介绍
越来越多的文献表明，星形胶质细胞不仅为神经元提供代谢支持(Magistretti等人，1999年,Rouach等人，2008年,Halassa等人，2010年,Allaman等人，2011年)而且还能够钙依赖性合成血管扩张剂和血管收缩剂（血管活性“神经递质”）(Volterra和Meldolesi，2005年). 因此，星形胶质细胞可能在微血管直径的局部调节以及随之而来的神经活动变化的血流变化中发挥作用（有关综述，请参阅Iadecola和Nedergaard，2007年,Agulhon等人，2008年,Koehler等人，2009年,Nimmerjahn，2009年,Attwell等人，2010年,Paulson等人，2010年,Petzold和Murthy，2011年). 在脑切片中，星形细胞内钙的增加会导致嵌入的小动脉段缓慢扩张或收缩(Simard等人，2003年,Zonta等人，2003年,Gordon等人，2008年). 还观察到星形细胞钙的短暂增加体内在大脑皮层的各个部位-躯体感觉、视觉和嗅觉-对适当的感觉刺激或自主运动的反应(Wang等人，2006年,Dombeck等人，2007年,Petzold等人，2008年,Schummers等人，2008年,Thrane等人，2012年). 然而，目前尚不清楚星形细胞钙的增加是否是功能性充血开始的必要条件体内以及它的发作是否先于血管舒张的发作，正如如果前者触发后者所预期的那样。
在本研究中，我们利用1,4,5-三磷酸肌醇（IP三)缺乏星形细胞钙增加主要机制的2型受体（R2）敲除（KO）小鼠(Li等人，2005年,Petrovicz等人，2008年). 我们使用体内双光子显微镜用于平行成像初级体感皮层（SI）中神经胶质钙动力学和邻近小动脉直径变化，以响应短暂的感觉刺激。知识产权三R2-KO小鼠未表现出可检测到的钙信号，尽管它们确实表现出完整的刺激诱导的血管舒张作用，这表明神经血管偶联不需要升高星形细胞钙。
接下来，我们研究了野生型（WT）小鼠星形胶质细胞内钙增加与血管舒张之间的时间关系。我们的结果表明，星形细胞钙瞬变的开始可能太慢，无法解释血管舒张的开始。此外，虽然每次刺激试验都能持续观察到血管扩张和神经元钙增加，但延迟的星形胶质细胞钙增加仅在少数星形胶质细胞中检测到，在一些试验中偶尔会有反应。
目前的结果并不质疑星形胶质细胞拥有合成和释放具有血管活性物质的机制这一既定事实。相反，他们质疑了这样一种假设，即星形胶质细胞在健康大脑中作为神经血管耦合的介质，对短暂的感觉刺激作出反应，这是事件相关功能成像研究的相关条件。
结果
知识产权三缺乏IP的R2-KO小鼠三-星形胶质细胞钙升高的依赖机制具有正常的刺激性血管舒张作用
我们使用体内双光子显微镜对IP内SI前爪区神经胶质细胞钙活性的成像三R2-KO小鼠。钙指示剂OGB1和SR101用于标记神经元（OGB1）和星形胶质细胞（OGB1和SR101）(Stosiek等人，2003年,Nimmerjahn等人，2004年,Garaschuk等人，2006年). 与之前测试星形细胞IP的研究基本一致三-这种小鼠的依赖性钙信号(Petrovicz等人，2008年,Di Castro等人，2011年,Takata等人，2011年,Navarrete等人，2012年,Thrane等人，2012年)，我们观察到IP三R2-KO和WT受试者在由体内皮质内微量注射ATP和代谢型谷氨酸受体（mGluR）激动剂t-ACPD(). ATP（1米米)在三个皮层深度处出现：第一层，第一层和第二层之间的边界，以及第二层中的3 WT和3 IP三R2-KO受试者，前者产生一波星形细胞钙增加，后者无明显反应(A–D). WT结果与之前发布的结果一致体内小脑Bergman胶质细胞的观察(Hoogland等人，2009年)以及关于清醒小鼠皮层促细胞信号的最新报道(Thrane等人，2012年).
知识产权三R2-KO小鼠未表现出IP3介导的钙升高。A类，对1m微注射的响应示例米ATP在一名WT受试者的皮层表面下100μm处成像。左边是OGB1（绿色）、SR101（红色）和注射用微量吸管（蓝色）的合成图像。对，星形细胞ROI。比例尺，20μm。B类，从星形细胞ROI中提取的钙信号时间过程A类.C类，如中所示B类对于IP三R2-KO主题。每一条线代表一个星形细胞个体的时间进程。未显示合成图像和ROI。天，WT受试者星形细胞钙的起始值随着ATP的反应而增加，这是与注射吸管距离的函数。IP中的星形胶质细胞三R2-KO受试者没有表现出钙升高，也没有被标绘出来。E类，微注射10μ的示例响应米t-ACPD在WT受试者皮层表面下120μm处拍摄到图像：前3次吹气诱发的定时钙增加，随后出现不规则振荡。F类，如中所示E类对于IP三R2-KO主题。
类似地，WT而非IP三R2-KO受试者对10μ米t-ACPD。该药物应用于3名WT受试者（第一层1名，第二层2名）和4名IP受试者三R2-KO受试者（第一层2人，第二层2人）(E类,F类). 与我们在ATP方面的经验相比，我们必须将t-ACPD的应用限制在每个受试者的单一位置，因为安全地重新定位移液管需要施加正压，从而导致药物溢出。在WT受试者中，t-ACPD溢出导致不规则振荡，随后对连续吞咽的反应性迅速下降。例如，在E类，仅在对前三次抽吸的反应中观察到时间锁定的钙增加。先前观察到应用t-ACPD后的星形细胞钙振荡在体外(菲亚科和麦卡锡，2006年). 之前还描述了连续用药期间t-ACPD效率的降低在体外作者将其归因于细胞内钙储存的耗竭(杰菲和布朗，1994年). 这种快速且不可逆的效率下降可能解释了当前结果与最近关于t-ACPD在高浓度（100–500μ米)培养的星形胶质细胞不能诱导钙升高(Wang等人，2012年)或体内(Sun等人，2013年). 在IP中三R2-KO受试者，我们检测到单次吞咽后星形细胞钙无变化(F类)或使用持续低压1-2分钟故意溢出。此外，IP中的星形胶质细胞三R2-KO受试者在前爪刺激后，星形细胞胞体或血管周围末梢中没有出现可检测到的钙增加(n个=82个星形胶质细胞和34个末端脚，从I层顶部至表面以下210μm成像；数据未显示）。
接下来，我们询问IP是否缺乏星形细胞钙兴奋性三R2-KO小鼠对感觉刺激诱导的血管反应有影响。为了解决这个问题，我们测量了6名WT受试者和3名IP受试者的小动脉血管舒张功能三R2-KO受试者对前爪刺激的反应。从表面追踪血管内FITC标记的潜水小动脉。在每次实验结束时，通过获取高分辨率图像堆栈来验证成像血管的身份。A类显示了WT（顶部）和KO（底部）人群个体血管舒张时间进程的汇编。通过将一条线拟合到直径增加的上升斜率并计算与刺激前基线的截距来估计血管舒张的开始(Tian等人，2010年). 提取的起始和峰值分布(B类WT和KO种群（分别为实心圆和开放三角形）重叠。WT和KO结果之间没有统计学意义上的跨学科差异：在顶部550μm范围内，血管舒张开始于0.8±0.1和0.6±0.5秒，在WT和IP刺激开始后达到3.2±0.2和3±0.2秒的峰值三R2-KO种群。相对快速的扩张开始与我们和其他人最近的单血管成像研究一致(Tian等人，2010年,Drew等人，2011年,Schulz等人，2012年,沈等，2012).
知识产权三R2-KO小鼠出现正常的功能性充血。A类，WT和IP中小动脉直径变化的时间进程三R2-KO受试者（分别为顶部和底部面板）。覆盖每个类别的所有测量值。平均值叠加在每个面板上（粗线）。刺激开始由灰色垂直线表示。插入图中叠加了跨学科平均数，以便于进行时间比较；误差线表示平均值的95%置信区间。B类，WT（实心点）和IP中所有测量到的小动脉直径变化的发病率（顶部）和达到峰值的时间（底部）三R2-KO（开放三角形）受试者，摘自A类覆盖所有受试者的数据，并将其表示为皮层深度的函数。C类，比较表面小动脉的成对直径和速度测量值。直径（黑色）和速度（绿色）时间进程的跨主题平均值。首先，我们平均了一个科目中获得的所有时间课程。然后，在计算受试者的平均值之前，用峰值振幅对平均时间进程进行标准化；误差线表示受试者的SE。速度的增加先于直径的增加(第页< 0.01). 这种行为与分布血管网络的理论预期一致，当深层皮质层扩张最快时(Boas等人，2008年).天，同时测量直径和速度的示例。在左侧，扫描路径以红色叠加在表面微动脉的FITC图像上。沿着血管的扫描路径的一段用于根据时间叠加线中条纹的角度估计速度，在右上角用α表示（参见材料和方法）(Kleinfeld等人，1998年). 血管扫描路径的一段用于根据轮廓的膨胀计算膨胀（右上角的红色箭头）。相应的直径（黑色）和速度（绿色）时间过程显示在右下角。
为了证实小动脉直径增加表明脑血流量增加，我们对另外4名WT受试者的15条表面小动脉同时或连续进行了配对直径和红细胞速度测量（见材料和方法）。这些测量结果表明，小动脉直径的增加始终伴随着血流速度的增加(C类,天). 因此，直径的增加可以作为功能性充血的替代测量。
总之，这些结果表明，IP正常功能性充血不需要星形细胞钙的升高三R2-KO小鼠。
星形胶质细胞在出现强烈的神经元反应和血管舒张时可能会出现零星的钙增加
建立IP后三R2-KO小鼠表现出正常的功能性充血，我们进一步研究了WT小鼠细胞内钙的星形胶质细胞增加与前爪刺激引起的血管舒张之间的关系。与我们之前对大鼠的研究类似(Devor等人，2008年,Tian等人，2010年)，这种刺激引发了可重复的扩张()，这被用作解决问题的参考：考虑到扩张，我们能检测到之前的星形细胞钙增加吗？我们对6名WT受试者的不同深度的神经胶质钙活性和小动脉血管舒张进行了同步成像：从第一层顶部到表面以下410μm。142例FOV中包含潜水小动脉，113例FOVs中毛细血管距离小动脉>100μm。另外6名WT受试者仅用于钙成像。
在10次刺激试验中，每个视野包括一个或多个星形细胞细胞体，连续成像约260秒。刺激开始后6s内星形细胞内钙显著增加（>2SD，见材料和方法），被认为是刺激诱导的“星形细胞钙反应”。在12名受试者的表面（第一层顶部）共619个星形细胞成像中表面以下410μm(安德森等人，2009年)]大多数（90±3%）在任何刺激试验的6s时间窗内均未表现出星形胶质细胞钙反应，尽管存在强烈的神经元反应和血管扩张。图中显示了一个小动脉穿过成像平面和一个血管周围星形胶质细胞的FOV示例.小动脉(A类，“v”代表“血管”）通过血管内注射FITC标记。从星形细胞ROI中提取的信号时间过程(A类，“a1”）对任何刺激试验均无反应(B类，红色痕迹）。相反，在神经元细胞体中观察到明显的钙增加(B类，“n1”到“n3”，绿色痕迹）。神经膜中也检测到大量钙增加(B类，底部绿色痕迹）。
在没有星形细胞钙反应的情况下观察到小动脉扩张。A类，典型的FOV包括标记有SR101/OGB1的血管周围星形胶质细胞，通过血管内注射FITC标记的潜水小动脉，以及标记有OGB1的许多神经元细胞体，在皮质表面以下150μm处成像。用于提取时间进程的ROI显示在右侧。B类，从ROI中提取的时间进程，如所示A类星形细胞（红色）和神经元（绿色）钙信号变化用ΔF/F表示。血管舒张用相对于基线直径Δd/d的直径变化百分比表示。直径变化是从FITC-标记的血管内管腔扩张中提取的，用“v”表示A类黑色条表示刺激持续时间。C类，比率图像显示神经元信号变化和血管舒张（黑色箭头）对第一次刺激试验的反应。覆盖ROI轮廓。每个图像都是五个连续比率帧的平均值。相对于刺激开始的对应时间窗口（以秒为单位）在图像上方指示。注意连续图像之间的0.5秒间隙。比例尺：A类,C类，10微米。天，FOV上部的“原始”试验平均图像，说明相对于预刺激基线（顶部，红色虚线）在峰值扩张（底部）期间FITC-标记横截面的扩张。显示绿色通道。E类，从单个神经元细胞体提取的钙信号时间过程的典型示例（黑色痕迹；标记为“n1”inB类). 钙信号的变化表示为ΔF/F。数据的计算拟合用红色覆盖。拟合过程假设为τ=0.8 s的卷积核。底部的黑色条表示刺激持续时间。一般来说，神经元对刺激序列中6个电脉冲的每一个都会产生1-2个尖峰。
每次刺激试验后小动脉直径增加(B类，黑色痕迹）。在比率图像中还可以看到小动脉扩张和神经元反应时星形胶质细胞钙缺乏增加，这说明了第一次刺激试验中相对于刺激前基线（ΔF/F，见材料和方法）的荧光百分比变化(C类). 比率图像中的小动脉扩张呈亮环，表明FITC-标记的血管内管腔扩张。位于扩张环外的星形细胞ROI内的信号（见覆盖在比率图像上的ROI轮廓）保持在基线。相同的膨胀如图所示天通过比较“原始”图像：在预刺激基线（顶部）和在峰值膨胀期间（底部）。扩张表现为血管内横截面相对于红色虚线所示基线直径的扩张。
在足够高的浓度下，钙指示剂的存在可以减缓钙的上升动力学并减弱响应幅度。为了控制这种对星形胶质细胞和神经元都适用的有害影响，我们使用既定程序估计了神经元钙衰减的时间常数(Göbel和Helmchen，2007年). 与先前从双光子钙成像数据估计神经元峰值的研究一致，从细胞体ROI提取的神经元钙瞬变以0.5–0.9 s的时间常数衰减(E类). 因此，我们的测量是在细胞内OGB1浓度范围内进行的，其中指示分子的存在不会显著改变细胞钙动力学。
皮层边界由深度定义(安德森等人，2009年). 在II/III层（100–320μm），13±4%的星形胶质细胞对至少一次刺激试验有反应。这与第一层（<100μm）和第四层（320-410μm）形成对比，其中只有少数星形胶质细胞表现出钙反应：第一层有2个细胞（166个），第四层有3个细胞（94个）。总之，这些数字相当于对至少一次刺激试验作出反应的整个619人中的约7%的星形胶质细胞。我们收集的最有反应的病例在一些连续试验中显示星形胶质细胞钙升高，与之前公布的结果类似(Wang等人，2006年,Wang等人，2009年,Thrane等人，2012年) (B类). 然而，大多数有反应的星形胶质细胞仅对少数试验偶尔作出反应：平均每10次试验中有2次。显示了一个例子，在FOV中的3个星形胶质细胞中，有2个实验观察到钙增加(A类，“a1”）。在年的一些试验中，在星形细胞的时间进程中可以看到小幅度的“尖峰”，即锁定于刺激开始的时间B类，表示与神经膜信号的残余串扰（参见材料和方法，星形胶质细胞和神经膜信号分离）。为了更直观地说明这种效应，我们计算了神经元反应期间的一系列试验平均比率图像(C类). 虽然星形细胞ROI比周围的神经膜暗，但随着神经膜中信号的增加，它们的外边界变亮。这与试验2和9中的反应形成对比（图中的红色箭头B类)信号的增加明显局限于星形细胞ROI。如图所示天通过与试验9相对应的一系列比率图像。这些图像按时间间隔排列（图像上方显示时间），以优化缓慢星形细胞钙动力学的可视化。与星形胶质细胞相比，所有神经元细胞体和神经膜对每次刺激试验都有可靠的反应，钙含量增加(B类,C类).
星形胶质细胞对个体刺激试验偶尔表现出钙反应。A类例FOV位于小动脉分支点下方20μm处，包括三个星形细胞ROI，在皮质表面下方200μm处成像。未出现血管内FITC。B类，从星形细胞和神经元ROI提取的时间进程如所示A类红色箭头表示在10个刺激试验中的2个试验中，其中一个ROI（a1）中的钙增加。C类，神经元反应期间刺激开始后前1.8秒的试验平均比率图像。每个图像是两个连续帧的平均值。连续图像之间的强度波动反映了神经细胞膜和神经元细胞体对重复刺激（6个3 Hz的单独刺激）的响应在时间上采样不足的“闪光”。ROI轮廓A类被覆盖。图像上方显示了与刺激开始相关的相应时间窗口（以秒为单位）。天，第九次刺激试验的比率图像，其特征在于标记为a1的星形细胞ROI中的钙反应。与刺激开始相关的时间（以秒为单位）显示在图像上方。注意连续图像之间的1s间隙。比例尺：A类,C类,天，10微米。
接下来，我们检查了反应性星形胶质细胞（即对至少一次刺激试验作出反应的星形胶质细胞）相对于靶血管的几何位置是否独特。根据已发表的解剖数据，我们假设小鼠皮层中单个星形胶质细胞（“星形细胞域”）的突起距离细胞体约50μm(Halassa等人，2007年). 利用这个假设，我们将FOV中成像的星形胶质细胞分为潜水小动脉(n个=142 FOV）进入小动脉50μm范围内的细胞体(A类)以及那些细胞体距离>50μm的细胞，可能与毛细血管或小静脉接触(B类). 毛细血管床内FOV的所有星形胶质细胞(n个=113 FOV）被分配到>50μm类别。平均而言，对至少一次刺激试验有反应的星形胶质细胞在小动脉附近（16±6%）比在50μm以外（7±4%）更常见。然而，受试者之间的差异在统计学上并不显著。这两种类型的星形胶质细胞钙反应的时间进程没有显著差异，尽管小动脉附近的钙反应表现出发病较早、峰值较早和持续时间较短的小趋势(C类).
星形细胞反应动力学与小动脉距离的关系。A类,B类，重叠所有试验的时间进程，有明显的星形细胞信号改变，在受试者之间汇集，按与潜水小动脉的距离排序：在(A类)和外部(B类)半径为50μm。C类，受试者之间两种距离类别的星形细胞反应动力学的统计比较：<50μm（红色）和>50μm的（蓝色）。曲线显示了跨主题平均值；误差条指示SE。
星形细胞钙反应的开始可能滞后于血管舒张的开始
单个星形胶质细胞中零星出现的钙反应本身并不排除它们参与触发血管舒张。原则上，沿着靶小动脉从少数细胞释放钙依赖性的神经递质可能足以引发扩张。然而，如果星形胶质细胞通过需要增加胞浆钙的细胞内途径触发血管舒张，则星形胶质细胞钙反应的开始必须先于血管舒张反应。为了测试这种时间关系，我们比较了星形细胞钙增加和小动脉扩张的时间进程().
相对于小动脉扩张，星形细胞钙增加延迟。A类，重叠了所有有明显星形细胞信号改变的试验的时间进程，将具有（左）和不具有（右）血管内FITC的受试者合并，用于同时测量血管舒张。B类所有测量的星形细胞钙反应（红色）和小动脉直径变化（黑色）的开始时间（顶部）和峰值时间（底部）。所有受试者的数据都被覆盖，并作为皮层深度的函数表示。开口正方形和实心点分别对应于同时（st）和独立（sa）测量。包括同时测量的直径，无论是否存在星形细胞钙反应。C类、星形细胞钙变化的时间进程（顶部）和小动脉直径变化的时间历程（底部）。平均值叠加在每个面板上（粗线）。刺激开始由灰色垂直线表示。峰值归一化平均值叠加在插图中，以便于进行时间比较。
因为我们的测量表明，在每个个体受试者中，只有一小部分星形胶质细胞表现出钙反应，所以我们收集了所有反应性刺激试验——跨星形胶质细胞和受试者进行定量分析。A类显示了分别针对血管内FITC用于同时测量扩张的受试者的反应性试验中星形细胞钙时间进程的汇编(n个=6名受试者，左侧面板），无FITC(n个=6名受试者，右侧面板）。这两个类别的平均时程重叠(A类（插图）和数据汇集在一起进行定量分析，包括来自31个细胞体ROI的73个试验和来自5个末端ROI的15个试验。对于每个有反应的试验，我们通过将一条线拟合到信号的上升斜率并计算与刺激前基线的截距来估计发作(Tian等人，2010年). 持续时间估计为半最大振幅（FWHM）下的响应全宽。平均而言，星形胶质细胞钙升高的开始和峰值从刺激开始时分别延迟3.6±1.2和8.1±3.3秒。这些钙增加的幅度为16.8±10.8%（ΔF/F），持续时间为6.6±4.1 s（所有反应性试验的平均值±SD）。我们数据集中所有反应性刺激试验的星形细胞起始值和时间-峰值如所示B类（分别为顶部和底部）作为皮层深度的函数（红色开方格：FITC受试者；红色实心圆点：不带FITC的受试者）。3.6秒的起效时间与最近报道的清醒小鼠胡须刺激起效时间（～3.5秒）非常一致，并且比同一研究中在其他类型麻醉下观察到的起效速度更快（氯胺酮/噻嗪、异氟醚或氨基甲酸乙酯下为～5.7秒）(Thrane等人，2012年)表明α-氯醛糖对星形细胞钙动力学的抑制作用较小。
血管舒张的开始与星形细胞钙反应的开始是以相同的方式估计的：通过对直径增加的上升斜率拟合一条直线，并计算与刺激前基线的截距(Tian等人，2010年). 提取的血管值如所示B类（黑色符号）。同时测量的直径(B类，黑色开方格）包括在内，无论是否存在星形细胞钙反应。WT小鼠在没有额外荧光团（OGB1和SR101）的情况下独立小动脉直径测量的起始值和峰值的叠加(B类，黑色实心圆点）证实，与钙成像同时获得的血管测量动力学数据代表了相应深度类别的小动脉。相同的独立小动脉直径数据用实心黑点表示.
星形细胞发病时间的分布B类高于扩张，表明星形细胞钙的增加滞后于所考虑的皮层深度扩张的开始。星形细胞动力学和扩张动力学之间的差异进一步说明于C类，它比较了星形细胞反应时间进程的总体池（结合了A类)血管舒张（合并的同时数据和独立数据）。平均而言，星形细胞钙反应的开始与扩张的开始相比延迟了2秒以上：星形细胞和血管开始分别为3.6±1.2和0.7±0.4秒（所有测量的平均值±SD）。同样，星形细胞钙反应的峰值时间相对于扩张时间延迟（所有测量值的平均值±SD分别为8.1±3.3和3.3±0.7 s）。
星形细胞钙瞬变的亚细胞室特异性：血管周围终末和精细星形细胞过程
据报道，星形细胞血管周围终末钙升高的开始，体内，可以先于细胞体中的(Wang等人，2006年). 因此，我们检查了43例（来自WT人群）星形细胞体在同一成像平面（在同一视野内）具有连接端足的病例。其中，35例在细胞体或末端足室中均未检测到钙升高，而3例在细胞体内但在末端足室没有钙升高。在剩下的5例患者中，两个腔室均显示出增加，其中3例末梢钙反应先于体部钙反应。其中之一如所示A–D这里，身体和脚端(A类，“a1”和“EF”）对第七次刺激试验的反应是大幅度的钙增加(B类，红色箭头指向尾端响应）。如中所示，一些刺激试验开始时的小幅度“尖峰”反映了与神经纤维信号的残余交互作用（见材料和方法，星形胶质细胞和神经纤维信号分离）。这可以从神经元反应期间的试验平均比率图像中看到，其中星形细胞ROI比周围的神经膜暗(C类). 年第七次刺激试验的比率图像天结果表明，钙的增加不仅发生在躯体和足尾，也发生在躯体周围的精细星形细胞突起中天到中的SR101图像A类除了高振幅响应外，在前3次刺激试验中，在端足中观察到了小振幅趋势（黑色箭头）。这些趋势没有超过检测星形细胞反应的2 SD阈值（见材料和方法）。这些趋势与高振幅端足响应的叠加E类建议采取类似措施。所有检测到的端脚响应(n个=15次试验，5个端脚）F类。相对于同一深度类别（180–300μm，黑色痕迹）的平均扩张开始时间，足底钙增加的开始时间延迟：分别为2.6±0.6和0.8±0.3秒（所有时间段的平均±SD）。相同的端脚响应包含在<50μm类别中在检测到的所有星形细胞反应中.
星形细胞终末钙的增加滞后于扩张的开始。A类，一个包含两个星形胶质细胞的示例FOV，一个（a1）具有连接的端足（EF），在皮质表面下260μm处成像。B类，从ROI中提取的时间进程如所示A类红色箭头表示在第七次刺激试验后，末梢的钙增加。C类，神经元反应期间刺激开始后的前～2.5秒的试验平均比率图像。每个图像是两个连续帧的平均值。ROI轮廓A类被覆盖。图像上方显示了与刺激开始相关的相应时间窗口（以秒为单位）。注意连续图像之间的1秒间隔。天，第七次刺激试验的比率图像。覆盖ROI轮廓。每个图像都是作为10个连续比率帧的平均值进行计算的。图像上方显示了与刺激开始相关的相应时间窗口。注意连续图像之间的1s间隙。比例尺：A类,C类,天，10微米。E类，细胞体（a1，黑色）和连接端足（EF，红色）中星形细胞钙变化的重叠时间过程。F类，覆盖所有响应端脚测试。平均值显示为厚红色。来自同一深度类别（180–300μm）的平均膨胀时间过程，归一化为钙记录道的最大振幅，叠加在厚黑色中。
星形细胞过程中细胞内钙的增加，在天支持我们检测亚细胞瞬变的能力。然而，OGB1对体积中所有细胞的非特异性标记在从精细星形细胞分支中分离钙信号方面提出了挑战。此外，星形细胞胞体可能是多孔的，包含神经元突起，因此在某些情况下，需要从星形细胞ROI回归神经膜信号（参见材料和方法，星形细胞和神经膜信号的分离）。因此，只要该指示剂存在于神经元和星形胶质细胞中，就不能完全排除存在神经白细胞样星形胶质细胞钙动力学。特别是，假设星形胶质细胞钙升高幅度小于周围神经膜中的升高幅度，且动力学与神经膜中钙升高的动力学相同，可通过回归程序错误地从星形胶质细胞时间进程中删除。因此，我们在另外四名受试者中使用了Fluo-4局部负荷，目的是在局部负荷可达到的有限皮质深度范围内检查星形细胞钙动力学和星形细胞钙增加的亚细胞组织。局部负荷过程导致星形胶质细胞而非神经元摄取(Wang等人，2006年). 这些实验中的亚细胞ROI是通过为每次刺激试验计算的最大强度投影（MIP）图像阈值来定义的。注意选择没有自发活动的基线图像。除了星形胶质细胞胞体和血管周围终末的大幅度钙增加外，与OGB1观察到的钙增加类似，Fluo-4标记的星形胶质细胞表现出不与胞体共定位的片状钙增加(A类,B类). 与神经元和神经膜中的钙变化相比，这些钙变化较慢（来自OGB1数据，例如–)并且可能发生在细胞体中没有伴随的钙增加的情况下，这与最近在脑片制备中对海马星形胶质细胞进行的高分辨率研究一致(Di Castro等人，2011年). 由于我们测量的灵敏度和分辨率有限，我们没有试图解决单个亚细胞ROI内的一些钙升高是否可以被视为刺激所致。然而，在某些情况下（51个视野中的14个），我们可以通过平均视野内的所有像素（“视野反应”；C类，蓝色痕迹）。天比较Fluo-4场反应的时间进程与星形细胞体中钙增加的时间进程以及Fluo-3测量深度范围内的血管舒张。平均场响应的开始（14个FOV的平均值；天，蓝色痕迹）先于星形细胞胞体中的平均钙反应(天，红色痕迹），但落后于血管舒张(天，黑色痕迹）。
精细星形细胞树枝状结构中钙的增加滞后于扩张的开始。A类，用Fluo-4和SR101标记的示例FOV在皮层表面以下200μm处成像。B类，亚细胞ROI覆盖在Fluo-4比率图像的MIP图像上。计算3次刺激试验的时间序列的MIP图像。通过为单个刺激试验计算的MIP图像阈值来定义单个ROI。比例尺：英寸A类,B类，50微米。C类，从ROI中提取的钙信号时间过程如所示B类（红色迹线）和整个FOV（“Fluo-4字段”，蓝色迹线）。黑色条表示刺激持续时间。天，平均Fluo-4现场响应。来自同一深度类别（≤200μm）的星形细胞体ROI的平均扩张时间进程和钙反应分别以黑色和红色叠加。所有曲线均归一化为最大振幅。
讨论
总的来说，我们的结果表明：（1）IP患者正常的血管舒张反应不需要增加星形细胞钙三R2-KO小鼠；（2） 星形细胞胞体和血管周围终末的钙增加，是由神经元对短时感觉刺激的反应增加引起的，开始时速度太慢，无法启动血管扩张；（3）在少数星形胶质细胞中观察到星形胶质细胞钙升高，个别刺激试验偶尔有反应。这些发现挑战了星形胶质细胞通过钙依赖机制将局部神经元活动的增加传递给血管收缩元件的观点。特别是，星形细胞钙反应开始滞后于小动脉扩张的事件的时间顺序可能表明，血管扩张不能由星形细胞胞浆钙增加下游的任何过程触发。
亚细胞钙瞬变和容积负荷法的局限性
与SI中早期的观察结果一致(Wang等人，2006年)在某些情况下，血管周围终末的钙升高早于细胞体的钙升高。我们的Fluo-4数据进一步支持了星形细胞钙活性亚细胞组织的观点，表明星形细胞树状结构的局部增加与细胞体中的增加无关。然而，在Fluo-4数据中，血管周围终末钙的开始增加和场反应的开始滞后于血管舒张的开始。
在细胞培养中已经证明，在检测膜下局部钙升高方面，膜结合型遗传钙指示剂的性能优于细胞质染料（如OGB1和Fluo-4，本研究中使用了这两种染料）(Shigetomi等人，2010年a,b条,2012). 此技术的翻译体内正在开发中，但尚不可用。作为替代策略，我们使用IP三R2-KO小鼠(Li等人，2005年,Petrovicz等人，2008年)缺乏IP3依赖的星形细胞钙升高机制，但显示正常的血管舒张功能。这一发现与最近的一份报告一致，该报告表明阻断IP上游的mGluR 5型（mGluR5）三-细胞内钙的依赖性释放并不影响对短暂感觉刺激的血流动力学反应(Calcinaghi等人，2011年). 然而，我们不能排除潜在的IP三-星形细胞“微域”中独立快速钙的增加低于Fluo-4成像的检测能力。知识产权三-星形细胞培养中显示了由瞬时受体电位A1通道介导的独立钙流入(Shigetomi等人，2012年); 该机制的上下文相关性体内仍然是一个悬而未决的问题。
未来旨在提高双光子检测灵敏度和新型基因诱导钙指示剂靶向表达的技术发展可能会导致发现可能的快速亚细胞星形胶质细胞钙激增，从而及时释放血管活性神经递质体内然而，迄今为止，支持星形细胞在触发血管舒张中作用的假说的证据是基于当前可用的双光子钙成像技术检测到的钙信号，如本研究中使用的钙信号。我们的同步测量表明，这些星形细胞钙信号可能无法解释血管舒张的开始。
本研究的其他局限性
我们的实验是在有麻痹剂和全身麻醉的情况下进行的；后者已被证明调节星形细胞钙反应(Schummers等人，2008年,Nimmerjahn等人，2009年,Thrane等人，2012年). 虽然麻醉可以不同程度地影响星形胶质细胞的活动，但在我们的研究中观察到，存在强烈的小动脉血管扩张，星形胶质细胞钙反应延迟。因此，在我们的实验条件下，星形细胞钙的增加并不需要触发血管舒张。
双光子测量中的信噪比随深度降低可能是本研究中检测到的第四层星形细胞钙反应很少的原因。此外，由于没有对第五层和第六层进行采样，我们不能排除这些层中星形细胞钙反应更快的可能性。
