而引起氧化应激（就像失去线粒体一样）编号2-介导的抗氧化防御），最初刺激BRAF的生长V600E型-通过激活促生长信号通路驱动肺部肿瘤。在这种情况下激活的潜在信号事件仍有待确定，尽管在附件7野生型和缺乏型布拉夫V600E型肺肿瘤（数据未显示）。另外，自噬提供的底物水平不足，如蛋白质降解产生的谷氨酰胺，可能会损害线粒体代谢、活性氧生成和代谢适应性(图6).

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的角色附件7在布拉夫V600E型-驱动性肺肿瘤

详见正文。

其次，自噬是维持BRAF生长所必需的V600E型-并决定了它们的命运。具体来说，自噬消融改变了腺瘤的肿瘤进展(Trp53基因完整肿瘤）和腺癌(Trp53基因零肿瘤）转化为嗜酸细胞瘤。这一数据表明，通过抑制自噬改变肿瘤向良性嗜酸细胞瘤的命运可能是治疗BRAF公司V600E型-并可能扩展到MAP激酶信号驱动的其他肿瘤。重要的是，任何一种重要自噬基因的缺陷附件7或附件5在RAS转化的癌细胞系中，损伤肿瘤生长并导致缺陷线粒体的积累(8,9)如BRAF所示V600E型-诱发肿瘤。因此，嗜酸细胞瘤表型和肿瘤生长缺陷是自噬缺陷的结果，与细胞自噬非依赖性功能无关附件7.尽管附件7缺陷也会改变KRAS的命运G12D系列-腺瘤和癌向嗜酸细胞瘤转移(13)，以BRAF表示V600E型肺肿瘤发生得更快，生存率更高，提示MAP激酶信号可能是自噬依赖性的关键驱动因素。测试自噬在其他BRAF中的作用将非常有趣V600E型导致恶性肿瘤。确定急性自噬消融是否足以将既定肿瘤转化为嗜酸细胞瘤也非常重要。

自噬消融产生的嗜酸细胞肿瘤与增殖减少有关，表明细胞周期抑制是肿瘤负担减少的主要原因。由以下因素引起的p53诱导增强附件7-缺陷有助于但不是增殖性停搏反应所必需的附件7缺乏，揭示了p53依赖和p53依赖机制，自噬通过这些机制促进肿瘤细胞增殖，就像KRAS一样G12D系列-驱动性肺肿瘤(13). 自噬缺陷（消融或等位基因丢失）激活DNA损伤反应(6,23). 最近，等位基因丢失贝克林1被证明可以激活p53介导的阻滞物来促进乳腺肿瘤的发生(31). 肿瘤明显激活自噬来抑制p53反应，这是肿瘤促进机制的一部分。这些发现与自噬在维持RAS驱动肿瘤线粒体代谢中的中心重要性一致(8–10,13)并将现象的可推广性扩展到包括BRAFV600E型-肺部肿瘤以及其他致癌事件引起的肿瘤(32).

第三，我们确定了一种潜在的机制来解释附件7-BRAF不足V600E型-驱动肺部肿瘤。自噬最初在酵母中被确定为氮饥饿生存所需的途径(33). 哺乳动物也需要自噬才能在饥饿中生存(34)正如许多癌细胞的情况一样(1). 自噬降解细胞内成分，使其在缺乏时在代谢和生物合成途径中再循环(16). 事实上，自噬缺陷型BRAFV600E型TDCL在肿瘤发生过程中受损，无法在饥饿中存活，但通过补充谷氨酰胺，TDCL得到了极大的挽救。因此，附件7缺乏导致对外源性谷氨酰胺的依赖，这可能是由于缺乏自噬介导的蛋白质降解中回收的内部谷氨酰胺。因此，自噬成瘾可能只是向肿瘤细胞提供谷氨酰胺的一种手段。重要的是要确定附件7-缺乏的肿瘤细胞由于底物限制或线粒体功能障碍或两者兼而有之而代谢衰竭。此外，重要的是要确定附件7-TDCL不足在体外是肿瘤生长缺陷的直接原因吗体内.

删除附件7在里面Trp53基因-缺陷和KRASG12D系列激活的肺肿瘤导致了严重的炎症性肺炎，以及因脂肪酸氧化受损而导致线粒体和中性脂质缺陷的积聚(13). 我们没有观察到炎症或脂肪堆积附件7在中Trp53基因-缺陷，BRAFV600E型-激活的肺肿瘤或TDCL体外；我们也没有看到移植瘤中出现脂质囊肿(图S8和未显示的数据）表明新陈代谢和线粒体利用存在根本差异，从而区分KRASG12D系列和BRAFV600E型肺部肿瘤。的确，在黑色素瘤中，BRAFV600E型激活丙酮酸脱氢酶，促进TCA循环中丙酮酸的利用，从而驱动肿瘤诱导的衰老(35). BRAF在黑色素瘤模型中也得到了很好的证实V600E型通过调节转录因子抑制线粒体生物发生MITF公司过氧化物酶体增殖物激活受体γ，辅激活物1α（PGC1α(36). 线粒体质量控制对布拉夫V600E型恶性肿瘤是指由于丙酮酸利用增加，功能线粒体的数量已经减少，呼吸增强。综上所述，这项工作为自噬在BRAF中的调控位置和方式提供了有价值的见解V600E型-并进一步支持了自噬抑制在癌症治疗中的临床应用。

材料和方法

畜牧业和感染

所有实验均按照IACUC指南进行。布拉夫CA/CA公司老鼠被培育成附件7flox/flox公司（小松博士提供）或贝克林1+/−（由Z.Yue博士提供）生成布拉夫加利福尼亚州/+; 附件7+/+、布拉夫卡/+; 附件7−/−和布拉夫加利福尼亚州/+; 贝克林1+/+或布拉夫加利福尼亚州/+; 贝克林1+/−老鼠。化合物布拉夫；附件7老鼠被培育成Trp53基因液氧/液氧（杰克逊实验室）或编号2−/−（YW Kan）产生三重突变小鼠。对于腺病毒Cre感染，6-8周龄的小鼠用异氟醚和高滴度复制缺陷型腺病毒-Cre（4×107pfu/小鼠）（爱荷华大学基因载体核心）作为钙沉淀经鼻给药。在老鼠回到它们的住所之前，对它们进行监测，直到它们完全从麻醉剂中恢复过来。对于TDCLs的同种异体研究，107将细胞双侧注射到6周龄裸鼠的侧翼（Taconic）。每2天测量一次肿瘤大小。在注射后14天处死小鼠。肿瘤组织学固定如下所述。

Micro-CT分析

使用Siemens Inveon PET/CT和Inveon Acquisition Workplace软件获得最大通气量小鼠的呼吸门控低分辨率CT图像。使用INVEON Research Workplace软件，通过高斯滤波器处理重建数据，并对确定为肺部的组织进行分割，计算其体积。使用Osirix软件对正常肺组织和横切面进行三维重建。

抗体

以下抗体用于Western blotting或IHC分析：ATG7（Sigma，Cat#:A2856）、表面活性剂C蛋白（Seven Hills Biochents，Cat#:WARAB-SPC）、LC-3（Nano Tools，Cat#：LC3-5F10）、p62（针对MBP全长的抗血清p62(8)或从Enzo Life Sciences PW9860-0100购买）、Ki67（Abcam.，类别号：ab-15580）、p53（Leica，产品代码：NCL-p53-CM5P）、p21（BD Biosciences，类别号56431）、活性caspase-3（Cell Signaling，类别号9661）、γ–H2AX（Cell信号，类别号2577）、Nrf2（Epitomics，类别编号：2178-1）、，Tom20（Santa Cruz Biotechnology，Cat#sc-11415，Cox-IV（分子探针），8-oxo-dG（克隆2E2，Trevigen），phospho-Erk（细胞信号Cat#4376），NRF2（Epitomics Cat#2178）Beta actin（Calbiochem Cat#CP01）。

组织学

对于石蜡切片，将肺部解剖成单个肺叶，在PBS中清洗2次，然后在室温下用10%的福尔马林缓冲溶液（福尔马德弗雷什，Fisher Scientific）固定4小时，然后转移到70%的EtOH中进行切片。对于冷冻切片，将肺组织固定在10%福尔马林中，转移到15%蔗糖中2小时，然后最终转移到30%蔗糖中并进行处理。

细胞色素C氧化酶染色

改良Nadi反应进行如下。将未固定的冰冻切片在培养液（7.5ml水中的75mg蔗糖、pH 7.6的0.2M磷酸盐缓冲液、5mg 3′-二氨基联苯胺四氯化物、10mg细胞色素c、20ug过氧化氢酶）中进行RT1小时染色。过氧化氢酶（c-10）、细胞色素c（c-2506）和DAB（D-5637）购自Sigma。在安装和成像之前，将载玻片在去离子水中清洗三次，在升华醇中脱水（50%、70%、80%、95%两次，然后100%两次）。

衰老相关β半乳糖苷酶评估

按照制造商的建议进行β-半乳糖苷酶染色（细胞信号Cat#9860）。简单地说，切片在1X固定剂中固定10分钟，用PBS冲洗两次，然后用β-半乳糖苷酶染色缓冲液在37℃无CO的条件下培养过夜2用曙红对样品进行短暂的复染，以便于组织的可视化。

TDCL

TDCL生成自第53页−/−; 布拉夫V600E型/+有或无肿瘤atg7型Cre后9周。TDCLs在含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠和1mM碳酸氢钠的RPMI 1640培养基中培养，培养温度为38.5°C，CO含量为8.5%2通过PCR和蛋白质印迹证实了这些系中的Atg7状态。TDCL在使用前饥饿后进一步表征LC3和p62的积累。未执行其他身份验证。

身体染色

0.6 ×106将细胞接种在6孔板的盖玻片上，在HBSS中饥饿24小时。饥饿后，用PBS冲洗细胞两次，然后用Bodypy（1mg/ml）培养15分钟，并用DAPI进行复染。将载玻片在水中冲洗，并用Prolong Anti-fade Gold进行安装和成像。

西方印迹法

肿瘤块被快速冷冻，然后用研钵和杵在液氮中研磨。材料在RIPA缓冲液中溶解，用Bio-Rad BCA试剂评估蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分析。对于TDCL，如前所述制备全细胞裂解物(5).

线粒体质量和电位测量

活TDCL与25nM Mitotracker-Red CMXRos（分子探针/Invitrogen）联合标记，以评估线粒体膜电位（MMP）和25nM Miltotracker–Green FM（分子探针/Invitrogen），以测量正常生长条件下30分钟的线粒体质量。标记后，将样品在生长培养基中洗涤两次，进行胰蛋白酶化，并通过流式细胞仪（BD Influx Cell Sorter，BD Biosciences）进行分析。显示平均线粒体质量荧光。通过将平均MMP荧光（红色）除以线粒体质量荧光（绿色）的平均值来计算相对MMP。

耗氧量测量

如前所述，使用Seahorse Biosciences细胞外通量分析仪（XF24）测量OCR率(8). 0.05 × 106每孔细胞接种在正常生长介质（含10%FBS的RPMI）中，并在38.5°C和8.5%CO条件下附着24–30小时2在学习之前。在与RPMI或HBSS孵育4h后收集基础测量值。如图所示，通过从XF24端口注射线粒体解偶联剂FCCP（1.5μM）和复合III抑制剂抗霉素（20μM）来测量SRC（最大呼吸容量-基础呼吸速率）和总储备容量。对于谷氨酰胺利用实验，将细胞如上所述进行电镀，与HBSS孵育30分钟，然后转移到海马进行分析，在海马中通过XF24端口注入l-谷氨酰胺（2mM）。如图所示，在添加谷氨酰胺之前/之后收集测量值。

电子显微镜

将肿瘤固定在2.5%戊二醛/4%多聚甲醛/8 mM氯化钙中，缓冲液pH为7.4，缓冲液为0.1M。样品在交付前储存在4C过夜，以便进一步处理。它们在缓冲的1%四氧化锇中进行后固定，然后在嵌入epon树脂之前在一系列分级丙酮中脱水。在徕卡EM UC6超薄切片机上切割90nm薄片。用乙酸铀酰和柠檬酸铅饱和溶液对剖切的网格进行染色。如前所述，使用AMT XR41数码相机在JEOL 1200EX透射电子显微镜上以80 Kv的电压拍摄图像(5).

克隆生存分析

0.07× 106将TDCL接种在正常生长培养基中的12孔板中，并使其附着过夜。在用正常生长培养基、HBSS或添加1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖或4mM NAC的HBSS培养前，用PBS冲洗细胞两次，持续3天。饥饿后，细胞在正常生长介质中恢复4天，然后甲醇固定和Giemsa染色。对于图S7固定和染色前，细胞饥饿3天，在正常培养基中恢复3天。

统计

使用GraphPad Prism 5.0版进行统计分析。通过双向方差分析和Bonferroni后验计算统计显著性。Kaplan-Meier分析的显著性使用对数秩检验进行计算。为了量化IHC载玻片的肿瘤负担，使用Trestle MedScan全玻片扫描仪对标本进行数字化。在Matlab 2011b上建立了自动图像处理协议。对每个标本的整个幻灯片进行分析，得出肿瘤面积和总组织面积的测量值。每张幻灯片都制作了肿瘤和全组织面具。分割模板用于生成肿瘤负担比率。对于IHC的定量，每个基因型的多个图像中至少有200个细胞被打分。

​

重要性声明

必需的自噬基因附件7促进BRAF的职能V600E型-通过保护线粒体谷氨酰胺代谢来驱动肺部肿瘤的发生。这表明抑制自噬是治疗BRAF的一种新方法V600E型-引发癌症。

补充材料

1

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三

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致谢

这项工作得到了NIH的资助（R37 CA53370，R01 CA130893，RO1 CA163591，RCI CA147961 to EW，CA131261 to MM），以及NJCCR to AMS的博士后研究金（09-2406-CCR-E0）

我们感谢小松先生提出的条件附件7老鼠，Z.Xue代表贝克林1+/−老鼠和Y.W.Kan代表编号2击倒老鼠。我们还感谢R.Patel提供的电子显微镜，N.Campbell提供的micro-CT，W.Chen提供的组织学定量，A.Roberts提供的FACS分析，CINJ Tissue Analytics Services的工作人员，P.Chin提供的技术援助，以及怀特实验室的成员提供的有益讨论。

缩写

国际控股公司免疫组织化学
ROS公司活性氧物种
非小细胞肺癌非小细胞肺癌
TDCL肿瘤衍生细胞系
NAC公司N-乙酰半胱氨酸
问谷氨酰胺
光学字符识别氧气消耗率
催化裂化装置三氟羰基氰化物苯腙
TCA循环柠檬酸循环
相对长度单位电子显微镜
聚合酶链反应聚合酶链反应

脚注

作者没有透露潜在的利益冲突

工具书类

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