丙酮酸是糖酵解的最终产物，是线粒体中三羧酸（TCA）循环的主要底物，因此在碳代谢调节中占据着关键节点。丙酮酸位于这些分解代谢途径与合成代谢途径的交叉点，用于脂质合成、氨基酸生物合成和糖异生。因此，未能在这些命运之间正确分配碳，是糖尿病、肥胖症和癌症代谢改变的核心所在(1,2). 由于丙酮酸的基本重要性，线粒体丙酮酸载体（MPC）已被广泛研究(三,4). 这包括发现α-氰氰菊酯类似物，如UK-5099，作为载体活性的特异性和有效抑制剂(5). 尽管如此，编码线粒体丙酮酸载体的基因仍然未知(6,7).
作为对线粒体蛋白质进行特征描述的持续努力的一部分，我们启动了对MPC蛋白家族（最初在人类中命名为BRP44和BRP44L）的研究(8). 这个家族有三个成员酿酒酵母，由编码YGL080W型,YHR162W型、和YGR243W型，以下简称MPC1,MPC2（MPC2）、和MPC3型分别为。Mpc2和Mpc3在氨基酸序列上有79%的相同，似乎是最近基因复制事件的产物。Mpc1、Mpc2和Mpc3与线粒体共定位(和图S2A)与已发表的线粒体蛋白质组学研究一致(9,10). Mpc1和Mpc2的线粒体定位通过生化分离得到证实(). 线粒体膜中富含Mpc1、Mpc2和Mpc3(图S2B)与序列中预测的跨膜结构域一致(图S1). 除非线粒体外膜破裂，否则Mpc1和Mpc2对蛋白酶处理具有抵抗力(和图S2C)这意味着它们嵌入线粒体内膜。对标记的Mpc1和Mpc2变体进行色谱纯化，然后进行质谱分析，结果表明Mpc2和Mpc3是Mpc1的主要相互作用蛋白，Mpc1和Mpc3是Mpc2的主要相互作用蛋白(表S1). 与此一致的是，标记的Mpc1铜纯化的Mpc2的免疫沉淀，反之亦然(，车道3和4）。此外，Mpc2可以与自身交互(，通道8），而未检测到Mpc1同型相互作用(，车道7）。蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，Mpc1和Mpc2都作为~150kD复合物的一部分迁移(图S2D). Mpc2的缺失阻止了Mpc1在该综合体中迁移，而最大功率因数1Δ应变显示Mpc2复合物形成增加(图S2E). 我们的结论是，Mpc1和Mpc2形成一个嵌入线粒体内膜的多聚物复合体，Mpc2可能是主要的结构亚单位。
Mpc1和Mpc2是进化上保守的线粒体内膜蛋白。(A类)用绿色荧光蛋白标记的Mpc1（Mpc1-GFP）和线粒体靶向红色荧光蛋白（MtRFP）在酵母细胞中共表达。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。(B类)表达Mpc1-V5和Mpc2-His菌株的完整线粒体、低渗膨胀的线粒体和TritonX-100溶解的线粒体6/透明质酸2有（+）或无（−）蛋白酶K培养。显示了使用所示抗体与全细胞裂解物（WCL）和线粒体后上清液（PMS）对提取物进行的免疫印迹。Mge1、Cyb2和Fzo1分别是基质蛋白、膜间蛋白和外膜蛋白。(C类)线粒体提取物的免疫沉淀最大功率因数1Δ最大功率因数2表达Mpc1和Mpc2的Δ细胞标记如图所示。显示免疫沉淀物（IP:HA）或输入物（HA，血凝素）的免疫印迹。QCR1和2（泛喹啉-细胞色素c还原酶复合物核心蛋白1和2）以及Cox II（细胞色素c氧化酶亚基2）是免疫沉淀特异性的对照。(D类)在缺乏亮氨酸的合成培养基上发现的指示酵母菌株的系列稀释液，并在30°C下培养24小时。(E类)在缺乏亮氨酸的合成培养基上发现的指示菌株的系列稀释液，并在30°C下生长48小时。重量，野生型；EV，空矢量。
突变酵母菌株受到多种生长条件的影响。这个最大功率因数1Δ和最大功率因数2Δ细胞在甘油等非发酵碳源上表现出轻微的生长缺陷，对葡萄糖培养基的影响更大(图S3)和缺乏亮氨酸的强烈生长缺陷(). 相反，mpc3型Δ突变体没有表现出明显的生长表型。酵母，果蝇属，或人类MPC1直系亲属，但不是人类MPC2（MPC2），可以拯救最大功率因数1Δ生长表型()，表明Mpc1功能在进化过程中保持不变。
为了分析MPC在多细胞动物中的生理功能，我们将研究扩展到果蝇属MPC1（dMPC1；由编码CG14290型)也定位于线粒体(图S4). 类似酵母最大功率因数1Δ突变体，数字MPC1突变体(图S5)在标准食物中是可行的，但对仅含碳水化合物的饮食敏感，转移到蔗糖培养基后会迅速致死(). 而5′-三磷酸腺苷（ATP）的含量在数字MPC1突变体()以及三酰甘油（TAG）和蛋白质(图S6、B和C)，碳水化合物的数量增加，包括循环糖海藻糖()，葡萄糖()果糖和糖原(图S6、A和D). 这些结果表明数字MPC1突变体在碳水化合物代谢方面有缺陷，可能会消耗储存的脂肪和蛋白质以获取能量。与此相一致数字MPC1在严重依赖葡萄糖代谢的组织（脂肪体、肌肉和神经元）中，野生型基因的表达拯救了糖饮食中的突变体().
数字MPC1是丙酮酸代谢所必需的果蝇。(A类)生活控制百分比(数字MPC1+)或数字MPC1突变体(dMPC公司−)转移到标准实验室培养基（标准食品）或只含糖的培养基后，苍蝇会飞。(B类)生活百分比数字MPC1+或dMPC公司−8天后，在糖培养基上携带指示GAL4和UAS转基因的苍蝇。(C类到E类)提取物中ATP（C）、海藻糖（D）和葡萄糖（E）的相对浓度数字MPC1+或dMPC公司−在2天（D和E）或3天（C）后按指示饮食飞行。(F类)丙酮酸和TCA循环中间产物的相对丰度数字MPC1+或dMPC公司−用气相色谱-质谱法测定苍蝇在食用指定食物2天后的表现*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001（学生t吨测试）。数据显示为平均值±SEM。
代谢组学分析显示丙酮酸的浓度高度升高，而TCA循环中间产物在dMPC1型糖饮食中的突变体(). 同样，在糖饮食中的突变株中，可以与糖酵解中间产物相互转化的甘氨酸和丝氨酸的数量也增加了(图S6E)而可以与TCA循环中间产物相互转化的谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸在这些条件下被耗尽(图S6F). 与此一致最大功率因数1Δ和最大功率因数2Δ酵母突变体显示丙酮酸浓度升高()，苹果酸消耗(图S7)乙酰辅酶A（CoA）耗尽，CoA浓度升高(). 综上所述，这些结果表明MPC1突变体无法有效地将细胞溶质丙酮酸转化为线粒体乙酰辅酶A，以驱动TCA循环和ATP生成。
MPC1是线粒体丙酮酸吸收所必需的。(A类)指示菌株中丙酮酸的相对丰度。P（P）相对于的值重量. (B类)指示菌株中乙酰辅酶A和辅酶A的相对丰度。(C类)指示菌株的线粒体丙酮酸脱氢酶活性。P（P）相对于的值重量和最大功率因数1Δ. (D类)在30°C下生长48小时的葡萄糖培养基上对指示菌株进行连续稀释。(E类)吸纳14C-丙酮酸进入线粒体重量或最大功率因数1含有所示质粒的Δ细胞。P（P）相对于的值重量+EV和最大功率因数1Δ +MPC1. (F类)Mae1公司Δ最大功率因数1用所示质粒转化的Δ细胞，在含有或缺乏亮氨酸或UK-5099组合的培养基上培养。(G公司)吸收14C-丙酮酸进入线粒体mpc1型Δ含有UK-5099存在或不存在的指示质粒的菌株***P（P）< 0.001, **P（P）< 0.01, *P（P）< 0.05; NS，不显著（学生t吨测试）。数据显示为平均值±SEM。
这些表型可能由线粒体丙酮酸摄取缺陷或丙酮酸脱氢酶（PDH）复合物将线粒体丙酮酸酯转化为乙酰辅酶a引起。然而，缺乏Mpc1的酵母几乎具有野生型PDH活性，不像pda1型Δ突变体()，缺少PDH功能(11). PDH活性降低也不能解释最大功率因数1Δ突变体，比pda1型Δ突变体(图S8). 然而，结合最大功率因数1Δ等位基因缺失mae1号机组，编码一种苹果酸酶，在线粒体基质中将苹果酸转化为丙酮酸(12)，发现葡萄糖培养基上有一个严重的生长缺陷，这一缺陷可通过两种基因的质粒表达完全修复MAE1号机组或MPC1(). 值得注意的是，线粒体来自最大功率因数1Δ突变体几乎不吸收14C-丙酮酸盐，可通过野生型质粒表达完全拯救MPC1(). 此外，Mpc1似乎是线粒体丙酮酸载体抑制剂UK-5099的关键靶点(5). 这个mae1号机组Δ最大功率因数1Δ双突变体在缺乏亮氨酸的葡萄糖培养基上生长减慢，该表型可通过野生型转基因表达有效挽救MPC1在UK-5099缺席但不在场的情况下(). 通过筛选MPC1在UK-5099存在下可以生长的突变体，我们恢复了Asp118→Mpc1中的Gly（D118G）替代物赋予UK-5099抗性(). 此外，鉴于14表达野生型的线粒体对丙酮酸的摄取MPC1几乎被UK-5099完全抑制，在表达MPC1-d118克(). 我们得出结论，Mpc1是线粒体丙酮酸载体的关键成分，与Halestrap等人几十年来研究的活性相对应(5,13).
耗尽MPC1在小鼠胚胎成纤维细胞中(图S9A)导致基础条件下丙酮酸驱动的耗氧量适度下降，而羰基氰化物的存在则使耗氧量大幅下降-第页-三氟甲氧基苯腙（FCCP），刺激最大呼吸(). 沉默后也观察到类似的结果MPC2（MPC2）(和图S9A). 这种对丙酮酸氧化的抑制作用不会影响氧化磷酸化机制的组成部分(图S9、B和C)，表明哺乳动物Mpc1和Mpc2以类似于酵母和果蝇属.
哺乳动物MPC1和MPC2（MPC2）是丙酮酸正常代谢所必需的。(A类和B类)在基础和FCCP刺激条件下，在转染对照（Cont）小干扰RNA（siRNA）或三种不同的siRNA（si 1–3）的细胞中，小鼠胚胎成纤维细胞的丙酮酸驱动呼吸MPC1（A） 或MPC2（MPC2）（B） ●●●●。P（P）相对于控件的值。(C类)家族1、2和3的谱系。圆圈表示女性；方形，雄性；钻石，未知性别。黑色表示已故，白色表示活着。箭头标记获得成纤维细胞的个体。(D类)MPC1的蛋白质区域包含由ClustalW排列的所有三个家族预测的氨基酸替换。氨基酸残基的单字母缩写如下：A，Ala；C、 半胱氨酸；D、 天冬氨酸；E、 谷氨酸；F、 苯丙氨酸；G、 甘氨酸；H、 他的；一、 伊利；K、 赖氨酸；五十、 亮氨酸；M、 已见面；N、 Asn；P、 专业；Q、 甘氨酸；R、 精氨酸；S、 序列号；T、 Thr；五、 缬氨酸；W、 Trp；还有Y，Tyr。酿酒酵母、黑腹果蝇、智人、秀丽隐杆线虫、斑马鱼、拟南芥. (E类)丙酮酸盐（左）和谷氨酰胺（右）支持L79H或R97W成纤维细胞的呼吸MPC1突变。(F类)丙酮酸支持对照细胞系或L79H患者细胞系在用指定载体转导后的呼吸。(G公司)用所示载体转导后，丙酮酸支持对照或R97W患者细胞系的呼吸。(H（H）)连续稀释重量或mae1号机组Δ最大功率因数1Δ携带指示质粒的酵母菌株生长在缺乏尿嘧啶的培养基上，用于在30°C下40小时的质粒选择。使用长型（L）和短型（S）R97W（带或不带外显子4）***P（P）< 0.001, **P（P）< 0.01, *P（P）< 0.05, †P（P）< 0.10; NS，不显著（学生t吨测试）。数据显示为平均值±SEM。
我们之前描述过一个法国-阿尔及利亚家族，其两个后代在线粒体丙酮酸氧化方面表现出严重缺陷(14) (，系列1）。随后我们又发现了另外两个家庭，每个家庭都有一个表现出类似但不太严重表型的受累儿童(，系列2和3）。连锁分析和纯合子作图使我们能够专注于6号染色体上的一个候选区域（163607637至166842083，GRCh37/hg19）。该区间包含10个潜在候选基因：PACRG公司,QKI公司,C6或118,PDE10A型,SDIM1系统,T型,PRR18型,SFT2D1系列,RPS6KA2系列、和brp44升，这是人类MPC1外显子和内含子/外显子边界的DNA测序MPC1家系2和家系3患者成纤维细胞中的基因显示相同的分子病变，c.236T→A，导致预测的p.Leu79→他的（L79H）改动(). 对来自家族1的DNA的分析揭示了一个明显的序列变化，c.289C→T，这导致了预测的p.Arg97→Trp（R97W）突变(). 两个受影响的残基都是通过在MPC1正交曲线和Arg97两者之间是保守的MPC1和MPC2（MPC2）正交曲线(图S1).
家族1和家族2受影响个体的细胞表现出基础和FCCP刺激的丙酮酸氧化受损()而谷氨酰胺驱动的耗氧量正常或升高，表明他们没有获得线粒体呼吸的全面损害(). 正如预期，野生型人类的表达MPC1在家族2的细胞中()或系列1()完全或部分修复了FCCP诱导丙酮酸氧化的缺陷。此外MPC1-Leu79他的等位基因对抑制酵母的效果较差最大功率因数1Δ相对于野生型人类的生长缺陷MPC1()和更强的MPC1-Arg97Trp（MPC1-Aarg97Trp）等位基因基本上是不活跃的()，表明MPC1从酵母到人类，其功能在进化上是保守的。
这里提供的数据表明，Mpc1-Mpc2复合物是酵母、苍蝇和哺乳动物线粒体丙酮酸载体的重要组成部分。这与在大鼠肝脏、心脏和蓖麻子中进行的实验一致，这些实验涉及线粒体丙酮酸摄取中12至15 kD的蛋白质(15)-类似于Mpc1（15 kD）、Mpc2（14 kD）和Mpc3（16 kD）的分子质量。虽然这些个体大小相对较小，但Mpc1和Mpc2形成约150 kD的复合物，表明低聚物结构介导丙酮酸转运。Mpc1和Mpc2足以在异源系统中促进丙酮酸摄取的证明提供了它们构成必需丙酮酸转运蛋白的进一步证据(16). 最后，碳水化合物进入线粒体并转化为乙酰辅酶a的程度是正常葡萄糖氧化以及糖尿病、肥胖和癌症发病的关键步骤。因此，与PDH一样，PDH受变质岩和翻译后修饰的控制(17)丙酮酸的线粒体输入可能被精确调节(18,19). Mpc1和Mpc2对线粒体丙酮酸转运至关重要，这为理解这种代谢控制水平提供了一个新的框架，也为潜在的治疗干预提供了新的方向。
