慢性丙型肝炎纤维化进展：HALT-C试验中的形态图像分析

摘要

肝纤维化的进展是慢性丙型肝炎导致肝硬化和失代偿性肝病的机制。因此，对于那些不适合抗病毒治疗的患者以及那些对抗病毒治疗没有持续病毒学反应（SVR）的患者，开发治疗方案的兴趣很高；这些患者仍有继续纤维化进展的风险，以及肝失代偿和肝细胞癌的临床后果(1-三). 由于慢性丙型肝炎需要几十年才能演变为肝硬化，甚至需要更长的时间才能发展为失代偿，证明抗病毒治疗对生存的益处需要进行持续时间很长的大型治疗试验；因此，在许多临床试验中，通过评估一个疗程前后的成对肝活检中的纤维化分期，已经可靠地证明了治疗的益处。

在大多数依赖肝活检来评估纤维化变化的研究中，使用了半定量评分系统，其严重程度范围有限，例如Metavir评分(4)以5分或Ishak得分(5)有七个阶段的纤维化。另一种替代半定量纤维化评分的方法是通过计算机辅助形态图像分析直接测量活检标本中的纤维化量。与依赖于纤维化的数量和位置以及由纤维化引起的结构畸变的半定量纤维化评分不同，形态计量学决定了标本中胶原组织的比例，而不管其位置如何，并提供了连续尺度的精确测量。在任何给定的半定量阶段中，可能存在广泛的胶原蛋白，并且在Metavir和Ishak阶段中存在相当大的重叠(6,7). 然而，准确的形态计量学研究需要具有足够大小的高质量、未粘连的肝活检标本，因为纤维组织在纤维性肝的小碎片标本中代表性不足。形态测量也会受到采样变化的影响(8)但当在一项充分有力的研究中用于显示治疗组之间的差异时，形态计量学有可能成为显示纤维化数量变化的最敏感手段(7).

尽管临床和组织学进展通常非常缓慢，但在之前的两次随机对照试验中测试的抗纤维化药物的形态计量学分析中，研究人员发现，在耐药慢性丙型肝炎患者中，纤维组织的实际数量快速增加。在一项对245名接受干扰素γ-1b或安慰剂治疗的晚期纤维化和肝硬化（Ishak 4-6期）患者的研究中，仅48周内肝活检的平均胶原蛋白含量就增加了58%(7). 同样，在一项过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂抗纤维化药物法格列扎尔与安慰剂对中度（Ishak 2-4期）肝硬化纤维化患者的试验中，52周内平均肝胶原含量增加了30%(9). 这种变化可能没有直接的临床意义，尤其是在基线纤维化相对较少的患者中，但检测这种变化的能力表明，在抗纤维化药物的临床试验中，形态计量学比组织学分期更有用。

丙型肝炎抗病毒长期抗肝硬化治疗（HALT-C）试验为评估慢性丙型肝炎和中晚期纤维化患者数年来肝纤维化变化的形态计量学提供了一个独特的机会。在该试验中，我们招募了1050名既往对聚乙二醇干扰素和利巴韦林无反应的代偿性肝病和桥接性纤维化或肝硬化患者。受试者被随机分配接受每周注射90μg聚乙二醇干扰素α-2a或3.5年内不接受治疗。在试验过程中，我们发现聚乙二醇干扰素治疗组和非治疗组在临床结局的发展或肝活检中从肝硬化纤维化到肝硬化的进展方面没有差异(10). 在本文中，我们报告了在基线检查时（随机分组前18个月）、随机分组后约18个月（研究第24个月）和随机分组后大约42个月（试验第48个月）获得的肝活检中纤维化的组织学和形态计量学分析结果。我们假设形态计量学图像分析将显示胶原蛋白含量随时间呈线性增加，并可能显示维持治疗对纤维化进展的影响，即使标准组织学评分没有。

患者和方法

HALT-C试验的设计和结果已报告(10,11). 为了有资格参加该试验，美国10家医疗中心的患者必须对之前的干扰素治疗无反应，并且必须在肝活检时患有桥接性纤维化或肝硬化。如果潜在参与者同时患有其他肝病、肝失代偿史或肝癌、干扰素治疗的禁忌症或任何其他可能影响其完成试验的医疗或精神状况，则将其排除在外。

2000年8月开始招募审判人员，2004年8月结束。最初，所有患者都接受了为期24周的导入期联合治疗，即全剂量聚乙二醇干扰素α-2a和利巴韦林。治疗20周后仍为病毒血症的患者（“导入无反应”）被随机分为不接受进一步治疗（对照组）或低剂量（90μg/周）聚乙二醇干干素（维持）未来3.5年(图1). 治疗20周后血清HCV RNA检测不到的患者被归类为有应答者，并继续接受全剂量聚乙二醇干扰素和利巴韦林共48周。那些在接受治疗（“突破性”）或完成48周治疗（“复发”）后发现有可检测的HCV RNA的患者有资格在接下来的3.5年内进行随机分组（“突破性/复发患者”）。在聚乙二醇干扰素和利巴韦林联合用药获得食品和药物管理局批准后，在试验外接受等效导入治疗的患者也被允许进入随机阶段（“快速患者”）。在1050名入选随机研究阶段的患者中，662名为无应答者，151名为突破/复发者，237名为表达患者。

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图1

HALT-C试验的设计，显示用于纤维化形态计量分析的三组患者的来源。引入无响应患者（蓝线）是那些在聚乙二醇干扰素/利巴韦林导入期保持病毒血症6个月的患者，然后随机分为维持聚乙二醇干扰素组或未经治疗的对照组。他们在导入阶段之前以及大约24个月和48个月后进行了基线肝活检。突破/复发患者（绿线）在聚乙二醇干扰素/利巴韦林导入期出现未检测到的HCV RNA，并完成了12个月的治疗和6个月的随访。那些在接受治疗（突破）或随访（复发）期间感染病毒的患者被随机分为维持组或未治疗对照组。他们在导入阶段之前以及大约36个月和60个月后进行了基线活检。快递患者（红线）在试验外接受了相当于导入期的治疗，但仍处于病毒血症状态。大多数患者在随机分入聚乙二醇干扰素维持组或对照组之前立即进行了基线活检。随后的活检分别在随机分组后18个月和42个月进行。

由12名病理学家组成的委员会一致评估肝活检是否存在坏死性炎症变化、纤维化、脂肪变性和其他发现，每个评分环节至少有8名病理学家在场。Ishak纤维化评分(5)作为试验的主要终点。要求所有患者在试验登记后12个月内进行基线肝活检，以显示桥接性纤维化（Ishak 3-4期）或肝硬化（Ishab 5-6期）。如果先前的活检显示明确的桥接性纤维化，则第2期（门脉纤维化）患者可以例外。对于表现良好的受试者，进行了基线活检下列的试验外未成功使用聚乙二醇干扰素-利巴韦林。在进入随机阶段后18个月（活检2）和24个月后（活检3）进行重复活检，除非患者拒绝、有活检禁忌症、研究终止临床结果或退出试验。

结果

纤维化阶段的变化

病理委员会在盲法审查会议上对535名形态计量学患者的所有肝脏标本进行Ishak纤维化分级评分。三名患者没有活检2，两名患者缺少活检3，但所有其他患者在三个时间点的每一个时间点都有纤维化分期。总的来说，在基线检查和活检2之间，30%的患者Ishak纤维化评分有1个或多个阶段的改善（即减少），43%保持不变，27%恶化，分期增加(表3). 活检2和活检3之间，26%改善，41%保持不变，33%恶化。从基线检查到活检3，32%改善，34%保持不变，34%Ishak纤维化评分恶化。长期聚乙二醇干扰素治疗组和未治疗对照组的患者之间没有显著差异，但三个随机分组之间存在差异。各阶层和整个队列在三个时间点的纤维化评分分布如所示图2在整个队列中，3期纤维化患者数量减少，2期和1期患者数量增加，但相对轻度纤维化（1-3期）患者的总比例保持不变（47%至49%），而6期患者（已建立肝硬化）从基线检查时的14%增加到活检2时的20%，到活检3时的26%，每个时间点的第4和第5阶段相应减少。对三个随机分层的仔细检查显示，突破/复发组中低分（1-3期）、6期的比例越来越高，4期和5期的比例越来越低，这表明一些患者可能受益于该组实现的部分病毒学抑制。导入的无应答者和表达患者的纤维化评分趋于恶化。在活检2（p=0.01）和活检3（p=0.0004）时，突破/复发患者与其他两个阶层之间的差异显著。

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图2

用于形态计量分析的535名患者每次活检时Ishak纤维化分期的分布，显示6期肝硬化患者的比例增加（p<0.0001）。面板显示了三个随机分层，左上角为引入无应答（n=346），右上角为突破/复发（n=78），左下角为表达（n=111），右下角为总队列（n=535）。基线时，三个地层之间没有显著差异。所有三个层次的肝硬化患者均显著增加，但活检2（p=0.01）和活检3（p=0.004）晚期的突破性/复发患者明显少于其他两个层次。

表3

形态计量分析中使用的535名患者在HALT-C试验过程中Ishak纤维化评分的变化。其中3例漏诊2例，2例漏诊3例。如果分数下降一个或多个阶段，则认为分数有所提高；如果分数下降了一个或更多阶段，则表示分数恶化。

	n个	改进	相同	恶化
基线至活检2	532	30%	43%	27%
干扰素处理	261	31%	40%	29%
控制	271	30%	44%	26%
第24个月至第3次活检	531	26%	41%	33%
干扰素处理	261	28%	40%	32%
控制	270	24%	42%	34%
基线检查到活检3	533	32%	34%	34%
干扰素处理	262	33%	34%	33%
控制	271	31%	34%	35%

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形态计量学

胶原蛋白含量的形态计量测定仅限于1269例至少10 mm的未凝固活检²包括399个基线、470个活检-2和400个活检-3标本。总的来说，与其他研究报告的纤维化阶段和胶原蛋白含量之间存在类似的关系和显著的相关性（Spearman r=0.57）(6,7); 然而，在不同阶段，胶原蛋白的数量有相当大的重叠(图3)这表明，虽然相关，但定量纤维组织数量的形态计量学和主要依赖于纤维化位置和结构畸变的Ishak纤维化评分测量不同的东西。

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图3

研究中1269例肝活检中Ishak纤维化各阶段胶原蛋白含量测量值的分布。方框显示中间值，25^第个和75^第个百分位数，而第2.5和97.5行为百分位数（未显示异常值）。斯皮尔曼相关系数为0.57（p<0.0001）。

通过重复测量方差分析，我们发现聚乙二醇干扰素治疗的患者和未治疗的对照组之间的平均形态计量学测定的胶原蛋白含量没有随时间变化的差异(图4). 然而，令人惊讶的是，在基线检查和活检2之间，平均胶原蛋白含量增加了49%（95%置信区间35%至63%），但在活检3时，仅略微增加至基线检查的54%（95%可信区间41%至68%）。因为我们预计纤维化的进展会随着时间的推移而更加线性，所以我们进行了额外的分析。

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图4

治疗组研究中535名患者的平均胶原蛋白含量（±SEM），在三个时间点中的任何一个时间点，长期干扰素与未治疗对照组之间均无差异。

在三个随机分层之间的显著差异中发现了胶原蛋白随时间整体变化的意外结果的潜在解释(图5). 导入期结束时随机化的患者表现最接近预期，活检2（基线检查后中位数为25.3个月）和活检3（95%置信区间为61%至99%；基线检查后中位数为49.5个月）的胶原蛋白平均值比基线检查时增加61%（95%可信区间为47%至76%），尽管活检2和活检3之间的差异没有统计学意义。相反，基线检查时，突破/复发患者的平均胶原蛋白略低，活检2增加了48%（95%置信区间为8%至89%；基线检查后的中位数为36.8个月），但活检3没有进一步增加（基线检查后中位数为60.5个月）。快速反应的患者截然不同；他们的基线活检跟着聚乙二醇干扰素/利巴韦林治疗失败，而不是前面的其他两组接受的引导疗程。与导入的无反应患者相比，表达患者基线时的胶原蛋白平均增加47%（p<0.0001）。活组织检查2和3中的胶原蛋白与基线水平在统计上没有显著差异，活组织检查2中的胶原蛋白仅增加了21%（95%置信区间为1%至40%；基线后21.4个月的中位数），然后又回到了活组织检查3的基线值（基线后的中位数为45.3个月）。与其他组相比，在年龄、血清ALT、HCV RNA水平、酒精史等方面的差异并不能解释表达阳性患者基线时平均胶原蛋白含量较高的原因(12)或活检中的炎症或脂肪(表4). 在三个随机化分层中的每一个分层中，随机服用长效聚乙二醇干扰素的患者和未经治疗的对照组在不同时间点的平均胶原蛋白含量没有显著差异（数据未显示）。导入无反应患者的平均胶原蛋白每年增加20%至30%，突破/复发患者每年增加10%至16%，表达患者每年增加0至13%。

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图5

研究中535名患者在不同时间点的平均胶原含量（±SEM）（按随机分层）。对于突破性/复发患者，基线活检和第二次活检之间的中位数间隔为36.8个月，导入结束患者为25.3个月，快速患者为21.4个月。对于导入无应答（p<0.0001）的突破性/复发患者，活检2中的平均胶原蛋白显著高于基线活检（p=0.0029），但两组活检3中的胶原蛋白均未显著高于活检2。在基线活检中，表达患者的胶原蛋白明显多于导入和突破/复发患者（p<0.0001），但表达患者的基线活检、活检2和活检3之间的差异无统计学意义。

表4

三个随机地层的基线特征。

	引入无应答者n=346（平均值±S.D.）	突破/复发n=78（平均值±标准差）	表示n=111（平均值±S.D.）	p值
年龄*	50.3 ± 7.6	48.7 ± 4.9	50.2 ± 6.4	0.21
中高音*	110 ± 71	113 ± 94	101 ±74	0.51
对数HCV RNA*	6.46 ± 0.47	6.58 ± 0.44	6.38 ± 0.59	0.02
终生酒精饮料总量（千）*(12)	15.5 ± 23.3	22.9 ± 43.0	17.7 ± 24.7	0.09
基线检查时的组织学平均炎症评分(5)（±S.D.）	7.6 ± 1.9	7.3 ± 2.0	7.6 ± 2.0	0.40
脂肪变性（>5%的组织）	n=145（42%）	n=22（28%）	n=43（57%）	0.08

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^*随机化时

我们还检查了纤维化进展最严重的患者可能出现临床结局的可能性（死亡、腹水、静脉曲张出血、自发性细菌性腹膜炎、Child-Trucotte-Pugh评分>7、肝移植资格或肝细胞癌）(11)活检3失败，导致选择偏差，这可能是活检2和活检3之间明显缺乏进展的原因。然而，事实上，在这项分析中的535名患者中，除了一名患者外，其余患者都进行了3次活检，尽管只有400名患者未粘连，至少有10毫米²组织，这是本分析中包含的要求。接下来，我们询问在本分析中排除的零碎的小活检是否更有可能发生在活检3中，这是另一个潜在的选择偏差来源。受结果影响的患者在基线和活检3之间的平均胶原增加了119%（95%置信区间79%至159%），并且在三个时间点中的每一个时间点的平均胶原显著增加（基线时p=0.0137；活检2的p=0.0030；活检3的p=0.0031，图6)与没有结果的患者相比，尽管只有19名有结果的患者有3个足够进行形态计量分析的活检标本。因此，有临床结果的患者在基线检查时纤维化程度最高，随着时间的推移，纤维化进展增加幅度最大；然而，由于有结果的患者的纤维化程度如此之高，他们不太可能进行适合于形态计量分析的活检。尽管临床结果和零碎/小活检的患者数量很少，但将其活检3标本排除在形态计量分析之外可能是活检2和活检3之间纤维化明显减速的部分原因。

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图6

不同时间点的平均胶原含量（±SEM）显示，在42名有临床结果的患者中，每次纤维化明显多于493名没有临床结果的患者（基线p=0.0137，活检2 p=0.0030，活检3 p=0.0031）。

最后，我们检查了基线胶原对形态计量纤维化测定变化的影响(图7). 我们选择的范围约为基线值的最高值（>0.055单位，n=181）、中间值（0.024-0.055单位、n=158）和最低值（<0.024单位，n=185）的三分之一。具有中等基线胶原蛋白的队列的平均胶原蛋白表现最接近预期，在活检2时比基线增加110%，在活检3时增加158%。对于基线胶原水平较低的患者，平均值增加了大约相同的绝对值，但由于初始平均值很低，百分比增加很高（307%），但活检3时没有进一步增加。最后，高胶原蛋白队列的平均值在活检2时实际下降了10%，但在活检3时保持不变。这可以部分解释为胶原蛋白含量最高的患者的临床结果减少，如图6尽管还无法给出完整的解释。

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图7

根据基线胶原蛋白水平，研究中535名患者的平均胶原蛋白含量（±SEM）（每组约三分之一的患者）。基线胶原蛋白含量高（>.055单位）的组在随后的活检中往往较少，而中或低胶原蛋白含量增加。

讨论

在这项研究中，我们发现，通过形态计量图像分析（测量纤维化的最敏感组织学方法），长期低剂量维持性聚乙二醇干扰素治疗对这组慢性丙型肝炎患者的纤维化进展没有影响。然而，我们的数据，确实表明，在导入期使用全剂量聚乙二醇干扰素/利巴韦林进行部分病毒学抑制可能会延缓纤维化进展。此外，我们的观察也提出了这样的可能性，即当全剂量聚乙二醇干扰素/利巴韦林治疗在产生病毒抑制方面无效时，纤维化进展实际上可能会加速。

在之前完成的两项针对慢性丙型肝炎患者的短期临床试验中，发现胶原蛋白以相对较快的速度增加，这可以通过大规模队列中的形态计量学检测和量化。在这三个试验中，研究药物均未对纤维化变化产生任何影响；因此，将安慰剂治疗的对照组和服用研究药物的患者的数据结合起来分析纤维化进展。在一项研究中，245名晚期纤维化（Ishak 4-6期）患者的平均胶原蛋白在1年内增加了58%(7). 在另一项研究中，209名中度（2-4期）纤维化患者的平均胶原蛋白在1年内增加了30%(9).

HALT-C试验为研究纤维化的长期变化提供了机会；然而，由于所有患者都接受了至少6个月的利巴韦林和全剂量聚乙二醇干扰素治疗，该试验不包括真正的安慰剂治疗对照队列。尽管如此，这项研究预计将提供有关纤维化长期进展的信息，但总体结果(图4)令人惊讶。在基线检查和第二次活检之间，该队列的平均纤维化增加了近50%，与以前的研究报告的结果类似，但此后，在接下来的两年研究中几乎没有变化。在某种程度上，我们可以通过调用三个随机分层（“导入无反应”、“突破/复发”和“表达”）之间肝胶原结果的差异来解释这些观察结果(图5)以及由于失去了大部分纤维化患者的临床结果，因此纳入了较少的活检-3样本(图6).

这三个随机分层在三个重要方面存在差异。首先，基线活检和活检2之间的时间间隔存在显著差异，导入无反应组平均为25.3个月，突破/复发组为36.8个月，表达组为21.4个月。其次，突破性/复发患者在几个月内实现了完全的病毒学抑制，而其他两组没有出现这种情况。第三，快递患者接受了活检之后6个月的全剂量聚乙二醇干扰素/利巴韦林治疗，而其他患者进行了基线活检之前接受治疗。

在导入治疗结束时随机分组的患者队列的纤维化进展与之前报道的最接近，四年内肝纤维化增加了80%。尽管这大约每年20%的比例低于其他研究中每年30-58%的比例，但目前的研究是第一个包括长期随访活检的研究。然而，我们在该组观察到的纤维化进展并非线性的；前两年的增幅大于后两年。这一观察结果可能部分是由于失去了有结果的患者(图6). 突破性/复发患者至少在部分治疗过程中记录了病毒学抑制，这可能有助于减少纤维化的累积，5年内50%或每年10%，肝硬化患者相对较少(图2). 然而，在突破/复发队列中，接受长期低剂量聚乙二醇干扰素治疗的患者与未经治疗的对照组之间没有显著差异；因此，他们在纤维化进展中的延迟似乎是由最初的病毒抑制而非维持治疗引起的。临床结果和组织学改善的初步分析也表明导入治疗的影响比维持治疗的影响更大(13). 与引入的无应答队列相似，突破/复发组的平均纤维化增加最显著的发生在基线活检和活检2之间。

在快速表达患者中观察到的纤维化变化并不容易解释，但这是整个队列中活检2和活检3之间明显缺乏纤维化进展的主要原因(图4). 尽管表达受试者在基线Ishak纤维化阶段与导入无反应层没有显著差异，但通过形态计量学测定的表达组的平均纤维化在基线时高出47%。在活检2中，表达组和导入无反应组的胶原蛋白水平测量值几乎相同，但随后在表达组出现了令人费解的下降。表达组与导入无应答组的区别在于，表达组在聚乙二醇干扰素/利巴韦林治疗无效后不久（中位数为1.5个月）进行了基线活检。这一观察结果增加了无效的聚乙二醇干扰素和利巴韦林治疗可能会暂时加速肝纤维化的可能性，也可能解释了为什么患者在导入期结束时随机化（导入无反应）前两年（在此期间，他们在最初的6个月内接受了无效的全剂量聚乙二醇干扰素和利巴韦林治疗）的纤维化程度比第二年间隔期间更高。然而，目前，聚乙二醇干扰素和利巴韦林在促进短暂性纤维化进展中可能发挥的作用尚不明确。

当前研究的一个局限性是，在HALT-C试验中，只有不到一半的患者进行了适合于形态计量分析的肝活检，这增加了选择偏差的可能性。这一观察结果表明，在研究肝纤维化的变化时，需要标准化的活检方法。非侵入性技术可能在未来可用，但需要根据疾病的自然病史进行验证，并与肝活检相关联。如果活检被用作研究终点或非侵入性标记物验证的标准，则需要标准化活检样本的技术和充分性要求。对于纤维化的研究，用切割活检针获得的标本优于用抽吸针获取的标本(14); 此外，更大规格的针头（14至16克）和至少2厘米长的活检最有可能为评估组织学提供足够的样本(15)如果将其用作临床试验终点并与非侵入性标记物相关。活检取样误差在一定程度上总是存在的，因此必须强调的是，形态计量学不适合评估单个患者的变化，而应保留用于统计分析和比较大队列中的变化。

HALT-C试验期间连续肝活检标本的可用性首次为大量晚期慢性丙型肝炎患者在3.5至5年内通过定量图像分析来分析纤维化进展提供了机会。我们的研究结果表明，这种方法有望在未来的研究和临床试验中应用，但目前纤维化进展的自然史仍然是一个非常不确定的领域。因此，未来需要精心设计的前瞻性长期研究，如HALT-C试验，以确定慢性丙型肝炎纤维化的真实自然史。

致谢

脚注

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