哺乳动物转录因子如何识别甲基化DNA

摘要

介绍

DNA甲基化是一种典型的表观遗传标记。它在不改变DNA序列的情况下影响DNA的功能，并可通过复制进行遗传。¹DNA甲基化有一个复杂的进化历史：它是一种古老的现象，存在于古细菌、细菌和真核生物中，但在许多生物中已经消失，例如酵母酿酒酵母或者虫子秀丽线虫在具有DNA甲基化的真核生物中，其基因组分布在物种之间差异很大，可能反映了该标记的不同生理作用。²在这篇综述的背景下，我们将关注哺乳动物有机体，其中表观遗传DNA甲基化仅针对胞嘧啶，主要是在CpG二核苷酸的背景下。^三缺乏DNA甲基化酶DNMT1、DNMT3a或DNMT3b的小鼠在发育过程中或出生后不久死亡，这表明DNA甲基化在哺乳动物中是必不可少的。⁴

为什么DNA甲基化在哺乳动物中如此重要？为了回答这个问题，了解DNA甲基化在基因组中的位置是很有用的。DNA测序技术的巨大进步使得在一些重要的细胞类型（如小鼠）中获得全基因组DNA甲基化图谱成为可能⁵和人类胚胎干细胞。⁶系统性较低、成本较低的替代品，如减少代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）⁷或用于相对甲基化（CHARM）的综合高通量阵列，⁸也在许多组织中进行。总之，这些实验提供了DNA甲基化在给定细胞基因组中的典型位置，以及不同细胞类型之间的差异。⁹

一些独立的现象似乎解释了哺乳动物DNA甲基化的本质。¹⁰首先，DNA甲基化控制X染色体失活和印迹基因的表达，而印迹基因是发育的关键调节器。其次，DNA甲基化抑制重复序列的转录，阻止转座元件的重新定位，从而保持基因组的稳定性。第三，DNA甲基化标记了活性基因体，可能对剪接产生影响。¹¹第四，DNA甲基化通过抑制启动子活性来调节基因表达。

DNA甲基化对基因和重复元素表达的抑制作用似乎涉及两个主要机制。¹²DNA甲基化可以阻止转录调节器识别其同源靶点；或者，它可以招募专门结合甲基化DNA的调节器。这些蛋白质被称为甲基-CpG结合蛋白（MBPs），是本综述的重点。它们属于我们现在讨论的三个结构家族：MBD家族、锌指家族和SRA家族(图1).

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图1。MBP的三大家族及其已知目标。左侧面板：已知能结合甲基化DNA的人类蛋白质的示意图。指出了它们的一些结构域：MBD，甲基结合域；CXXC、CXXC型锌指；Ubl，泛素样结构域；TTD，串联都铎结构域；PHD，植物同源结构域；SRA、SET和RING-finger相关域；RING，非常有趣的新基因域；BTB/POZ，广泛复合物，Tramtrack和Bric-brac/POx病毒和锌指结构域；采埃孚、塞浦路斯₂伊斯₂锌指结构域；KRAB，Krüppel关联框。强调了甲基化DNA识别所必需的锌指。右侧面板：体外鉴定的一些高亲和力DNA靶点。清单并不详尽。M代表5-甲基胞嘧啶。H代表5-羟甲基胞嘧啶。N是任何核苷酸。

阿德里安·伯德实验室率先开展的调查发现了第一个MBP，即MeCP2。¹³对MeCP2同源物的搜索确定了MBD1、MBD2和MBD4，它们都通过保守的MBD同源域结合甲基化DNA，亲和力高于非甲基化DNA。¹⁴相反，MBD3、MBD5和MBD6不结合甲基化DNA，这是由于关键位置的氨基酸改变或MBD中关键DNA相互作用残基的缺失。¹⁵MBD家族三个成员与甲基化DNA的配合物的结构已通过溶液核磁共振波谱（MBD1¹⁶和MBD2¹⁷)或X射线晶体学（MeCP2，¹⁸图2A). 这三种蛋白质采用类似的总折叠，由α/β三明治和类似的结合模式组成。β片的核心通过保守的精氨酸和酪氨酸残基与DNA的主沟相互作用，在甲基-CpG（mCpG）位点形成碱基特异性接触。通过α-螺旋中的残基介导的广泛的糖和磷酸盐骨架相互作用，以及在DNA识别时形成稳定发夹结构的β-片内的保守环，结合相互作用进一步稳定。有趣的是，虽然不同的MBD/甲基化DNA复合物具有共同的结构特征和mCpG识别模式，但它们在核心mCpG-位点之外表现出不同的序列偏好。特别是，MeCP2选择与mCpG站点相邻的A/T延伸目标，¹⁹而MBD1在T（mC）GCA或TG（mC）GCA序列中对mCpG位点的识别率最高。²⁰MBD2在识别源于ρ-珠蛋白启动子[GGAT（mC）GGCCT]依赖于mCpG位点两侧碱基对的身份，表明它也在序列特异性环境中结合。¹⁷

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图2。每个MBP系列的代表性结构。(一)人MeCP2 MBD的晶体结构与甲基化DNA共有位点的复合物来源于脑源性神经营养因子（BDNF）启动子（PDB 3C2I）。¹⁸(B类)人UHRF1与半甲基化DNA（PDB 3CLZ）复合物中SRA结构域的晶体结构。²⁵(C类)小鼠Cys的晶体结构₂伊斯₂锌指蛋白ZFP57与甲基化DNA靶标复合物，已知定位于印迹控制区（PDB 4GZN）。³⁴(D类)人Cys的晶体结构₂伊斯₂锌指蛋白Kaiso与甲基化DNA共识位点的复合物来源于E-钙粘蛋白（CDH1）启动子（PDB 4F6N）。³⁵粉红色球体代表甲基化胞嘧啶中的甲基。

中村由介（Yusuke Nakamura）及其团队通过努力发现了第二个MBP家族，他们确定UHRF1和UHRF2这两种相关蛋白质可以通过其SRA域结合甲基化DNA。²¹很快发现UHRF1是一种结合半甲基化DNA的基本蛋白，并招募DNMT1以促进维持DNA甲基化；在缺乏UHRF1的情况下，存在DNA甲基化的急剧损失。^22,23X射线晶体学迅速解决了UHRF1与半甲基化DNA复合物的结构，产生了重要的新见解(图2B). 在这个复合物中，甲基化胞嘧啶从双螺旋中翻转出来，插入到深疏水口袋中，通过平面堆积接触、氢键和范德瓦尔斯相互作用（区分甲基化和非甲基化胞苷）使其稳定。^24-26这种碱基翻转机制让人想起DNA甲基化酶，²⁷但与MBD蛋白表现出的甲基化DNA识别模式完全无关。此外，天冬酰胺在交叉链非甲基化胞嘧啶附近的定位似乎为半甲基化DNA提供了选择性，因为胞嘧啶甲基化将导致与天冬酰胺的空间位阻，可能导致复合物的整体结构不稳定。最后，来自UHRF1的碱基特异性相互作用仅限于5-mCpG/CpG对，这表明与MBD家族相比，mCpG位点以外的序列上下文对识别并不重要。这一观察结果与UHRF1参与整个基因组的甲基化维持一致，在这种情况下，对mCpG位点以外的序列上下文的特定识别将是不利的。

第三个也是目前最后一个MBP家族也因Egor Prokhortchouk、Adrian Bird及其同事的研究而曝光，他们发现锌指蛋白Kaiso可以区分甲基化DNA和非甲基化DNA。²⁸Kaiso被独立证明也能结合一个非甲基化的共识位点CTGCNA，称为Kaiso结合位点（KBS）。²⁹Kaiso在哺乳动物基因组中有两个相似的同源序列：Zbtb4和Zbtb38。³⁰这些蛋白质，如Kaiso，结合甲基化DNA，但也可以结合非甲基化共识。^31,32最近，另一种锌指蛋白ZFP57也被证明与甲基化DNA结合，并在印记基因的DNA甲基化依赖性维持中发挥作用。³³

在获得MBD和SRA家族MBP的结构信息后，一个重要的知识缺口仍然存在：锌指蛋白如何识别甲基化DNA？他们是否采用标准锌指结构？他们对甲基化DNA的识别与我们对MBD和SRA蛋白的了解相比如何？Kaiso是否使用相同的结合模式来结合甲基化DNA及其非甲基化靶点？这些结构说明了MBP之间已知的生物学差异吗？最近的两篇论文报道了锌指蛋白ZFP57的结构³⁴(图2C)和凯索³⁵(图2D)甲基化DNA复合物为这些问题提供了新的见解。我们将展示这些数据并讨论其含义。

ZFP57与甲基化DNA序列TGC（mC）GC复合物的结构

两个Cys₂伊斯₂ZFP57中负责甲基化DNA识别的锌指（ZF）采用经典的ββα-基序，定位α-螺旋，以与每个锌指的三个碱基对进行典型的主沟相互作用。ZF2主要与T进行基础特定接触⁴GC公司⁶，而ZF3识别5-mC⁷GC公司⁹T的转换⁴GC公司⁶ATG序列的位点取消了结合，这表明与MBD蛋白类似，mCpG外的序列上下文对于ZFP57识别和结合同源序列至关重要。这与体内结合图一致，表明ZFP57不与ES细胞的整个基因组结合，而仅在包含TGC（mC）GC共识的一些位点结合。³³几个精氨酸残基促进了与核心TGC（mC）GC序列中胍的直接或水介导的碱特异性接触。这些关键精氨酸的突变会导致这种结合相互作用的完全丧失。

核心mCpG位点中的甲基化胞嘧啶的识别非常不同。5-mC8被Glu182特异性识别，它与N4-氨基形成经典氢键，并与C5-甲基形成CH-O氢键。有趣的是，Glu182向谷氨酰胺的保守突变对5-mC识别几乎没有影响，可能是由于N4-氨基氢键相互作用被维持。此外，参与与相邻G7的氢键相互作用的Arg178侧链的范德华贡献进一步有助于5-mC8的识别。这就是所谓的“5-mC-Arg-G”³⁴MBD结构中也观察到相互作用，这表明5-mC识别的保守机制在非常不同的结构基序中使用。另一方面，5-mC7没有来自ZFP57的碱特定触点，被有序水分子网络包围。在MBD/甲基化DNA结构中，还观察到其中一个5-mC碱基的溶剂化增加，并介导5-mC和高度保守的酪氨酸残基之间的相互作用，从而增强整体结合。¹⁸

Kaiso与甲基化DNA或KBS复合物的结构

Kaiso已在含有两种不同核苷酸的复合物中结晶：第一种是MeECad，它包含两个连续的mCpG位点，由E-钙粘蛋白启动子[C（mC）G（mC，GT]；²⁸第二个是KBS，在序列中不包含CpG，并且是非甲基化的（TCCTGCCA）。²⁹Kaiso与KBS或甲基化DNA复合物的整体结构几乎相同，并表现出相似的DNA识别模式。与ZFP57不同，Kaiso使用三个Cy₂伊斯₂锌指和额外的N端和C端延伸，以提供结构稳定性并增强整体结合亲和力。ZF2采用标准ββα折叠，而ZF1和ZF3分别包含三股β-片，分别具有βββα和ββα-基序。与ZFP57和其他典型的Cys相比，所有三个锌指都是以DNA主沟中的螺旋为方向的₂伊斯₂锌指，³⁵Kaiso只接触三个锌指之间的5-6个碱基对的核心。碱特异性相互作用通过位于ZF1和ZF2内的残基介导。ZF3与磷酸盐主链有额外的静电相互作用，但其主要作用是作为支架，C末端延伸（CTE）可以在其上通过与ZF2螺旋的相互作用形成稳定环，定位延伸的其余部分，以形成小沟DNA接触。这些小沟槽接触对于Kaiso的高亲和力DNA识别至关重要，因为ZF3以外的CTE截断大大减少了结合相互作用。³⁵在迄今为止解决的所有MBP结构中，Kaiso似乎是唯一一个利用主沟道和次沟道相互作用来传递高亲和力结合相互作用的结构。就区分结合靶点而言，这在生物学上的必要性和影响尚不完全清楚。

此外，Kaiso是唯一被确定优先识别两个连续mCpG位点的MBP。²⁸从结构中可以看出，这部分是由Arg511（ZF1）的碱特异性相互作用决定的，Arg511ZF1与中心两个5-mCpG对的鸟嘌呤形成交叉链氢键。虽然这种相互作用对胞嘧啶甲基化状态不敏感，但它确实规定鸟嘌呤必须占据这两个位置（就像KBS中的情况一样）。与ZFP57类似，Kaiso中的E535（ZF2）与第一个回文5-mCpG对中的两个5-mC形成经典和CH-O氢键，这通过Arg511和编码链5-mC之间的“5-mC-Arg-G”相互作用进一步稳定。在KBS识别中，Glu535与跨链胸腺嘧啶和胞嘧啶碱有类似的接触，可能是通过羧基侧链的质子化，使Glu535 O之间形成氢键^ε2和胸腺嘧啶O4。有趣的是，ZFP57中Glu182突变为丙氨酸对甲基化DNA识别的影响最小，而Kaiso paralog ZBTB4（Glu350）中等效于Glu535的突变导致mCpG识别显著降低。³²第二个mCpG位点中的5-mC主要位于ZF1残基形成的疏水囊中。

生物后果

结束语

随着对MBP最终锌指家族结构知识的补充，我们现在能够识别三个MBP家族中甲基-CpG识别模式的共性和差异。尽管如此，仍存在一些基本问题。越来越多的证据表明，各种MBP具有不同的DNA靶点，对于MBD和锌指家族，这可能由mCpG位点两侧的序列上下文决定。然而，对这些蛋白质体内DNA靶点的综合分析尚未建立。这一分析将有助于我们理解为什么有必要进化出三个截然不同的结构域来识别甲基CpG，并有助于更详细地理解这些蛋白质在正常细胞功能和疾病中所采用的复杂生物功能。

致谢

潜在利益冲突的披露

没有披露潜在的利益冲突。

脚注

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