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化学生物多样性。作者手稿；PMC 2013年8月21日提供。
以最终编辑形式发布为：
化学生物多样性。2010年5月；7(5): 1065–1075.
数字对象标识：10.1002/cbdv.200900322
预防性维修识别码：PMC3748609
NIHMSID公司：NIHMS493614标准
PMID：20491064

用多标签焦磷酸测序法定量评价人体肠道微生物组

帕特里克·吉列夫特,通讯作者a） ，b） 马苏梅·西卡鲁迪,a） ，b） 阿里·克沙瓦尔齐安,c）和Ece A.Mutlu公司c）
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

分子技术的最新进展使深入研究人类微生物组成为可能，以更好地了解与宿主生物的相互作用及其在疾病中的作用。我们现在报告了使用长度异质性聚合酶链反应（LH-PCR）来调查样品的实用性，以及使用专利的多标记焦磷酸测序（MTPS）方法来检测健康和疾病状态下的肠道微生物组。我们对我们的研究进行了概述，证明这些分子生物学技术应用于炎症性肠病（IBD）等示例疾病状态。研究结果表明，有一种核心粘膜细菌微生物群（即粘膜生物膜）与健康中的管腔微生物群不同，并且在IBD中，粘膜微生物群似乎是生物失调的。我们认为，粘膜微生物组与宿主免疫系统形成协同稳定的相互作用，而管腔微生物组因饮食或其他环境因素而异。我们将这种由人类微生物群和人类宿主组成的复合生态系统定义为人类代谢生物群。

介绍

最近的研究强调了肠道微生物群/微生物组在几种疾病发病机制中的重要性，包括肥胖、全身和肠道炎症疾病以及癌症等。哺乳动物肠道是最丰富、最复杂的微生物群落之一。分子技术的最新进展使我们能够全面检测肠道微生物组并更好地了解其在慢性疾病中的作用。还不清楚粪便样本是否是检测微生物群落以确定微生物群落临床相关变化（即失调）的最佳介质。我们现在报告了长度异质性聚合酶链反应（LH-PCR）以及专利的多标记焦磷酸测序（MTPS）方法的实用性[1]检查健康和疾病状态下的肠道微生物组。

分子方法学的使用现在使人们能够研究整个肠道微生物组，包括未培养的物种，据估计，这些物种至少含有400到1000种细菌[2]. 随着NextGen测序方法的出现[三]我们可以详尽地分析样本中的16S核糖体RNA基因（16S rRNA），以系统发育地表征任何生态系统中的微生物群[4]. 这种特定微生物群的系统发育特征可以被认为是确定该生态系统功能的替代物[5]因为每个分类群都有其特有的代谢特征。一个关键问题是，微生物群特征描述中使用的方法是否忠实地再现了群落组成，而不是由于实验动力学偏差而扭曲了群落组成[6]或对工件排序[7].

我们对我们的研究进行了概述，证明LH-PCR既可用作质量保证测试来滴定社区DNA，以确保分析中没有动力学偏差，也可用作选择感兴趣样品的初步筛选方法。我们还提出了一种专有的多标签高温测序（MTPS）方法[1]这允许在一台仪器中分析数十个样本，而不会通过结扎伪影扭曲社区概况。最后，我们举例说明了LH-PCR在炎症性肠病（IBD）患者中的应用，并介绍了我们的初步研究，研究表明存在一种不同于内腔微生物组的粘膜微生物组，并且这两个分区之间的群落组成变化（生物失调）与疾病状态相关。IBD被选为一种典型的疾病状态，因为：（1）IBD是一种常见的、终身的、复发的疾病，没有已知的病因或治愈方法，在发达社会的发病率越来越高[8–10]; （2） IBD似乎是由胃肠道微生物抗原的异常炎症反应引起的[11]; （3） IBD的实验模型表明，无论导致疾病易感性的遗传缺陷类型如何，疾病发展都绝对需要细菌定植[12,13]. 这表明细菌在溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）发病机制中起着核心作用；（4） 许多临床事实也支持细菌在疾病发病机制中的中心作用。例如，通过元素饮食、抗生素或益生菌改变粪便微生物群对IBD的治疗是有益的。

结果和讨论

LH-PCR指纹图谱通过扩增微生物群落16S rRNA基因的可变区域，并根据扩增子长度和碱基组成的自然变化，使用毛细管电泳分离聚合酶链反应（PCR）产物来表征群落中的生物体。我们通常使用27F和355R通用细菌引物扩增16S rRNA基因的前两个可变区域，并使用几个10倍稀释的社区DNA进行三重分析。图1描述了已滴定的粘膜微生物组样品的三次分析，以优化社区概况。然后，我们利用这些条件，用标记的融合引物为MTPS过程扩增群落（见下文）。除非对样本中的DNA进行滴定，否则无法确保所得到的序列分析确实代表了群落组成。

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人类粘膜微生物组样品的三重LH-PCR分析证明了该技术的重复性

从SCE 9610荧光DNA测序器复制色谱剖面，如三个面板所示。相对荧光（y轴）根据插入的扩增子片段大小绘制。

LH-PCR图谱中的峰面积与群落中该扩增子的丰度成正比，但由于各种细菌分类群具有不同数量的rRNA操纵子，这一事实变得复杂。还应注意的是，在这些群落剖面中，可能有一个以上的物种/属在相同的扩增子大小内，因此LH-PCR指纹中的峰值可能实际上监测了一个以上物种/属的动态。然而，LH-PCR已成功用于评估浮游细菌的多样性[6]评估该方法稳健性的研究发现，该方法具有很高的重现性[14–16]. LH-PCR指纹分析方法价格低廉，速度快，每天可以筛选数百个样本。因此，我们通常使用它来滴定微生物组样品中的DNA，监测群落的动态，并快速识别感兴趣的样品。

疾病状态下使用LH-PCR对粘膜微生物组的实例调查

我们对健康对照组（HC）、克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）患者的粘膜活检进行了LH-PCR。我们将LH-PCR指纹中的峰定义为操作分类单元（OTU），因为它们是细菌群的间接指示物。我们将归一化OTU丰度绘制为主坐标分析（PCO）散点图(图2). 可以看出，PCO聚类确实将许多CD和UC样本彼此分离，并将它们与健康对照组分离。

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IBD患者粘膜微生物组样本分类群丰度的PCO分析

IBD和对照组粘膜和管腔样品的归一化分类群丰度绘制为散点图。三角形代表健康对照组粘膜和管腔样本，正方形代表克罗恩病粘膜和管腔内样本，圆圈代表溃疡性结肠炎粘膜和管状样本。

我们之前的观察结果[17]和其他人的[18]已经表明，个体之间粘膜微生物组的次要成分有相当大的差异，但正常个体之间的主要成分相似，这表明存在一个核心微生物组，并且我们观察到这些主要成分与疾病相关。因此，我们假设粘膜微生物组的主要成分在简单的质量基础上促成了人类代谢生物群的大部分交互功能。次要成分也可能有助于代谢生物功能和疾病，尤其是当考虑炎症级联时，但我们在IBD中的观察结果可以证明主要成分的作用。

一定比例的IBD样本具有失调的微生物群，导致与对照组分离的微生物群明显聚集(图2). 与对照组相比，IBD受试者的微生物群与对照组的主要差异似乎是因为IBD患者的粘膜微生物群（或粘膜相关微生物群）和管腔细菌之间失去了区别。有趣的是，CD和UC患者的样本之间存在显著重叠。目前尚不清楚这是否是由于疾病模式的变化，或者LH-PCR方法的模糊性是否是完全分离疾病亚型的限制因素。另一种可能的解释是，可能存在一种生物失调模式，反映慢性炎症叠加在特定疾病的生物失调模式上。

IBD和健康受试者肠道微生物组的克隆和测序

我们还克隆并测序了UC、CD和HC的混合样本。表一显示了至少占水池总丰度2%的细菌。当在RDP phylotype level 4下检查数据时[19]结果表明，在CD和UC标本的粘膜表面发现的细菌菌群与健康人的内腔细菌菌群组成相似。因此，健康人粘膜的微生物群组成与疾病状态下的粘膜组成有很大不同。例如，肉毒杆菌和肠球菌群与UC粘膜表面有关，而噬细胞菌群I似乎与CD粘膜表面和粪便样本有关。这一观察的诊断和治疗意义有待进一步探讨[20].

用连接性引物扭曲群落组成

一些研究小组利用标准的罗氏焦磷酸测序方案来检测微生物组或进行宏基因组分析。目前的Roche焦磷酸测序协议涉及将20个碱基对连接体连接到乳液PCR过程所需的样品上。我们在GS-FLX运行中运行了几个重复样品，并确定这种连接过程扭曲了重复样品中各种成分的丰度。具体来说，我们使用标记的PCR引物来扩增重复微生物群落样品中的成分，按照罗氏的描述将乳液PCR适配器连接到这些样品上，并在连接前后在安捷伦生物分析仪系统上分析PCR扩增物，以量化样品。图3描述了直接结扎前（3A）和直接结扎后（3B）在生物分析仪上运行的微生物组样本，清楚地表明结扎步骤大大改变了扩增子的分布。具体来说，我们可以看到每个原始峰明显地分裂成至少两个峰，可能代表一个连接性和非连接性片段，但连接性碎片的比例取决于片段的大小和群落组成。注意，峰上的数字是面积量化，而不是碎片大小。这种差异连接效率可能是由于许多因素造成的，例如扩增子的内部结构或与群体中扩增子末端核苷酸相关的连接偏见。此外，许多序列读取是嵌合的，可能是截断PCR产物结扎的结果。

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结扎步骤前后的社区概况

图3A描绘了454个连接子结扎前的群落概况，而图3B描绘了结扎后的群落概况。

使用标记融合引物对控件进行多标记焦平测序

这种连接问题导致我们开发了一种新的专利工艺，我们构建了带有标记的融合引物，其中包含PCR目标（即16S rRNA）的特异序列、7碱基条形码和乳化PCR适配器。图4A描述了用标记的16S rRNA引物扩增的粘膜样品的LH-PCR图谱，以及图4B描述了使用标记的融合引物扩增的社区概况。可以看到，当标记的融合引物扩增时，标记引物产生的复杂群落模式移动了19 bp，并且剖面中每个峰的相对丰度保持不变。因此，使用标记的融合引物消除了连接步骤的需要，并且不会扭曲群落组成。

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使用标记引物（a）和标记融合引物（B）的LH-PCR

图4A描述了使用标记正向引物的微生物群落的LH-PCR图谱。图4B描述了使用带有454A连接子的标记融合引物的同一微生物群落的LH-PCR图谱。

我们最近使用正向和反向标记的融合引物（27F和355R通用16S rRNA引物）在8个粘膜样本上扩增了一式三份样本（即8个具有3个正向引物和3个反向引物的样本=48个样本），并在1/2的LR75平板上进行了MTPS热测序。该运行产生了133757次读取，平均读取长度为235个碱基（总计3144588个碱基），每个样本的平均读取次数为2786次。

我们使用自定义PERL脚本搜索RDP8.1数据库来识别样本中的分类群，并选择最高的位分数来识别细分级别（级别4）的组件分类群。然后，我们列举并标准化了每个样本中分类群的丰度。在无症状健康对照组中，我们将重复数据表示为分类群丰度大于1%的条形图(图5). 橙色条代表双歧杆菌，黄色条代表细菌，蓝色条代表厚壁菌门，红色条代表Enterics，最后三次复制中的深绿色代表Steptocucus的丰度。显然，复制品相当好，除一个受试者外，所有受试者的微生物组分都相似，表明人类存在核心粘膜微生物组。值得注意的是，粘膜微生物组的可变成分占总微生物组的10%至30%(图5).

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健康对照的多标签焦平测序

图5描绘了Healthy Control微生物组群样本复制品中分类群丰度的堆叠直方图。该分类群使用RDP8分类层次的第4级进行识别。微生物组样品标记在x轴上，归一化丰度绘制在y轴上。颜色代码在图右侧的插图中定义。

最后一名受试者为健康男性，但他的微生物群明显代表“变异表型”。这种变异的原因尚不清楚，因为受试者没有报告任何饮食限制或出现任何临床疾病症状。因此，我们得出结论，大多数人都有核心粘膜微生物群，但也有无症状或实际上完全健康的“变异表型”。

我们证明了使用长度异质性PCR（LH-PCR）作为初步筛选方法来选择感兴趣的微生物样品的实用性，并描述了一种专有的多标签焦测序方法[1]这允许在一台仪器中分析数十个样本，而不会通过结扎伪影扭曲社区概况。数据表明，使用当前罗氏公司的社区分析研究可能需要重新评估。此外，使用罗氏公司销售的多重标识符（MID）试剂盒进行的宏基因组分析应谨慎对待，因为它使用连接步骤来连接乳液PCR连接器，并可能在分析中引入嵌合序列和连接偏差。

我们已经证明，没有必要对人类肠道微生物组样本进行详尽的测序，因为从一个样本中读取的几千个读数的特征足以将主要分类群与我们的示例疾病状态IBD关联起来[20]. 具体来说，对丰度大于1%的分类群的分析能够区分不同于管腔微生物组的粘膜微生物组，以及这两个分区之间的群落组成变化（失调）与克罗恩病和溃疡性结肠炎相关，但需要进一步实验来验证这些初步观察结果。然而，即使病例数量较多，也很难将罕见分类群与疾病类别关联起来，因为大多数统计分析将主要受丰富分类群的影响。一种方法是使用网络分析，这将允许罕见表型与疾病的相关性[21,22]尤其是在同一疾病类别的所有或大多数样本中都持续存在罕见特征的情况下。最后，有一种生态学观点认为，如果系统的生态（代谢）功能需要注意，次要成分实际上可能对免疫功能有更大的影响，那么微生物生物量的大部分会贡献给大部分。我们还将建议，作为人类微生物组项目的一部分，需要对人类肠道粘膜相关微生物组进行特征描述，因为许多当前项目仅侧重于粪便分析，而粪便甚至可能不代表人类代谢生物群的腔室。

实验部分

组织样本和受试者

我们对经IRB批准并获得知情同意后在三级医疗中心招募的93名UC患者（2名受试者20份样本）、CD患者（4名受试人38份样本）和健康对照组（4名被试者35份样本）的活检进行了LH-PCR。IBD被诊断为典型症状、典型内镜和组织学特征。非甾体抗炎药患者或过去1个月内服用抗生素的受试者被排除在外。HC由接受结肠镜检查以进行癌症筛查的患者组成。在使用4L聚乙二醇或舰队的磷酸钠制剂后，使用奥林巴斯视频结肠镜（奥林巴斯美国公司，宾夕法尼亚州中央山谷）进行结肠镜检查。结肠镜检查时，使用2.2mm标准活检钳从回肠末端最后10cm（回肠或I）、升结肠盲肠10-15cm范围内（右结肠或RC）、横结肠镜插入中点（横结肠或TC）、，位于乙状结肠肛门边缘20–25 cm处（左结肠或LC）和结肠远端10 cm处（直肠或R）。还收集粪便样品（内腔样品或L）。所有样本在内窥镜检查套件中的液氮中采集时立即快速冷冻，并储存在−70°C的冷冻柜中。

我们对来自8名健康人的8个乙状结肠活检样本进行了MTPS检查，这些样本是在有限的无盖软乙状结肠镜检查过程中用2.2mm标准活检钳从肛门边缘20–25cm处获得的。

LH-PCR指纹分析

使用魁北克省蒙特利尔市Qbiogene公司的Bio101试剂盒从样品中提取总基因组DNA。使用荧光标记的正向引物27F（5′-[6FAM]AGAGTTGATCCTGCTCA G-3′）和未标记的反向引物355R′（5′-GCTGCTCCCGTAGGAGT-3′）通过PCR扩增提取的DNA（10 ng）。两种引物均为细菌通用引物[23]. 使用最终体积为20μl的试剂进行反应，其中包括1 X PCR缓冲液、1.5 mM MgCl2、0.2 mM每个脱氧核苷三磷酸、0.2 uM每个引物和2 U Taq DNA聚合酶。初始变性步骤为95°C 11分钟，然后是35个循环，包括95°C变性30秒，48°C退火30秒，72°C延伸2分钟，最后延伸步骤为72°C 20分钟。通过琼脂糖凝胶电泳定量LH-PCR扩增效率。

根据琼脂糖凝胶上溴化乙锭染色显示的强度对LH-PCR产物进行稀释，并与ILS-600尺寸标准品（Promega）和HiDi甲酰胺（ABI）混合。稀释后的样品在SCE9610毛细管荧光测序仪（宾夕法尼亚州州立大学Spectrumedix LLC）上分离，并使用GenoSpectrum™软件包（2.01版）进行分析，该软件包将荧光数据反褶积到电泳图中。电泳图的峰代表不同长度的PCR扩增产物，碱基对（bp）代表微生物群的不同分组或OTU。所有LH-PCR指纹数据均使用自定义PERL脚本（Interleave 1.0，BioSpherex LLC）进行分析，该脚本结合了多个运行的数据，交错了各种剖面，对数据进行了标准化，计算了疾病状态下每个扩增子大小的平均值（即IBD和对照样品的平均值），并确定了多样性指数。通过将单个峰面积除以该剖面中的总峰面积，计算归一化峰面积（丰度比例）。然后根据后一分析，选择具有最高多样性的样本子集进行克隆和测序。

克隆和测序

使用TopoTA克隆试剂盒（Invitrogen）克隆使用未标记的27F和355R引物产生的PCR扩增子。使用X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-半乳糖基）和IPTG（异丙基-B-D硫代吡喃半乳糖苷）的α补体筛选克隆插入物。阳性克隆进行LH-PCR指纹分析，并选择与群落中不同PCR峰相对应的克隆。这些克隆通过使用Big Dye终止剂化学进行测序，并在SCE9610测序器上运行。使用自定义PERL脚本CloneID 1.0（弗吉尼亚州斯特林BioSpherex LLC）将克隆序列与RDP 8数据库中的序列进行比较。该算法使用Megablast将克隆序列数据与RDP数据库进行比较，并使用RDP编号编译一个表，以关联RDP分级分类方案中的物种识别。此自定义PERL脚本使用从Megablast搜索结果中获得的相应RDP编号注释每个克隆，然后使用该编号对每个克隆的科/属/种进行分类。使用RDP网站上的贝叶斯图书馆比较程序对图书馆进行比较(http://rdp.cme.msu.edu/).

多标签焦平测序

我们使用标记的融合引物，在上述LH-PCR分析标准化的条件下扩增社区样本。使用Ampure磁珠溶液（Agencourt Bioscience Corp.）对标记样本进行纯化，汇集并在Roche GS-FLX仪器上进行火序列测定。使用自定义PERL脚本根据标记对过滤的读取进行排序，并如上所述进行分析。

PCO分析

通过LH-PCR扩增子标准化丰度的直方图确定与疾病存在相关的LH-PCR指纹模式（即存在或不存在某些扩增子峰）。主成分分析（PCO）用于使用MVSP分析LH-PCR模式（英国威尔士科瓦奇）

​

表1

炎症性肠病中粘膜和内脏微生物组的类群丰度

该表描述了健康对照组、克罗恩病患者和溃疡性结肠炎（UC）患者微生物群中各种分类群的标准化丰度。分类群鉴定基于核糖体数据库第8版第3级。

RDP集团控制粘膜控制流明Crohns粘膜克罗恩斯·卢门UC粘膜UC流明
细菌_组0.380.190.07
类杆菌群0.08
比例制动器_组0.06
CLOSTRIDIUM_COCCOIDES_组0.09
伪域名_和_相关0.10
伪域名_和_相关0.410.290.150.100.30
ACIDOVORAX_集团0.140.130.120.120.14
ACIDOVORAX_集团0.150.290.230.390.19
CYTOPHAGA组_I0.090.080.11
CLOSTRIDIUM_BOTULINUM_组0.06
ENTEROCOCCUS_GROUP公司0.06

致谢

该研究得到了NIH拨款RO-1 AA 013745（给AK）的支持；R 21 DK071838（至EM）；R21 AT001628（至EM）；和SBIR 1R43DK074275（至PMG）。

工具书类

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