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基因组研究。2012年12月；22(12): 2497–2506.
数字对象标识：10.1101/gr.143008.112
预防性维修识别码：项目经理3514679
PMID：22960375

单个DNA分子内核小体定位和DNA甲基化的全基因组定位

特蕾莎·K·凯利,1,5 刘亚萍,2,三，5 菲德斯·D·雷,1,三 梁刚宁,1 本杰明·伯曼,2,4,6,7和彼得·琼斯1,6,7
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

DNA甲基化和核小体定位共同产生调节基因表达的染色质结构。核小体通常使用核酸酶消化绘制，需要大量材料和不同的酶浓度。我们已经开发了一种方法（NOMe-seq），该方法使用GpC甲基转移酶（M.CviPI）和下一代测序，使用不到100万个细胞生成核小体定位全基因组的高分辨率足迹，同时保留来自同一DNA链的内源性DNA甲基化信息。通过使用一种新的生物信息学管道，我们发现在启动子不存在的CTCF区域，核小体占有率和DNA甲基化之间存在显著的反相关。我们进一步表明，启动子处核小体耗竭的程度与表达水平直接相关，可以容纳多个核小体，并提供全基因组证据证明表达的非CpG岛启动子是核小体缺失的。重要的是，NOMe-seq从同一DNA分子中获得DNA甲基化和核小体定位信息，从而在单分子和单细胞水平上首次实现全基因组DNA甲基化与核小体位置相关性，可用于监测疾病进展和治疗反应。

表观遗传学机制，包括DNA甲基化和核小体定位，共同产生特定的染色质状态，促进、抑制或允许基因表达的潜力。活性启动子具有非甲基化DNA，并且在基因转录起始位点（TSS）之前缺少核小体，而非活性启动子则具有密集的核小体并且可以是非甲基化（平衡或抑制）或甲基化（沉默）。由于染色质结构的多样性，仅通过核小体占有率或DNA甲基化无法预测基因激活潜力。

迈克尔·克拉德（Michael Kladde）及其同事的开创性工作证明了基于甲基转移酶的足迹分析在酵母和哺乳动物细胞中确定核小体定位的能力(Xu等人，1998年;Jessen等人2004,2006;Kilgore等人，2007年;Pardo等人，2010年). 使用下一代测序，我们描述了一种称为NOMe-seq（核小体占有率和甲基组测序）的全基因组核小体足迹方法，该方法使用GpC甲基转移酶（M.CviPI）(Xu等人，1998年)根据GpC位点的酶可及性获得核小体定位信息，同时从CpG位点获得内源性DNA甲基化信息。重要的是，这两条表观遗传信息都是从同一个单独的DNA分子中获得的，揭示了单个染色体上这两个染色质特征之间的关系。因此，使用单一方法，可以在单个分子水平上生成多个表观遗传修饰的全基因组图。

使用NOMe-seq和全基因组亚硫酸氢钠测序，我们生成了一个完整的图谱，并显示了与特定基因组特征相关的不同核小体/甲基化配置，TSS上游NDR的强度指示了表达水平，可以容纳几个核小体。通过用核小体占据和甲基化定义的两种不同染色质状态的读数检测启动子，我们确定了可能处于两种不同等位基因状态的基因，这两种状态在X染色体和已知的印迹基因座上强烈富集。同时测量单个DNA链中的核小体占有率和DNA甲基化是一个重要的工具，可以用来检查在疾病状态下基因组中的染色质结构是如何改变的。

结果

确定各种基因组位点精确足迹的最佳处理条件

为了生成完整的DNA甲基化和核小体占有信息，用M.CviPI处理细胞核，使不受核小体或紧密结合蛋白保护的GpC二核苷酸甲基化。继亚硫酸氢盐转化以区分甲基化和非甲基化胞嘧啶残基之后，CpG二核苷酸上下文中包含的胞嘧啶提供内源性甲基化信息，而核小体定位则源自GpC二核苷酸中的胞嘧啶。当每个单独胞嘧啶的甲基化被计算为甲基化读数除以覆盖该位置的所有读数的分数时，可获得核小体占有率和内源性DNA甲基化信息。结合CpG和GpC甲基化谱，可以看到四种不同的染色质结构(图1A). 我们首先确定了一组反应条件，允许各种染色质构型的精确足迹（即核小体亏损区域的可接近性，而不异常地进入核小体占用区域，定义为146 bp或更大，M.CviPI无法访问）(图1B; 补充图S1A）。

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NOMe-seq可以覆盖多种染色质结构。(A类)用M.CviPI处理IMR90细胞核后，提取DNA，进行亚硫酸氢转化，并进行测序。DNA甲基化状态由CpG二核苷酸获得，核小体占有信息由M.CviPI甲基转移酶无法进入GpC二核苷酸获得。DNA甲基化和核小体占有率数据的结合可以揭示四种不同的染色质特征：非甲基化和核小体缺失、非甲基化与核小体占用、甲基化与核小体占用以及甲基化和细胞核缺失。（黑圈）甲基化CpG位点；（茶色圆圈）可进入（甲基化）GpC位点。(B类)我们发现，200单位的M.CviPI持续7.5分钟，随后增加100单位，准确显示TSS上游的NDR为热休克蛋白5（也称为GRP78级)，一个活性CGI启动子，同时也显示多梳抑制MYOD1年CGI启动子和甲基化修饰的CpG-poor灯3正如预期的那样，启动子被核小体占据，M.CviPI无法访问。大于146 bp的M.CviPI不可触及区域被一个粉红色矩形覆盖，表示核小体占据。PCR扩增子大小：热休克蛋白5–447个基点，MYOD公司–474个基点，以及灯3–426个碱基。

NOMe-seq揭示了CTCF和转录起始位点的预期核小体占据模式

我们生成了全基因组NOMe-seq文库，并调整了我们的全基因组亚硫酸氢处理管道(Berman等人，2012年;Liu等人，2012年; 补充材料），以分离基于中央位置含有胞嘧啶的三核苷酸的胞嘧啶。GCH胞嘧啶通常用于绘制酶可及性（核小体保护或占有），而HCG（其中H=C、T或A）用于内源性甲基化。由于内源性甲基化和酶甲基化之间的模糊性，GCG被排除在外。排除GCG不太可能显著损害M.CviPI定位核小体的能力，因为GCG不到基因组的0.24%，仅占所有GC二核苷酸的5.6%（补充表S1）。此外，93.4%的GCG三核苷酸的GCH在20bp以内（其中一半在5bp以内），可以从中获得核小体占据信息（补充图S1B）。

由于全基因组数据的可用性(李斯特等人，2009年;Bernstein等人，2010年)，我们在IMR90细胞中执行了全基因组NOMe-seq，获得了1.56亿个可唯一对齐的读取，这些读取可以使用新开发的IGV查看器模块从原始BAM对齐文件中显示(图2A; 补充图S2；Thorvaldsdottir等人，2012年). 我们比较了NOMe-seq准确定位位于CTCF结合位点两侧的核小体的能力。我们将读取与保守的CTCF结合基序对齐(Xie等人，2007年)位于距离TSS 2 kb以上的位置，这些TSS已被CTCF实验验证为体内结合（补充表S2；Kim等人，2007年;Cuddapah等人，2009年)发现NOMe-seq映射的核小体与MNase-seq数据相似(图2B;Schones等人，2008年). 核小体占有率被绘制为不可接近M.CviPI（1-GpC甲基化）(图2B，蓝绿色线条）；因此，保护区域在图中显示为峰值。与MNase相比，使用NOMe-seq时，CTCF结合位点右侧的第一和第二核小体似乎稍微不同步；然而，这里我们比较的是来自基准CD4+T细胞数据集的MNase-seq数据(Schones等人，2008年)在IMR90单元中收集NOMe-seq数据。当我们比较从IMR90细胞生成的NOMe-seq和MNase-seq数据时，这种相移并不明显（补充图S3）。NOMe-seq产生的高分辨率还揭示了与CTCF结合位点一致的保护区域，可能反映了CTCF的结合。为了进一步研究这一点，我们以高分辨率检测了CTCF结合区（补充图S4），并显示出与CTCF基序重叠的谨慎保护模式，其大小（<40bp）与非核小体蛋白一致。这个保护区被清晰的核小体耗竭（可及性）所包围，而这反过来又被更大的保护区所包围，其大小与核小体占有率一致。接下来，我们将NOMe-seq读数与所有TSS进行比对，再次发现NOMe-se q与MNase-seq相当，能够识别TSS上游的核小体缺失区域（NDR）和TSS下游位置良好的核小体(图2C).

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NOMe-seq显示了特定位点和全球的核小体占有情况。(A类)使用最新开发的IGV查看器模块的ATM启动器概览(Thorvaldsdottir等人，2012年)以可视化NOMe-seq BAM对齐文件。这个顶部两个轨道表示两个GBM样本中每个样本的内源性DNA甲基化（在HCG位点），而轨道5和6表示相同GBM样本的GCH可及性。（红色）甲基化位点（HCG和GCH）；（蓝色）非甲基化位点（HCG和GCH）。ATM和NFAT的启动子未甲基化（蓝色顶部两个轨道）和核小体缺失（即，可接近并因此甲基化，因此在轨道5和6中为红色）。两个GBM样本的甲基化和核小体占用模式相同。轨道3和4显示了在每个单独的HCG处从这些轨道衍生的平均甲基化水平，在该HCG处甲基化的读数数除以甲基化和非甲基化的读数总数。与之前一样计算轨道7和轨道8中的平均GCH甲基化，但将其倒置（1-GCH），以表示整个主要数字中使用的核小体保护。该工具和源代码可在IGV项目网站上公开下载：http://www.broadinstitute.org/igv/. (B、 C类)NOMe-seq读数与CTCF一致(B类)和TSS(C类). IMR90细胞中的核小体定位显示在年-轴通过M.CviPI的不可接近性（1-GpC甲基化；蓝线）和MNase测序读取数（蓝线）。对于MNase-seq，读取与8709个CTCF站点一致，而8687个CTCF-站点至少有一个GpC站点被至少三个读取覆盖(B类). 对于TSS，42103个启动子用于MNase-seq，41292个启动子至少有一个GpC站点被至少三次读取覆盖。(D、 E类)基因启动子根据转录水平分为四分位(Hawkins等人，2010年)和相应的M.CviPI在里面可达性（1-GCH，蓝绿色线）绘制在年-轴。(D类)CpG岛促进者。(E类)非CpG岛促进者。NDR在更高表达的基因中更强，在某些情况下，可以长达数百bp以容纳多个核小体。

接下来，我们通过根据表达水平将启动子划分为四分位来研究核小体耗竭与表达之间的关系(Hawkins等人，2010年)并且发现，无论是CGI还是非CGI启动子，位于最低位置（0%–25%）的启动子都被核小体占据(图2D，E). 随着表达四分位数的增加，TSS上游的NDR和TSS后核小体的定位对于CGI和非CGI启动子都变得更加明显。这些结果表明，TSS上游的NDR和TSS下游的定位核小体强烈预测表达水平，并表明CGI和非CGI启动子的表观遗传调控相似。

NOMe-seq揭示了特定启动子类型的不同染色质构型

我们检测了CTCF位点的核小体占有率和甲基化模式，以及特定启动子分类(图3;Hawkins等人，2010年)，以及其他基因组区域，包括增强子和内含子/外显子边界（补充图S6、S7）。有趣的是，DNA甲基化和核小体占据在CTCF位点周围是强反相关的，因此DNA甲基化在核小体之间的连接区达到峰值(图3A; 补充图S5）。为了检测这种相关性是否是细胞类型特异性的，我们在胶质母细胞瘤肿瘤（157和248）的两种原代培养物中进行了NOMe-seq，发现这些细胞中的CTCF位点的DNA甲基化和核小体定位也不相关(图3A). 在启动子处，核小体占有率和DNA甲基化与转录潜能一致(图3B)：H3K4me3标记（活性）启动子未甲基化，TSS上游有一个明显的NDR，TSS下游至少有四个核小体，而H3K27me3标记的（抑制）启动子没有甲基化，但核小体被占据，如M.CviPI不可接近所示。DNA甲基化（沉默）启动子完全被核小体占据。NOMe-seq能够在单个实验中区分这三种重要且不同的启动子结构。令人惊讶的是，在H3K4me3标记的启动子的TSS上游有一个DNA甲基化的“突起”，我们发现这是由于M.CviPI的“非靶向”活性，并且只影响从胞嘧啶获得的内源性甲基化信息，而胞嘧啶之前的另一个胞嘧啶位于M.CviP1可及性峰值区域。通过消除CCG（补充图S8；补充材料）可以完全消除该伪影，未来的分析方法可以更好地调整已知的离目标活动率。

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NOMe-seq揭示了CTCF位点上不同的染色质配置，并与特定组蛋白修饰和启动子类型相关。(A类)NOMe-seq在IMR90和GBM细胞中的CTCF位点显示出非甲基化NDR，其特征是CTCF部位本身的不可接近性达到峰值。定位良好的核小体位于CTCF位点两侧，DNA甲基化在核小体之间达到峰值。0表示CTCF结合基序的中间。CTCF结合位点来自GSM935404标准. (B类)NOMe-seq区分了IMR90细胞启动子处的三种主要启动子状态——活性H3K4me3标记的启动子未甲基化，包含NDR上游和TSS后位置良好的核小体。TSS显示在x个-轴设置为0。抑制/平衡H3K27me3标记的启动子未甲基化，核小体被占据。甲基化启动子被核小体占据。这个年-轴表示M.CviPI不可接近性（1-CpG；teal）和CpG甲基化水平。(C类)在IMR90细胞中，CpG岛启动子的特征是缺乏CpG甲基化、上游NDR和TSS后定位良好的核小体。大多数CpG岛启动子是非甲基化的（11165），并显示相同的模式，而甲基化的CpG岛屿启动子（781）是核小体占据的，M.CviPI无法访问。(D类)非CpG岛启动子通常以CpG甲基化和不可接近M.CviPI为特征，表明核小体占据。少数非甲基化非CpG岛启动子（1397）在TSS上游的核小体耗尽，而大多数非CpG-岛启动子是核小体占用的，M.CviPI无法访问。在teal中绘制M.CviPI不可接近性（1-GCH），在黑色中绘制CpG甲基化（CGH）。

接下来我们研究了CGI和非CGI启动子的染色质构型(图3C、D; 补充图S7A，B）。总的来说，CGI启动子在TSS附近的胞嘧啶甲基化水平较低（相对于离TSS 1 kb），TSS上游的NDR明显，TSS下游的核小体位置良好。将CGI启动子分离为甲基化和非甲基化的启动子表明，CGI启动程序模式主要由非甲基化CGI启动子驱动，少数甲基化的CGI启动因子被核小体占据。将非CGI启动子分离为甲基化和非甲基化的启动子表明，相对较少的未甲基化的非CGI发起子在TSS上游也有NDR，在TSS下游也有核小体，而更常见的甲基化非CGI的启动子被核小体占据。

为了证明NOMe-seq的可重复性，我们对两种胶质母细胞瘤（GBM）原代细胞培养物进行了测序，并在GBM细胞中的启动子和增强子处发现了与在IMR90细胞中相似的核小体定位模式（补充图S7）。使用统计测试来识别TSS附近的NDR（参见方法），我们发现CGI启动子的所有样本之间高度一致；两个GBM的NDR分别为90%重叠，88%和91%与IMR90重叠（补充图S7C）。许多对细胞功能至关重要的基因（即管家基因）具有CGI启动子；因此，GBM和IMR90细胞之间如此显著的重叠并不奇怪。尽管如此，在两个GBM中偶然获得NDR 90%重叠的概率是10−518使用超几何测试。我们发现非CGI启动子在细胞类型之间的重叠显著减少，这与非CGI基因的更大细胞类型特异性一致。在这些基因启动子中，两个GBM样本重叠了58%，而它们分别重叠了43%和47%的IMR90。

组合表观基因组特征揭示功能染色质

与用于评估核小体占有率或DNA甲基化的任何其他方法不同，NOMe-seq包括单个DNA链的核小体定位和DNA甲基化数据，从而在单分子水平上实现这两个特征之间的关联。由于单个细胞或样本中不同细胞亚群的两个等位基因上可能存在不同的染色质状态，因此我们预计单个分子上的两个标记组合将产生比细胞群平均水平更多的信息。为了研究这一点，我们计算了作为DNA甲基化状态函数的基因组元件周围的核小体保护模式，首先使用基因组中相同位置的任何读数的群体平均值中的甲基化信息(图4A–C，左面板），然后仅使用相同读取的甲基化状态(图4A-C，右侧面板）。我们研究的一些调控元件，例如带有预测AP-1结合基序的序列，具有可见的NDR，但在群体平均值之间几乎没有差异(图4A，左）和读取中的平均值(图4A，右侧）。这些元素表明整个细胞群体中特定染色质状态的一致性。我们研究的其他元素，例如在IMR90细胞中注释为DNase超敏增强子的元素(Hawkins等人，2010年)，在DNA甲基化和个体阅读中的可及性之间的相关性比在阅读群体中的相关性强得多，这表明在样本中的细胞子集或等位基因中存在组合染色质特征(图4B).

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组合表观基因组特征揭示了功能染色质。(A–C)核小体占用水平（“GpCs保护百分比”）由附近CpGs的甲基化状态分层显示（20 bp以内）。对于每种元素类型，该分析在覆盖与GpC相同基因组位置的所有读数中随机进行两次采样(左边标记为“跨所有读取”的图），第二次仅使用相同读取的甲基化状态(正确的图，标记为“同一读数”）（参见方法）。所有三个例子都表明核小体耗竭主要与非甲基化状态有关，但同时预测了AP-1结合基序(A类)在以相反的K4me3和meC标记的群体和内部阅读资料、增强子和启动子中显示这一点(B、 C类)仅在内部读取分析中显示此关联。0表示AP-1结合基序的中心(A类)，DNA酶HS在K4me1标记区域内的峰值(B类)和TSS(C类). (D类)通过在IMR90细胞中搜索TSS区域中至少两个具有相反染色质图谱的读数来寻找不同染色质等位基因（DCA）的搜索策略。(E类)核小体缺失和非甲基化以及核小体占据和甲基化中存在的启动子在X染色体上富集。742个DCA基因与742个随机基因组进行了比较，共进行了1000次试验，并显示了每条染色体上的数量的标准偏差。A类P（P）-该值由X染色体通过二项检验确定，概率由随机试验确定。(F类)将DCA基因与1000个随机基因集进行比较，以确定50kb内已知印迹基因的数量。

为了研究我们是否可以在可能是单等位基因的区域内检测到组合染色质特征，我们将同样的方法应用于IMR90细胞中被鉴定为同时具有DNA甲基化和H3K4me3标记的基因启动子(图4C;Hawkins等人，2010年). 这两种状态在启动子上通常是拮抗的，这表明它们可能存在于同一细胞中的两个不同等位基因上，特别是在IMR90这样的遗传雌性细胞系中。交叉阅读与内阅读的比较表明，当所有阅读平均时，甲基化和核小体占有率之间的任何相关性都会丢失(图4C，左），但在查看内部读取相关性时很清楚(图4C，右侧）。为了测试我们是否可以利用这种内读相关性来识别等位基因特异区域，我们搜索了所有启动子（TSS的−150到+100 bp），以寻找两种相反的染色质构象的组合(图4D)一种含有非甲基化CpG，无核小体保护（等位基因1），另一种含有甲基化Cp G和核小体防护（等位蛋白2）。我们发现742个启动子区域符合“差异染色质等位基因”（DCA）标准，其中201个定位于X染色体（27%的DCA启动子与2.7%的全基因组启动子相比）(图4E). 18个DCA启动子与58个已知印迹基因中的一个相关(网址：http://www.geneimprint.org/)相比之下，随机选择的启动子组中平均有四个启动子(图4F). 为了验证我们的全基因组研究结果，我们对一个X-连锁基因进行了定位NOMe-seq分析(DLG3（数据链路3）)，一个印记基因(SRNPN公司)和一个新鉴定的DCA启动子(ZNF597型)最近有人建议将其印在(图5;Choufani等人，2011年;Nakabayashi等人，2011年). 我们的结果清楚地表明存在两种不同的染色质结构。我们进一步显示，与GBM和IMR90样本中共享的DCA等位基因数量相比，两个GBM样本之间的DCA等位基因重叠更多（补充图S9）。将来自单个DNA链的DNA甲基化和核小体定位信息结合起来，可以识别几个以前没有描述过的单等位基因，我们预计增加测序深度将大大提高我们对这些区域的敏感性。

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DCA启动子的验证。PCR扩增子被克隆，几个克隆被测序，以显示印迹基因的两种不同染色质构型，SNRPN公司(A类)和一个X连锁位点，DLG3（数据链路3）(B类)和一个新鉴定的DCA基因，ZNF597型(C类). CpG位点的（黑色）DNA甲基化；（teal）GpC可访问性。粉色条表示核小体的位置。

讨论

使用一种新的方法来检测核小体占有率和全基因组内源性DNA甲基化，我们在各种启动子和非启动子区域足迹染色质结构。我们发现TSS上游的NDR可以容纳多个核小体，并指示CGI和非CGI启动子的表达水平。我们进一步表明，核小体占有率和DNA甲基化之间的关系取决于基因组位置，并且DNA甲基化和核小体信息在同一DNA链中的结合可以促进单等位染色质模式的鉴定。重要的是，我们表明NOMe-seq可以区分启动子激活（H3K4me3，meC-，NDR+）、抑制/平衡（H3K27me3，meC-，NDR-）和沉默（meC+，NDR-）中发现的三种主要染色质状态。在单个实验中区分这三种启动子结构的能力，更不用说单个分子了，为表观基因组作图提供了巨大的希望。

传统上，核小体定位的全基因组作图是使用MNase-seq或H3-ChIP-seq完成的，这依赖于DNA断裂。FAIRE-seq依赖于核小体缺失区对DNA断裂的敏感性增强(Giresi等人，2007年;Nagy和Price 2009). 而不是使用核酸酶，甲基转移酶为基础的足迹，与CpG甲基转移酶M.SssI(Gal-Yam等人，2006年;Lin等人，2007年;Bouazoune等人，2009年;Kelly等人，2010年)或GpC甲基转移酶M.CviPI(Kelly等人，2010年;Wolff等人，2010年;Andreu-Vieyra等人，2011年;Taberlay等人，2011年;You等人，2011年)，使用DNA上的生化标记（即甲基化）来评估核小体的占有率。由于GpC二核苷酸不是内源性甲基化的，NOMe-seq在同一条DNA链中提供核小体定位和DNA甲基化。此外，由于NOMe-seq信号被解释为百分比对于给定位置的测序读数，它提供了一种标准化和无扭曲的测量，不依赖于映射到特定基因组位点的读数数量，因此是一种评估核小体占有率的独立方法，可以补充和验证已建立的富集方法的结果。

使用MNase-seq结合来自亚硫酸氢盐测序文库的DNA甲基化信息，先前的工作发现核小体DNA优先甲基化(Chodavarapu等人，2010年). 虽然这对大多数基因组来说都是事实，但特定类型的元素并不符合全基因组的趋势。例如，CTCF位点周围的核小体未甲基化，而核小体之间的连接区甲基化，这表明了一类功能重要的染色质之间的新关系。

活性基因的一个特征是TSS上游存在NDR。先前的工作发现活性组蛋白标记的水平与表达水平相关(Barski等人，2007年)；然而，核小体占有率本身并没有被测量，TSS上游区域的核小体似乎同样耗尽，无论转录水平如何。在这里，我们表明NDR在更高表达的基因中更为显著。重要的是，CGI和非CGI启动子的表达和核小体耗竭之间的这种相关性是相似的，这表明至少表观遗传基因调控的一些关键方面在CGI和非CGI启动因子之间是共享的。此外，我们的结果表明NDR足够大，可以容纳多个核小体。以前的研究无法根据表达检测出细微的核小体耗竭差异，并且低估了NDR大小，这可能反映了超声波作用产生的碎片大小的变化，并强调了染色质组织的微妙之处，这些细微之处可以通过NOMe-seq识别，但在以前的研究中被忽视了。

全基因组NOMe-seq是一种新的方法，它可以追踪核小体的占有率，同时保留DNA甲基化信息，以识别包括启动子、增强子和绝缘体在内的多种基因组区域的染色质结构。同一分子上这两个表观遗传标记的组合可以在细胞或等位基因的混合群体中识别组合图谱，其灵敏度高于分离的两个标记。由这些组合表观基因组图谱生成的表观遗传景观对生物学具有若干重要意义，特别是在分析包含多种细胞类型的复杂组织时。此外，随着染色质重塑复合物突变与癌症的关系越来越密切(威尔逊和罗伯茨2011)全基因组NOMe-seq是解决这些突变对核小体位置和DNA甲基化的影响的理想方法，可以进一步研究染色质重塑缺陷是否依赖于DNA甲基化状态。

方法

细胞培养

根据ATCC的建议培养IMR90细胞。如前所述培养原代GBM细胞(Laks等人，2009年). 简言之，神经球培养基中含有补充B27（GIBCO）、bFGF（20 ng/mL，R&D Systems Inc.）、表皮生长因子（EGF；50 ng/mL、Peprotech）、青霉素/链霉素（1%，Invitrogen）和肝素（5μg/mL，Sigma-Aldrich）的DMEM/F12。每隔3或4天向培养基中添加肝素、bFGF和EGF。在与TrypLE Express（Invitrogen）分离后，每隔7至14天对球体进行传代。

核小体足迹

NOMe-seq是我们甲基化依赖性单启动子分析的改进版(Miranda等人，2010年). 如前所述，从IMR90细胞（ATCC）中分离细胞核(Miranda等人，2010年). 以前使用特定于本地的NOMe-seq的出版物使用了最小数量的M.CviPI，从而实现了特定关注区域的最佳足迹：100个单位(Wolff等人，2010年)，200台(Taberlay等人，2011年;You等人，2011年)，或200+100个单位(Andreu-Vieyra等人，2011年). 由于全基因组NOMe-seq需要各种基因组区域的精确足迹，因此我们进行了剂量-反应曲线(图1; 补充图S1）；细胞核与100或200单位的GpC甲基转移酶（M.CviPI）孵育S公司-腺苷蛋氨酸（SAM）在37°C下15分钟，或200单位GpC甲基转移酶（M.CviPI）和SAM在37°C下7.5分钟，然后再增加100单位M.CviP1和SAM 7.5分钟。对于全基因组NOMe-seq，文库是从与200单位Gp C甲基转移物（M.CviPI）孵育的细胞核中生成的和SAM在37°C下持续7.5分钟，然后增加100个单位的M.CviPI和SAM，持续7.5分钟。停止反应，提取DNA并转化亚硫酸氢，以区分甲基化和非甲基化Cs。对于感兴趣的单个区域，使用不包含任何CpG或GpC二核苷酸的PCR引物进行PCR，然后进行TA克隆和测序。PCR引物序列可根据要求提供。

图书馆建设和排序

对于NOMe-seq，如前所述，从5 ug DNA制备文库(李斯特等人，2009年;Kelly等人，2010年;Berman等人，2012年). 简言之，M.CviPI处理的DNA被片段化为～200-bp片段、END-重配对（Epicenter）、甲基化适配器连接（Illumina）、亚硫酸氢盐转化（Zymo-EZ DNA甲基化），并进行PCR。根据Illumina协议生成簇，并使用76-bp单端配置在Illuminia Hi-seq 2000上对产生的库进行测序。除了使用Illumina Hi-seq 2000 Paired-End协议进行测序外，每个胶质母细胞瘤样本都使用相同的方法进行测序。基础调用由Illumina实时分析（RTA）软件执行，共产生118万次读取，通过Illumina质量过滤器（IMR90）。GBM培养物#157用一条50 bp成对末端的泳道（3.1亿次读取）和一条100 bp成对末端的泳道（2.91亿次读取）进行测序，而培养物#248用一条50 bp成对末端的泳道（3.13亿次读取）和一条100 bp成对末端的泳道（3.01亿次读取）进行测序（补充表S4）。

CG和GC甲基化水平的序列比对和提取

基因组比对和亚硫酸氢盐序列分析基本上如前所述(Berman等人，2012年)，对配对测序进行了一些调整。对于单端IMR90库，MAQ(Li等人，2008年)与“-c”亚硫酸氢盐模式一起使用（如Berman等人，2012年)，对于配对的GBM库，BSMAP(Xi和Li 2009)被使用。IMR90读数与NCBI参考基因组hg18对齐，GBM序列与hg19对齐。筛选出绘图质量低于30的基因组比对，结果是6.78亿次读取（IMR90）、5.87亿次读取量（GBM#157）和6.91亿次读取数（GBM#248）。对于IMR90和GBM细胞，我们删除了从与另一个读取完全相同的基因组位置开始的读取（PCR“重复”读取），得出IMR90的总计1.56亿个可分析读取（11.8千兆字节）。对于GBM配对端，我们还删除了未“正确配对”的读数（映射到彼此500bp内的相对链），GBM#157共产生4.62亿个可分析读数（34.0千兆碱基），GBM#248共产生4.92亿个可分析读数（36.4千兆碱基）。

在亚硫酸氢盐测序数据中很难或不可能区分C到T单核苷酸多态性，但我们的Illumina协议仅从两条链中的一条恢复亚硫酸氢数据（无论互补胞嘧啶是否甲基化，与胞嘧啶互补的G残基都被读作G）。对于这种“定向”亚硫酸氢盐文库协议，胞嘧啶位置在序列上显示为C或T，这取决于亚硫酸氢转换，而C对侧链上的互补G仅显示为G(Krueger等人，2012年). 因此，我们指的是与给定胞嘧啶位置相关的两条链——“亚硫酸氢盐C链”（BCS）和“基因型G链”（GGS）。基因型G链因此被命名，因为它揭示了该位置的真实基因型，不受亚硫酸氢盐转化的影响。由于Hi-Seq配对序列的特殊性，配对序列的第二个末端始终是BCS序列的反向补码，必须在分析之前进行反向补码才能获得真正的BCS序列。

如果至少90%映射到BSC链的读码为C或T，我们只包括参考基因组中存在的胞嘧啶，这至少包括三个读码。此外，我们只包括90%映射到GGS的读取为G的胞嘧啶（任何其他碱基都表示遗传变异；重要的是，只有GGS链才能揭示可能导致错误甲基化调用的C>T转换）。使用相同的标准确定胞嘧啶位于特定的XCX三核苷酸上下文中，例如，仅当90%的读取为g（前一个碱基）和90%的读取是A、C或T（IUPAC“H”符号包括A、C、T）时，才包括GCH位置。BCS链上的读取按上述方式处理，即C或T可以匹配“X”上下文位置中的C。该方法用于测定本研究中讨论的以下三核苷酸：HCG（H包括A、C或T）、GCG、WCG（W包括A或T）和GCH。

如中所示Berman等人（2012），我们过滤出具有明显亚硫酸氢不转换的读取的5′端，这在Illumina协议中很常见，可能是因为甲基化的适配器序列附近的碱基对重新退火，因此具有100%的碱基互补性(Hansen等人，2011年;Berman等人，2012年). 我们通过从测序读数的5′处向内走，忽略任何未转换的胞嘧啶（在任何序列上下文中），直到遇到第一个转换的胞苷，从而实现这一点。从这一点和读数中的所有3′位置，我们将所有转化和未转化的胞嘧啶纳入甲基化计数。

对于所有下游分析，我们包括CCG三核苷酸，尽管描述的M.CviPI活性轻微偏离目标，仅影响CG甲基化信息。因此，甲基化平均值包括所有HCG三核苷酸。唯一的例外是内读组合图(图4)，其中被平均的大量数据点允许我们排除CCG并仅使用WCG三核苷酸（W:A，T）。

基因组元件平均剖面图

从感兴趣的基因组标记周围区域（启动子、CTCF位点等）提取甲基化值，并在所有图的20 bp移动窗口内平均所有甲基化值（平均值中不包括没有正确类型胞嘧啶的基因组位置）。之所以选择20 bp，是因为它小于基因组中相邻GC之间的平均距离，并且能够清楚地解析核小体相位/定位（如CTCF比对所示）。

启动子位置、染色质标记和表达值取自先前参考的补充表7（mmc6.xls）(Hawkins等人，2010年; 地理标识GSE16256标准). 具有H3K4me1+/H3K4me3−图谱的增强子取自同一参考文献的补充表12（mmc11.xls）(Hawkins等人，2010年; 地理标识GSE16256标准). IMR90 DNA酶超敏反应数据来自GEO IDGSM468792标准神经前体细胞的组蛋白和EP300（也称为p300）位置取自第二个参考(Rada Iglesias等人2011). H3K27me3富集区是指GEO记录中以“R”（代表区域）开头的元素GSM602301型，而EP300呼叫来自GEO记录GSM602299.H3K4me3标记未包含在GEO中，由Alvaro Rada-Iglesias提供（可根据要求提供）。对于CpG岛和非CpG岛屿启动子，我们使用Takai-Jones定义(Takai和Jones 2002). 对于CTCF注释，我们使用进化上保守的CTCF结合基序(Xie等人，2007年)在体内与任一HeLa细胞结合(Kim等人，2007年)或CD4+T细胞(图2B,​、3A、，3A级，GBM；Cuddapah等人，2009年)以及从GEO记录的IMR90单元格中使用ChIP-seq获得的数据GSM935404标准(图3A，IMR90）。我们删除了约10%的这些位于已知TSS 2kb范围内的站点。我们的最终集合包含8722个非驱动CTCF位点（补充表S2）。

启动子核小体缺失区检测

启动子核小体缺失区域的鉴定（补充图S7）如下：独立考虑UCSC KnownGenes轨迹中的每个独特TSS。收集与候选NDR区域（-100到+50 bp）重叠的所有测序读数，并对每次读数进行GCH分析。每个重叠读数上的每一个GCH都被视为一个独立的核小体保护测量值，只有那些基础质量分数大于10的人被包括在内。具有10个或更少这样的数据点的TSS作为序列覆盖不足的区域从分析中移除。该覆盖过滤器分别去除了IMR90中41054个hg18 TSS中的27312个（66%），以及GBM培养物#157和#248中41017个hg19 TSS中6225个（15%）和4009个（10%）。对于每个样本，将候选NDR区域内这些独立GCH测量值的甲基化频率与候选-100至+50 bp区域上游4 kb和下游4 kb附近的频率进行比较。我们使用单尾二项检验来测试候选NDR区域中GCH甲基化的频率是否为较高的（即核小体保护更少）。二项式检验结果为P（P）-值，分别针对每个样本中的多个假设（Benjamini-Hochberg）进行校正，使用通过该特定样本中初始覆盖过滤器的TSS数量作为假设数量。所有TSS、候选NDR和周围区域的甲基化频率以及原始和校正的列表P（P）-每个样品的数值见补充表S5-S7。

三个样本的NDR调用和组蛋白标记之间的交叉点（补充图S7中的维恩图）生成如下：给定维恩图所考虑的TSS的“宇宙”仅包括那些通过交叉点中所有样本的覆盖过滤器的TSS，即补充图S7C，仅包括所有三种细胞类型所涵盖的12424个TSS，而在补充图S7D中，仅包括两个GBM样本所涵盖的33425个TSS；我们考虑了该子集中所有组蛋白标记的TSS。

组合表观基因特征

根据DNA甲基化状态分层的核小体保护比较（来自GCH）(图4)如下所示：对TSS（或所列其他元素）1 kb范围内参考基因组中的每个GCH进行独立评估。对于每个这样的基因组位置，分析每个亚硫酸氢盐C链的读映射与“附近”CG的读关联。上游或下游20 bp范围内的每个WCG被视为“附近”（选择为可以解决核小体定位的距离）。如果附近的WCG甲基化，则读取的GCH甲基化值被分层到“甲基化”bin（图4)；同样，附近CG未甲基化的读数也进入了未甲基化垃圾桶(图4，蓝线）。如果单个GCH在多个CG的20 bp范围内，则每次读取的多个CGs中的每个CG的甲基化值作为独立观察值进入适当的（甲基化或非甲基化）仓位。

要在右侧绘图中生成绘图图4A（标记为“同读”），这些甲基化和非甲基化GCH基因座在所有基因组元件中平均，得出甲基化（红色）和非甲基（蓝色）基因座的两个平均GC图谱。对于左侧绘图（标记为“所有读取”），除了“附近”的CG甲基化值是从随机选择的读取映射到同一位置，而不是与GC相同的读取之外，整个分析都以相同的方式进行。通常，多次读取重叠在同一位置，但我们只随机选择一次读取，以保持观察数与“相同读取”条件相同，从而消除了两个条件之间差异的任何可能影响。

发散染色质等位基因启动子检测

带有“发散染色质等位基因”启动子的鉴定(图4; 补充图S9）的执行如下：我们只统计了含有两个或更多GCH和两个或多个HCG的读取，每个类别中90%的胞嘧啶是一致的。对于UCSC KnownGenes轨迹中的每个TSS，我们选择了一半以上读数在（−150到+100 bp）范围内的读数。任何至少有一个读取处于“活性”染色质结合状态（CG非甲基化和GC核小体可访问）和另一个读取位于“沉默”状态（CG-甲基化和GC-核小体保护）的基因都被视为DCA基因。将这些落在X染色体上或与印记基因相关的部分与从基因组中随机选取的大小匹配的集合进行比较，如图4图例。

数据访问

面向基因组观众的NOMe-seq跟踪(图2; 补充图S2）可用作补充文件，网址为网址：http://epienome.usc.edu和NCBI基因表达总览（GEO）(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)在加入编号下1823年2月。所有源代码工具都可以在http://sourceforge.net/projects/uecgatk/。有关使用这些工具的说明，请参阅补充材料。IGV查看器新模块用于显示原始BAM校准文件中的NOMe-seq数据的工具和源代码可在IGV项目网站上公开下载，http://www.broadinstitute.org/igv/.

致谢

我们感谢Charlie Nicolet、Selene Tyndale和Helen Truong在生成测序数据方面的支持，感谢Jones实验室和南加州大学表观基因组中心的成员进行了有益的讨论。GBM细胞是加州大学洛杉矶分校人类细胞核心智力和发育障碍研究中心的Harley Kornblum博士慷慨捐赠的。我们还感谢Alvaro Rada-Iglesias和Joanna Wysocka提供NEC ChIP测序数据。这项工作由NCI 5R37CA082422-13向P.A.J.提供资金，T32-CA009320-77和1K99CA160349-01向T.K.K.提供资金，T32向F.D.L.提供CBM培训赠款，Kenneth T.和Eileen L.Norris基金会向Y.L.和B.P.B.提供慷慨支持。计算在南加州大学高性能计算和通信中心进行(http://www.usc.edu/hpcc/).

脚注

[本文有补充材料。]

文章印刷前在网上发布。文章、补充材料和发布日期位于http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.143008.112.

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文章来自基因组研究由以下人员提供冷泉港实验室出版社