欧洲医学研究杂志。2013; 18(1): 28.
uPA系统在胃癌腹膜转移中的临床意义
,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1和
2 优成鼎
1中国上海市即墨路150号同济大学医学院东方医院普外科，邮编：200120
张慧（音）
1中国上海市即墨路150号同济大学医学院东方医院普外科，邮编：200120
钟铭安
1中国上海市即墨路150号同济大学医学院东方医院普外科，邮编：200120
朱庆周
1中国上海市即墨路150号同济大学医学院东方医院普外科，邮编：200120
志翔庄
1中国上海即墨路150号同济大学医学院东医院普通外科，200120
华阴
1中国上海市即墨路150号同济大学医学院东方医院普外科，邮编：200120
王旭景
1中国上海市即墨路150号同济大学医学院东方医院普外科，邮编：200120
朱正刚
2中国上海市瑞金二路197号上海交通大学医学院瑞金医院消化科，邮编200025
1中国上海市即墨路150号同济大学医学院东方医院普外科，邮编：200120
2中国上海市瑞金二路197号上海交通大学医学院瑞金医院消化科，邮编200025
通讯作者。 2012年11月7日收到；2013年8月19日验收。
版权所有©2013 Ding等人。；被许可方BioMed Central Ltd。 摘要
背景
已有研究表明，尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）通过降解细胞外基质参与肿瘤细胞的转移。然而，很少有直接证据表明uPA系统在胃癌腹膜转移组织中表达。本研究旨在研究uPA系统在腹膜和非腹膜转移患者腹膜组织中的表达，并探讨uPA系统的诊断价值。
方法
用半定量RT-PCR和ELISA检测uPA、uPAR和PAI-1的表达。使用uPA活性试剂盒检测到uPA活性。
结果
在7例腹膜转移患者的两种腹膜组织中，uPA、uPAR和PAI-1的表达没有显著差异。然而，在24例非腹膜转移患者的腹膜转移病灶中，uPA、uPAR和PAI-1的表达显著高于正常腹膜组织中的表达(P（P）<0.05). 此外，不同组织中uPA活性无统计学差异。
结论
uPA系统的表达与胃癌腹膜转移呈正相关。这种在腹膜或非腹膜转移患者中的表达差异可能为腹膜转移的诊断提供参考。
关键词：胃癌、ELISA、腹膜转移、RT-PCR、UPA系统
背景
尽管过去几十年来，中国胃癌的发病率和死亡率有所下降，但胃癌仍是当地卫生规划的一大负担[1]. 重要的是，胃癌即使在可能治愈的切除术后也会复发，最常见的形式是腹膜转移[2]. 因此，迫切需要开发有效的胃癌腹膜转移早期诊断策略。
癌症侵袭和转移是多因素过程[三]一个重要的步骤是细胞外基质和基底膜的连续破坏和重建，这反过来需要一些蛋白水解酶系统的参与，例如丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶[4]. 尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）是一种丝氨酸蛋白酶，与肿瘤细胞表面的uPA受体（uPAR）结合。激活后，细胞结合的uPA能够将纤溶酶原转化为纤溶酶，然后纤溶酶可以降解细胞外基质的几种成分[5]. uPA-uPAR复合物对纤溶酶原的作用可由蛋白酶抑制剂PAI控制[6,7]. 因此，细胞和细胞周uPA、uPAR和PAI-1的平衡生成是有效的局部蛋白水解、细胞粘附和迁移，从而实现肿瘤细胞侵袭和转移的先决条件[8,9].
通过检测胃癌和正常粘膜组织中uPA、uPAR和PAI-1的表达水平，并分析其与各种临床病理特征的相关性，发现uPA系统与胃癌有良好的相关性。例如，Plebani等. [10]用ELISA法测定20例胃癌手术患者胃癌和正常标本中的uPAR、uPA和PAI-1水平。uPAR在胃癌中的表达水平明显较高，低水平的uPAR与较好的生存率相关。谷口等. [11]采用免疫组织化学方法研究102例原发性胃癌组织中uPAR的表达与临床病理参数的关系。102例中38例（37%）出现uPAR免疫反应。此外，uPA、uPAR和PAI-1的表达与多种临床病理因素显著相关：肿瘤大小、肿瘤浸润深度、分化程度、淋巴结转移[12-15]和腹膜转移[16,17].
然而，很少有直接证据证明uPA系统在胃癌腹膜转移与正常腹膜组织鉴别中的临床意义。与淋巴结的规则分布和排列相比，腹膜组织的面积更大，占据了整个腹膜腔，因此胃癌细胞腹膜转移具有更大的随机性和不可预测性。因此，本研究的目的是进一步研究uPA系统在胃癌腹膜转移组织和正常腹膜组织中的表达差异，并将这些结果与临床数据相结合，确认uPA系统的诊断意义。
方法
临床样本
我们评估了31名诊断为胃癌的患者（21名男性，10名女性），这些患者于2010年7月至2010年12月期间入住我们的科室。他们的平均年龄为62.58岁（范围为23至85岁）。根据术前或术后病理分析，患者被诊断为胃癌。其中腹膜转移7例（病理类型：中分化管状腺癌1例，Ⅱ～Ⅲ级腺癌1例外，低分化腺癌3例，低分化癌合并印戒细胞癌3例），24例有非腹膜转移（病理类型：中分化管状腺癌3例，Ⅱ级腺癌3个，Ⅱ～Ⅲ级腺癌2个，低分化腺癌9个，印戒细胞癌3个、黏液癌1个，Ⅱ级癌合并印戒细胞瘤1个肿瘤，1例Ⅲ级腺癌合并印戒细胞癌，1例Ⅱ级腺癌伴粘液癌）。
对于腹膜转移患者，我们切除了腹膜转移病灶，以及少量大网膜、骨盆腹膜和无腹膜转移的膈腹膜。在非腹膜转移的患者中，还进行了一些大网膜、肾盂腹膜和膈腹膜的切除。收集的样品储存在−80°C下，以供进一步分析。
研究结束时，所有患者都还活着，我们的研究得到了同济大学附属上海东医院伦理委员会的批准。
细胞培养
将腹膜间皮细胞系（HMrSV5）的细胞维持在补充有10%胎牛血清的DMEM（Sigma，St.Louis，USA）中。细胞几乎每天在37°C、5%CO的培养瓶中以1:4或1:5的稀释度进行继代培养2.
总RNA提取和cDNA合成
按照制造商的说明，使用RNeasy™RNA提取试剂盒，通过细胞沉淀法分离总RNA（美国巴伦西亚齐亚根）。RNA纯度和浓度分别在260和280 nm处通过分光光度法测定。使用寡核苷酸（dT）引物和AMV逆转录酶对1μg总RNA进行逆转录（美国麦迪逊市普罗米加）。20μl PCR反应混合物含有2μl 10×RT缓冲液、2μl dNTPs、4μl MgCl2，0.5μl核糖核酸，1μl低聚核糖核酸（dT）18PCR条件为70℃10min，42℃15min，99℃5min，然后将cDNA保存在4℃（3个月内）。
半定量RT-PCR
通过与β-肌动蛋白基因或甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）比较，测定uPA、uPAR和PAI-1的基因表达水平。25μl RT-PCR反应混合物包含1μl cDNA、正反义引物（每个0.25μl）、2.5μl 10×PCR缓冲液、2μl 25%MgCl2、0.5μl Taq聚合酶、1μl dNTP和17.5μl Rnase-free H2O.巢式PCR用于扩增癌胚抗原（CEA），1μl第一个PCR产物用作第二个PCR模板。扩增条件为：（i）95℃初始变性5min；（ii）在94°C下30次变性循环，持续1分钟；（iii）uPA在56℃下退火30 s，uPAR在60℃下退火1 min，PAI-1在55℃下退火1min，CEA在72℃下退火2.5 min；（iv）72°C下延伸1 min或2.5 min。所用PCR引物如下：uPA，A，5′-AGAATTCACACACACATCGA GA-3′和B，5′-ATCAGCTTCCACAGTCA T-3′；对于uPAR，A，5′-ACA GGAGCTGCCCTCGGAC-3′和B，5′-GAGGGGTT CAGGTT AGG-3′；对于PAI-1，A，5′-CTTGGTGAAAGGTCTGC-3′和B，5′-CTC CACCTCTGGAAAAGTCC-3′；对于CEA，A，5′-TCTGGAACTTCTCTGGTCT CAGCTGG-3′，B，5′-TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAGC-3′和C，5′-GGGCCACTGTCGCATG ATTGG-3’；β-肌动蛋白，A，5′-TTGAGGTTC-GGGAAT-3′和B，5′-GAA AATCTG-GCACCAC CTT-3′；对于GAPDH，A，5′-GAAGGTGAAGGCGGAGTC-3′和B，5′-GAAGATGGTGATGGATTTC-3′。CEA的A和B引物用于第一次PCR，B和C引物用于第二次扩增。扩增产物分别为474 bp、1046 bp、409 bp、131 bp、591 bp和230 bp。
定量ELISA分析
将三缓冲盐水（pH 8.5，1.8 ml）添加到冷冻组织（100至300 mg）中，并在冰块中进行均质。随后，添加0.2 ml 10%Trixon X-100，以确保匀浆中的最终浓度为1%Trixon X-100。将匀浆摇晃16 h，然后在4°C的冷冻离心机中以100000的温度离心1 h克将上清液转移到一个新的试管中，并通过双茚四酮酸分析测定蛋白质浓度。根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒测定uPA、uPAR和PAI-1抗原的浓度（美国格林威治美国诊断公司）。通过添加50μl H停止反应2SO公司4，并在450 nm处用ELISA平板阅读器（EL312e微孔板阅读器，Bio-Tek Instruments，Winooski，USA）测量吸收。uPA、uPAR和PAI-1抗原的值表示为ng/mg蛋白。
uPA活性测定
使用uPA活性测定试剂盒（Chemicon）测量uPA活性。简言之，将组织蛋白与分析缓冲液混合，并与显色底物在37°C的96个平板中孵育2至24小时。在OD下读取吸光度405，并且从标准曲线中推断出活性（单位）。
统计分析
使用SAS 6.12版软件对所有数据进行分析，结果记录为平均值±标准差。通过方差分析评估组间差异的显著性，然后进行配对t吨测试。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
结果
CEA、uPA、uPAR和PAI-1 mRNA表达的半定量RT-PCR分析
CEA是胃肠道肿瘤的重要标志物。因此，我们采用高灵敏度巢式RT-PCR方法检测CEA在有或无腹膜转移的胃癌组织中的表达。正如预期的那样，在7例腹膜转移患者的腹膜转移病灶中，CEA结果均为阳性（图)。此外，通过对腹膜转移患者的肉眼观察，三例患者在非腹膜转移组织中显示CEA阳性表达。24例非腹膜转移患者中，2例CEA在正常腹膜组织中阳性表达。在腹膜间皮细胞系HMrSV5中未检测到CEA的表达。然而，uPA、uPAR和PAI-1可以在HMrSV5细胞中表达（图).
CEA mRNA在7例胃癌腹膜转移患者中的表达。M： 1000 bp标记；通道1、2、3、4、5、6和7显示了7例腹膜转移病例。β-actin作为内部参照物，使CEA的表达正常化。扩增产物分别为131 bp的CEA和591 bp的β-肌动蛋白。CEA，癌胚抗原。
HMrSV5细胞中uPA系统mRNA的表达。M、 1000 bp标记；车道1，uPA；车道2，uPAR；车道3，PAI-1；第4车道，β-actin。β-actin用作内部参照物。扩增产物分别为474 bp的uPA、1046 bp的uPAR、409 bp的PAI-1和591 bp的β-actin。
uPA系统蛋白在有或无腹膜转移胃癌组织中的表达
采用定量ELISA法测定了7例腹膜转移患者腹膜转移灶和CEA阴性非腹膜转移组织中uPA、uPAR和PAI-1蛋白的含量，24例非腹膜转让患者CEA阴性正常腹膜组织中uPAR、uPAR-1蛋白含量。结果（表)表明7例腹膜转移患者的两种腹膜组织中uPA、uPAR和PAI-1的表达无显著差异。然而，24例非腹膜转移患者的腹膜转移灶中uPA、uPAR和PAI-1的表达显著高于正常腹膜组织(P（P）< 0.05).
表1
| 蛋白质 | 腹膜转移（7例）
| 非腹膜转移（24例）
|
|---|
| CEA（+） | CEA（−） | CEA（−） |
|---|
uPA公司
| 3.312
| 2.488
| 0.408
| 0.784
| 0.640
|
3.088
| 1.664
| 0.280
| 0.632
| 0.488
|
2.952
| 0.648
| 0.672
| 0.664
| 0.224
|
0.712
| 0.504
| 0.280
| 0.800
| 0.424
|
0.520
| 0.488
| 0.440
| 0.656
| 0.328
|
0.480
| 0.128
| 0.440
| 0.256
| 0.384
|
0.376
| 1.440
| 0.512
| 0.440
| 0.848
|
|
| 0.312
| 0.464
| 0.168
|
uPAR公司
| 3.664
| 4.936
| 1.432
| 0.345
| 1.034
|
2.720
| 2.304
| 0.640
| 1.256
| 0.532
|
2.744
| 2.192
| 1.536
| 0.239
| 0.479
|
1.432
| 1.808
| 0.704
| 0.671
| 0.561
|
0.912
| 1.280
| 0.792
| 0.845
| 0.390
|
1.184
| 0.480
| 0.272
| 0.432
| 0.633
|
1.064
| 2.728
| 1.280
| 0.467
| 0.291
|
|
| 1.120
| 0.968
| 0.776
|
| PAI-1型 | 1.511
| 4.204
| 0.568
| 3.665
| 未检测到
|
3.872
| 1.725
| 0.262
| 1.426
| 0.071
|
2.782
| 0.876
| 0.488
| 3.598
| 未检测到
|
0.369
| 0.745
| 0.662
| 0.488
| 未检测到
|
1.315
| 3.023
| 0.894
| 0.127
| 0.289
|
1.041
| 0.262
| 0.963
| 未检测到
| 0.195
|
1.181
| 0.977
| 0.041
| 0.329
| 0.395
|
| | | 0.085 | 0.316 | 0.382 |
uPA活性检测
我们还检测了7例腹膜转移患者的腹膜转移灶和CEA阴性的非腹膜转移组织中的uPA活性，以及24例非腹腔转移患者的CEA阴性正常腹膜组织中的uPA活性。结果表明，在不同的组织中没有观察到统计差异（表).
表2
腹膜转移（7例）
| 非腹膜转移（24例）
|
|---|
| CEA（+） | CEA（−） | CEA（−） |
|---|
19.936
| 16.536
| 3.914
| 4.510
| 5.635
|
0.846
| 3.091
| 1.942
| 5.407
| 4.151
|
1.417
| 8.725
| 3.117
| 4.702
| 0.899
|
2.352
| 16.170
| 2.142
| 10.046
| 2.419
|
2.820
| 4.799
| 1.302
| 3.730
| 2.828
|
2.123
| 3.310
| 5.299
| 7.287
| 1.233
|
6.066
| 6.533
| 7.922
| 6.485
| 8.150
|
| | | 7.802 | 4.466 | 3.468 |
讨论
由于胃癌腹膜转移早期缺乏特定的临床表现，因此一直以来都没有最佳的治疗时机。腹水、腹部肿瘤和肠梗阻的发生表明胃癌处于晚期。因此，胃癌腹膜转移的有效诊断仍是临床上的一个挑战。目前，胃癌腹膜转移的主要诊断方法包括腹腔灌洗和细胞学检查[18,19]. 然而，阳性结果仅表明亚临床腹膜转移，因为即使腹膜液中存在肿瘤细胞，腹膜转移也不会出现。因此，腹膜组织中的检测似乎更直接、更准确。值得注意的是，腹膜组织覆盖整个腹膜腔，而肿瘤细胞的植入是随机的，因此直接检测腹膜组织中的肿瘤细胞非常困难。分子生物学家认为，自生肿瘤细胞及其受影响组织中存在一些分子变化，这些组织中的变化可能在肿瘤细胞接触它们之前就开始了[9]. 基于这一概念，我们研究了腹膜组织的分子变化，以探讨腹膜转移的潜在诊断。
CEA是一种常见的肿瘤相关抗原，是国际公认的胃肠道肿瘤标志物[20,21]. 因此，我们检测了CEA在腹膜组织中的表达。CEA阳性表达结果表明腹膜组织中存在肿瘤细胞。不出所料，我们的研究结果显示，CEA在7名腹膜转移患者的所有腹膜转移病灶中都有表达。有趣的是，有三名腹膜转移患者的CEA在非腹膜转移组织中呈阳性表达，两名非腹膜转让患者的正常腹膜组织中CEA呈阳性表达。这表明这些患者有可能发生腹膜转移。
由于它包括重要的蛋白水解酶，肿瘤细胞中的uPA系统已被证明与细胞外基质相互作用，以促进转移的微环境形成；因此，uPA系统可能参与了腹膜转移的过程[22]. 发现uPA系统在植入肿瘤和宿主组织中的表达增加[23,24]. uPA系统由丝氨酸蛋白酶uPA、糖脂锚定受体uPAR和蛇蛋白酶抑制剂PAI-1组成[25]. 因此，我们旨在全面研究这三个因素在有或无转移的腹膜组织中的变化。
uPA系统广泛分布于各个小区；我们的RT-PCR显示，uPA、uPAR和PAI-1甚至可以在间皮细胞中表达。为了避免非特异性结果，进一步使用定量ELISA检测uPA系统蛋白的表达。我们发现，与非腹膜转移患者的正常腹膜组织相比，腹腔转移患者的CEA阳性病变或CEA阴性腹膜组织中uPA、uPAR和PAI-1蛋白含量显著升高(P（P）< 0.05). 值得注意的是，腹膜转移患者CEA阴性腹膜组织中uPA系统蛋白含量增加可能具有更大的临床意义。这一发现表明，这些CEA阴性的腹膜组织可能处于亚临床腹膜转移状态，这种疾病的进展可能导致腹膜转移。虽然腹膜组织中uPA系统的变化在肿瘤细胞中尚未明确显示，但腹膜组织的变化至少为腹膜转移的诊断提供了参考价值[26]. 海斯等. [27]研究发现，与细胞角蛋白（CK18）相比，uPAR可以作为预测胃癌骨髓微转移的依赖性指标。在本研究中，腹膜转移患者CEA阴性腹膜组织中的uPAR蛋白含量也显著高于非腹膜转移病人CEA阴性的腹膜组织(P（P）< 0.05). 总之，我们认为uPAR和PAI-1在非腹膜转移患者腹膜组织中的表达增加可以作为腹膜转移的参考指标。
通过检测胃癌组织及其细胞外基质中uPA活性，Okusa等. [28]据报道，uPA活性较高与腹膜转移肿瘤和胃壁浸润较深的肿瘤显著相关。基质细胞产生的uPA可能调节癌细胞侵袭[29]. 然而，我们的结果表明，不同组织之间的uPA活性没有显著差异。这可能归因于uPA的动态活动，它似乎依赖于特定的细胞环境和所遇到的状态[30].
结论
我们的研究表明，uPA系统在腹膜转移患者的腹膜组织中的表达显著高于非腹膜转移的患者。这种表达差异可能为腹膜转移瘤的诊断提供参考。然而，本研究仍存在一些局限性。本研究纳入的病例数很少，主要是因为2010年7月至2010年12月期间，我院收治的腹膜转移患者很少。我们试图通过在本研究中包括组织（包括大网膜、骨盆腹膜和膈腹膜）来消除这个问题的影响。为了获得更清晰、更令人信服的结果，仍需对更多受试者进行进一步研究。
缩写
CEA：癌胚抗原；DMEM：Dulbecco改良Eagle培养基；ELISA：酶联免疫吸附试验；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；PCR：聚合酶链反应；RT：逆转录酶；逆转录聚合酶链反应；uPA：尿激酶型纤溶酶原激活物；uPAR：尿激酶型纤溶酶原激活物受体。
竞争性利益
作者声明，他们没有财务或非财务竞争利益。
作者的贡献
YD和ZZ设计了该研究，并与HZ和ZZhou进行了RT-PCR、ELISA和活性检测。YD、MZ和XW参与了序列比对并起草了手稿。ZZ帮助进行了统计分析。所有作者阅读并批准了最终手稿。
致谢
我们感谢以下个人：陈雪华，他参与了序列比对并帮助准备了手稿。我们还感谢为本研究做出贡献的季玉宝、张毅和吕斌。
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