家畜TALEN介导的高效基因敲除

摘要

基因敲除或精确改变基因的能力是决定基因功能和基因工程的基础。对于家畜来说，基因敲除策略可以细化异种移植和生物医学产品的性状(1)并被用来制作有价值的人类疾病模型(2). 动物农业中还有更多的目标将受益于基因-KO，包括关联研究中确定的高影响基因的功能特性、工程抗病性、减少人畜共患疾病传播的威胁、改变生产性状和提高动物福利。直到最近，在原代成纤维细胞中进行同源重组（HR），然后进行体细胞核移植，是生产KO猪和牛的唯一方法。然而，用HR方法生成KO细胞系效率低下，家畜妊娠和生殖成熟的时间长度对纯合子基因失活或多基因座工程构成了重大障碍。此外，HR通常需要使用链接的选择标记，这可能会混淆功能研究(三)以及使工程食品的监管审批复杂化。

锌指核酸酶（ZFNs）为生殖系KO提供了一个替代平台。ZFN是由连接到FokI内切酶单体的模块化DNA结合域组成的融合蛋白。当两个ZFN以适当的方向结合目标时，FokI单体可以二聚并引入DNA双链断裂(4). 病变通常通过非同源末端连接（NHEJ）修复，通常导致小的插入或缺失（indels）(5)其中三分之二会导致框架移位，从而禁用编码蛋白。因此，与HR不同，HR通过定向引入选择盒使基因失效，ZFN在不引入外源DNA的情况下使基因失效。在许多模型动物系统中成功地生成了生殖系KO(6)以及猪(7,8). 在牲畜中特别令人兴奋的是报道了ZFN介导的猪的双等位基因KOGGTA1公司使用商用ZFN试剂的基因(9)，其中，由于缺乏GGTA1公司-依赖表面表位。双品牌DNA断裂显著提高HR(10)导致ZFN损伤的同源依赖性修复，从而在人类细胞中实现精确的基因改变(11)、小鼠和大鼠(12,13). 尽管家畜ZFN基因组修饰的潜力很大，但设计和组装需要耗费大量劳动力，并且受到可用靶点的限制(6).

转录激活物样效应器核酸酶（TALENs），如ZFN，由组装的DNA结合基序与FokI核酸酶偶联组成(6,14). 据报道，活性的、定制设计的TALEN可诱导2%至55%的靶染色体indel频率(15,16). 与ZFN一样，TALEN介导的双链断裂也能以与ZFNs相似的水平刺激人类细胞的HR(11,15). 最重要的是，在简单明了的设计和装配策略方面，人才似乎优于ZFN(17)因此，制造有效人才比制造有效的ZFN要便宜得多，速度也快得多。在这里，我们展示了TALEN对家畜基因组进行各种基因组修改的效率和多功能性。我们已经实现了基因的单等位基因和双等位基因的KO以及大规模的染色体重排。最后，为了实现我们制造动脉粥样硬化大动物模型的目标，我们使用TALEN培育了奥斯萨巴夫小型猪(18)含有LDL受体失活等位基因(低密度脂蛋白受体)基因。据我们所知，这篇关于基因工程和克隆这些有价值的生物医学动物的报告是独一无二的，也是TALEN介导的家畜基因改造的独特例子。

结果

家畜胚胎中的人才评估。

我们选择通过在牛和猪的体外受精胚胎中使用TALEN来表征家畜胚胎基因组精确改变的效率。使用+231 TALEN支架生成三对TALEN(17,19) (图1). 在受精后～19小时，将编码每个TALEN-pair的体外转录mRNA注射到牛胚胎（每种情况下≥50个胚胎）的细胞质中，并在体外培养直至囊胚期(表S1). 全基因组扩增（WGA）和基因型分析显示，一个胚泡注射了ACAN11，五个胚泡注入了ACAN12 TALEN(图1B类和表S1); 然而，在indel频率最大（最大indel频率～10%）的情况下，发育明显受损(表S1). 两组报告使用不同的天然TALE蛋白N端和C端截短来增强TALEN活性(15,20). 因此，我们创建了一个截断TALEN支架（GoldyTALEN，GT），与Cermak等人报告的金门克隆程序兼容(17) (图1A类)用于后续实验。使用GT脚手架开发了一个额外的TALEN-pair，GDF83.1。Zygote注射TALEN mRNA加上2 ng/μL EGFP mRNA作为成功注射的指标。通过跨TALEN识别位点的PCR扩增子直接测序对单个囊胚进行指数分析(图S1). GT-GDF83.1 TALENs的突变频率显著高于之前的注射。注射低mRNA剂量（2 ng/μL）的14个囊胚中有6个（43%）表现出indels，但发育率没有显著降低(表S1). 高剂量组（10 ng/μL）的四个囊胚中有三个显示indels，三个突变囊胚中的两个出现双等位基因修饰(图1B类).

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图1。

牛胚胎中的TALEN活性。(A类)胚胎注射用人才在+231或GT支架中产生。每个支架共享一个共同的SV40核定位信号（NLS）和FokI同源二聚体结构域的C端融合。编号与DNA结合域有关；第一个重复变量双重复序列（RVD）前的氨基酸标记为“-1”，最后一个RVD重复序列后的氨基酸标记是“+1”。牛或猪在第1天（D1）用TALEN mRNA注射体外生产的受精卵，并在体外培养成囊胚。在第8天收集单个囊胚（囊胚），进行WGA，并分析indels。(B类)牛（注射ACAN12和GDF83.1）和猪（注射p65-11.1）胚胎中TALEN-mediated indels。上面显示了野生型序列，TALEN结合位点下划线。删除和插入（用“我”和碱基对数量）事件。不匹配的基础由小写文本表示。GDF83.1和p65-11.1胚胎仅显示双等位基因修饰。带有纯合子indel（每个等位基因上的indel相同）的胚胎显示在一个单线上。复合双等位基因胚胎的独立等位基因（两个或多个独特的独立等位基因）显示在多个品系（例如1a、1b）上。一些囊胚部分镶嵌。注射牛GDF83.1 TALEN的胚胎1和胚胎2的序列分析显示，每个胚胎有三个独特的indel等位基因；每个等位基因的读取次数标注在序列的右侧。除indel等位基因外，GDF83.1胚胎1和2分别观察到3和1个野生型序列读取。

还使用针对猪的TALEN对猪受精卵进行了一组注射RELA公司基因(第65页)非洲猪瘟的耐受等位基因已被提出(21). 合子注射混合物，包括20 ng/μL TALEN mRNA和5 ng/μL EGFP mRNA，作为成功注射的指标。与牛注射相比，所有注射EGFP的胚胎都发出荧光，只有35%（214例中的71例）是EGFP⁺56个EGFP的WGA和PCR扩增成功⁺胚胎，其中16个（29%）通过Surveyor分析或序列分析发现indels。三分之一的突变体（16个中的6个）是纯合或杂合双等位基因突变体(图1B类).

TALEN在家畜成纤维细胞中的功能。

尽管我们的体外数据表明，直接胚胎修饰可能是家畜基因组修饰的一种可行方法，但对等位基因进行精确工程的需要促使我们探索培养家畜细胞中TALEN的功能，以实现两个目标：(我)作为注射前组装好的TALEN-pairs的质量控制措施(ii（ii）)开发通过克隆对家畜进行TALEN介导的基因改造的方法。为了确定家畜成纤维细胞的最佳TALEN结构，将6个TALEN-pairs的结合域放置在+231和GT支架的背景下(图1A类). 将每只TALEN-pair转染到原代家畜成纤维细胞中，并在第3天通过Surveyor分析测定基因组修改效率。最活跃的TALEN-pairs，DMDE7.1和ACAN12，显示出38%和25%的切割效率(图2A类). TALEN支架对成纤维细胞核酸酶活性有显著影响。总的来说，靶向GT支架的六个基因座中有四个基因座的裂解率为3.5%或更高，但只有DMDE7.1 TALEN-pair的裂解率高于1%，而GT支架为+231(图2). 如先前研究所述(15,22)，转染后在30°C下培养72小时对家畜成纤维细胞的靶细胞分裂有积极影响。我们将这些发现应用于其他人才项目的设计和测试。总计，36只TALEN-pairs中有23只（64%）在猪和牛基因组（常染色体和性染色体）中分布的15个基因中检测到活性（>1.0%NHEJ）(表S2). 四分之三的活性对以高效率（19-40%NHEJ）裂解，平均25%。

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图2。

家畜成纤维细胞基因编辑用TALEN支架的比较。(A类)Surveyor分析是在转染DMDE7.1或ACAN12 TALEN-pairs的转染成纤维细胞上进行的。凝胶上方显示了支架和温度处理，下面显示了NHEJ的百分比。NT，未经治疗。(B类)在30或37°C温度下，使用+231或GT脚手架（每个矩阵中的左栏），在每个矩阵的底部确定另外四名人才的活动。

转座子共转染的扩展培养和索引富集。

一个理想的克隆资源是细胞群体，其中大多数细胞含有在长时间培养中保持稳定的吲哚。尽管平均基因组修饰水平为25%（即，～44%的细胞至少有一个修饰的等位基因表1)对于细胞群体的直接体细胞核转移是合理的，富集修饰细胞或分离特定修饰克隆的方法是有用的。为此，我们评估了长时间培养后含indel细胞的稳定性，并测试了基于转座子共选的indel富集策略(23). 为了将这种方法应用于TALEN-gene修饰睡美人将携带选择标记的转座子和SB100X转座酶以1:5的比例添加到TALEN编码质粒的转染中。瞬时TALEN表达和转座子整合只能发生在成功转染的细胞中，从而为转染细胞的富集提供了一种机制。此外，选择是在原代成纤维细胞中进行克隆分离的一种极其可靠的方法，这种细胞类型反对低培养密度和稀释克隆(24).

表1。

成纤维细胞克隆的基因型分布

TALEN-pair公司		%NHEJ第3天（测量员）	预测的%mod克隆	预测%双等位基因mod	观察到的mod克隆（%）	观察到的双等位基因mod（%）
低密度脂蛋白胆固醇2.1	清管器♂	19	34.5	10.5	30/81 (37)	5/26 (19)
低密度脂蛋白胆固醇2.1	清管器♀	21.5	38.3	12	23/76 (30)	8/23 (35)*
低密度脂蛋白胆固醇2.1	清管器♂	14.4	26.7	7.7	12/94 (13)	2/12 (≥17)†
LDLRE2.1-2x型‡	清管器	19.7	35.5	10.9	8/24 (33)	2/8 (≥25)†
LDLRE4.2型	清管器♂	20	36	11.1	4/48 (8.3)	1/4(25)†
LDLRE4.2型	清管器♀	19	34.4	10	8/47 (17)	0/8†
二甲基二苯醚（DMDE6）	清管器	25	43.8	15.6	17/35 (49)	-
DMDE7.1标准	清管器	27	47	15.6	12/29 (41)	3/10 (30)
DMDE7.1-2x型‡	清管器	22	39.2	12.4	22/41 (54)	7/22 (≥32)*†
GHRHR2.3号文件	清管器	29	50	17	26/43 (60)	15/26 (≥58)*§
ACAN12号机组	奶牛	29	50	17	27/35 (77)	2/6（不适用）¶
btGDF83.1型	奶牛	17	31	9.3	7/24 (29)	0/7

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如果染色体修饰是一个独立的事件，那么双等位基因修饰的频率可以通过以下等式预测：双等位=（第3天%NHEJ）²在相同的假设下，单等位基因修饰（mod）可以通过以下等式进行预测：单等位修饰=（第3天%NHEJ×2）×（第1天3%NHEJ）。通过对上述等式得出的单等位基因和双等位基因修饰比例求和，计算出预期的%mod克隆（单等位和双等位基因）。

*95%的置信区间超过了预期的双寡核苷酸-完整假设，即每个染色体的分裂和修复都是一个独立事件。

^†通过PCR产物测序鉴定双等位基因KO。使用这种技术只能识别重叠或纯合缺失。

^‡用相同的TALEN-pair转染成纤维细胞并在2周内恢复两次。

^§15个双等位基因群体中有5个被确认为双移码等位基因。

^¶只分析PCR扩增子中存在明显粗缺失的菌落。

我们首先评估了与Mirus LT1（一种常用的阳离子脂质转染试剂）的共转染。尽管在未经选择的情况下，基因修饰在转染后14天低于检测水平，但DMD7.1、DMD6和LDLR2.1 TALEN-pairs转座选择群体的基因组修饰水平分别为31%、13%和20%(图3). 因此，尽管阳离子脂质的转染效率较低（本实验小于5%），但可以使用转座子共选实现有效的修饰。接下来，我们将转座子共选应用于通过核感染转染的细胞，其中>90%的转染效率是常规的。在没有选择的情况下，培养14天后修饰细胞的比例比第3天测得的水平低50-90%，表明修饰细胞的磨损。相反，转座子共选在所有情况下都能有效维持通过核感染转染的修饰细胞，但除ACAN12外，并没有显著增加修饰细胞的频率(图3C类). 因此，转座共选在转染效率低时是一种有效的富集方法，在转染率高时是一个有效的维持方法。

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图3。

吲哚富集的转座子共选。(A类)实验时间表。第0天（D0），用质粒混合物转染细胞，包括每个TALEN的表达盒、编码选择标记的转座子和转座酶表达盒。转染细胞在30或37°C培养3d，然后分裂，收集样本用于Surveyor分析，并重新进行扩展培养，有或没有选择转座子整合。收集培养14+d的细胞用于Surveyor分析。(B类)使用Mirus LT1试剂转染成纤维细胞，并对第14天的人群进行Surveyor分析。温度处理、选择和人才识别（由单个字母（A、B和C）标识，如C类如凝胶上方所示。(C类)通过核感染转染成纤维细胞，在第3天、第14天非选择性（NS）和选择性（S）人群中测量NHEJ百分比。温度处理显示在每个基体的上方。ND，未检测到；WT、野生型扩增子、测量员处理。

TALEN染色体缺失和反转。

接下来，我们研究了以同一染色体为靶点的两个TALEN-pairs同时给药是否会导致大的染色体缺失或反转。我们选择TALEN-pairs DMDE6和DMDE7.1，因为Duchene肌营养不良的比例很高(DMD公司)是由总删除量引起的(25)提供了在猪模型中模拟人类条件的机会。每个TALEN-pair在第3天的基因修饰水平都很高（DMDE6为24%，DMDE7.1为23%），尽管比单独转染任一TALEN-pair时略低(图4B类). 为了确定两个TALEN对之间的序列是否被删除，我们设计了跨越该区域的PCR引物。如果去掉6.5-kb序列，我们预计PCR产物为～500 bp。在引入两个TALEN-pair的复制品中观察到一个约500 bp的片段，但在单独引入任一TALEN-pair时，该片段不存在(图4C类). 接下来，我们通过PCR扩增假定的新5′-和3′-连接来分析细胞群体的反转事件。在预测反转的5′-和3′-结的预期尺寸下观察到产物，但只有在引入两个TALEN-pairs时(图4D类). 缺失和反转事件均在相对较高的频率下恢复（分别为10.3%和4.1%；n个> 1,000) (表S3)在使用转座子共选策略生成的群体中。缺失和反转事件发生得非常准确，43个假定的反转阳性克隆中有41个（95%）通过5′-和3′-连接的PCR扩增得到证实。PCR产物的测序证实了在连接处添加或删除极少数核苷酸的缺失和反转事件(图S3).

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图4。

TALEN诱导的删除和反转。(A类)DMD公司轨迹。转录方向由内含子6中的黑色V字形表示。(B类)同时转染TALENs靶向外显子6和7的细胞的Surveyor分析显示NHEJ indels位于两个位点。(C类)当同时引入第6外显子和第7外显子TALEN时，带有推定缺失侧翼引物（黑色箭头）的PCR产生约500bp的产物，但当单独转染时不会。(D类)TALEN靶点之间序列反转事件的预测结果。显示了位于反转位点5′端和3′端的假定侧翼位点两侧的引物（黑色箭头）以及预测的产物大小。只有当同时引入外显子6和外显子7 TALEN时，才能在5′-和3′-连接处观察到PCR产物。

通过克隆生产TALEN改良猪。

在证明了体外高效产生敲除、总缺失和反转的能力后，我们接下来试图检验TALEN修饰猪细胞在动物生产中的效用。转座子与Ossabaw猪群共选，对其A类结构域1进行单等位基因和双等位基因修饰低密度脂蛋白受体基因集合不成比例A类4种基因型；水塘B类三种基因型；水塘C类，5种基因型）并通过染色质转移进行克隆(26). 九次转移中有七次确定怀孕（水池中有两次转移中的一次A类游泳池三分之二B类游泳池四分之四C类). 六次妊娠一直持续到足月，共产下18头活产仔猪，其中一头死产A类九只健康的小猪和两只死产的小猪B类八头健康的小猪，一头死产，一头因克隆缺陷被安乐死C类(图5A类). 60多天时，17只小猪保持健康。共有八种菌落基因型中的四种B类和C类克隆的后代中有10头。11头仔猪中有10只来自池塘B类携带双等位基因修饰低密度脂蛋白受体（B1）(图5)来源于一个集落，该集落在一个等位基因中具有插入诱导的框架移位（289_290ins34），在另一个等位基因中具有3-bp缺失（285_287delATG），前者过早地截断了低密度脂蛋白受体ORF，后者清除与家族性高胆固醇血症相关的普遍保守的天冬氨酸残基（D47del）(27,28). 池中的第二个菌落基因型B类在一头死胎仔猪中观察到（B2；211_292del128）。池中仔猪的五种群体基因型中有两种C类，包括289_290del10和289_290 insA，每个都会导致帧移位突变，预期会过早截断低密度脂蛋白受体ORF公司。

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图5。

的基因型低密度脂蛋白受体-击倒奥斯萨博猪。通过克隆和测序跨越LDLR2.1靶位点的扩增子来评估22只克隆仔猪的基因型。对从猪源中分离出的四种不同基因型进行了鉴定并标记为B1和B2B类猪源于C类游泳池。野生型序列如上所示，TALEN识别位点用粗体表示。插入的基础由带下划线的文本表示或用“我“以及碱基对的数量。

讨论

我们对家畜胚胎中TALEN活性的检测产生了一些有趣的结果。首先，只有三分之一的猪受精卵细胞质注射TALEN/EGFP mRNA后，在可检测的水平上发出荧光。尽管这一低比率出乎意料，但其他人也报告了猪卵母细胞EGFP mRNA注射的类似结果(29,30)或向牛受精卵中注入质粒(31). 相反，所有注射EGFP的牛胚胎都会发出荧光。猪和牛在不同的地方注射；因此，我们无法断定这种差异是技术差异还是物种差异造成的。无论如何，我们推测选择EGFP⁺胚胎将是一种有价值的一级富集TALEN修饰胚胎的方法。第二，虽然我们没有直接比较仅基于支架的TALEN效率，但GT-TALEN在家畜受精卵中的活性高于+231支架。与+231注射的受精卵相比，猪和牛注射GT–TALEN-pairs的受精卵中普遍存在双等位基因修饰（修饰胚胎的25%）。最后，在低剂量组和高剂量组中，使用GT-btGDF83.1 TALENs分别在活性（43%对75%的突变囊胚）和发育（24%对8%的胚泡形成率）方面有明显的剂量反应。然而，低剂量和高剂量之间的五倍差异表明，TALEN在大剂量范围内发挥作用，可以在活动和发育之间寻求平衡。因此，我们预测GT-TALEN mRNA的细胞质注射将成为家畜基因改造的有效平台。

虽然合子基因组的直接修改可能有一些优点，但体细胞修改后再克隆也提供了一个显著的优点，即允许在动物生产费用之前分离出含有精确修改的细胞。因此，我们评估了TALEN在原代成纤维细胞（用于克隆的标准细胞类型）基因修饰中的应用。与其他人一致，我们发现截断TALEN支架在原代成纤维细胞的基因修饰方面更优越(15,20). 转染后在30°C培养72 h，TALEN修饰的效率也可以提高(22). 这些增强策略的联合使用导致了TALEN制作的高度成功；64%的合成对在成纤维细胞中具有活性，NHEJ频率为1.8%至40%。假设一个TALEN-pair以平均20%的效率引入NHEJ，仅筛选24个菌落即可回收约5个杂合子KO。

我们的转座子共选择策略(23)在细胞群中，当转染效率低下时，indel-阳性细胞的富集极为成功，而当转染有效时，indeli-阳性细胞得以维持。当使用阳离子脂质转染时，修饰细胞的富集可能是由于去除了未转染细胞，即大于总细胞的95%。然而，共选也能够防止在核感染后14天观察到的TALEN修饰细胞50-90%的丢失。修饰细胞损耗的原因尚不清楚，尽管可能是由于没有选择，转基因表达水平低的细胞比表达水平高的细胞具有生长优势。鉴于协同选择能够丰富和维持修饰细胞，核酸酶的非靶向活性或毒性似乎不太可能(20,32)是消耗的原因。相反，抗生素耐药性的选择可能偏向于高水平的异位基因表达，从而丰富了TALEN表达也较高的细胞，并更有可能发生分裂。转座可能动员与核酸酶裂解双链DNA后修复相关的相同因子。因为转座发生在转染细胞和动物组织细胞中的比例很低(32–34)，共选可能会增加对NHEJ敏感的细胞亚群。

无论通过何种机制，转座子共选择对于单等位基因和双等位基因修饰的TALEN细胞的克隆分离都是非常有效的。事实上，对共选克隆的分析显示，假设每个TALEN诱导的分裂/修复都是独立的事件，双等位基因修饰的频率都超过了预测。用ZFN处理的细胞也观察到了这一发现(11,35,36). 此外，大约三分之二的双等位基因修饰克隆对于同一个indel是纯合的，这表明来自姐妹染色单体的TALEN介导的遗传变化的基因转化是常见的，这是其他人以前观察到的一种偏见(37). 这里观察到的用双等位基因KO生产克隆的效率代表着对传统方法的显著改进，传统方法要求进行品系育种或顺序靶向和重新定位以生产纯合KO动物(38). 核酸酶介导的双等位基因KO的另一个优点是理论上不需要连接的选择标记。例如，当靶基因的表达在细胞表面产生可区分的表位时(9)，通过FACS分选可以分离出含有双等位基因KO的细胞。或者，用非整合报告系统共同转染细胞，可以分离出转染后3d显示核酸酶活性的细胞(39)虽然改良的原代细胞克隆（六个中有两个，都是单等位基因indels）分离效率低，但表明分选细胞的存活率低。相反，转座子共选可以有效分离含有单等位基因和双等位基因indels的稳定细胞，而无需FACS或物理连接的选择标记。在单株繁殖期间，这些有针对性的修饰可以很容易地从单代育种中的选择转座子中分离出来(23).

染色体缺失、反转和拷贝数形式的结构变异是人类遗传变异的重要组成部分(40). 在这项研究中，我们发现，两个靶向同一染色体的TALEN-pair单次共转染可在成纤维细胞中产生大量缺失和反转。猪成纤维细胞中缺失和反转的效率与其他人使用ZFN在永生化人类细胞中产生染色体缺失的效率相似(41,42). 然而，另一些人发现，两个ZFN对的共导入除了期望的重排外，还常常导致意外的染色体重排(42)，我们没有观察到此类事件，可能是因为我们针对的是半合子DMD公司男性细胞中的位点。大多数有用的重排可能发生在常染色体上；因此，创始人系列必须仔细筛选，以避免混淆重排。家畜的染色体重排也可能有超越人类疾病模型的应用。缺失可用于基因簇的功能查询，或用于关联研究中确定的难以捉摸的遗传差异的缺失映射。靶向反转理论上也可以以类似于低等真核生物遗传研究中常用的平衡染色体的方式固定相邻的决定缺陷的等位基因。这一过程可以作为一种手段，为农业目的固定牲畜的一个或多个期望性状，或利用不分离控制转基因基因组的传播。

TALEN与转座子成分的组合对克隆细胞的效用没有明显影响。我们使用单等位基因和双等位基因修饰的Ossabaw成纤维细胞获得了78%的妊娠率，这与我们之前使用转座子转基因长白细胞的结果类似(23). 考虑到奥斯萨巴夫猪是代谢综合征的优良模型，其克隆之前还没有报道，这一结果尤其令人鼓舞。在18个活产克隆中，8个含有单等位基因突变，10个含有双等位基因修饰低密度脂蛋白受体基因。这些结果表明，TALEN可以用于通过克隆产生单等位基因或双等位基因修饰的动物。

TALEN-mediated genome engineering通过引入多种基因组变化，包括KO、双等位基因KO、大染色体缺失/反转以及潜在的精确等位基因渐渗，显然有能力彻底改变家畜物种的遗传学和基因组工程。利用大多数实验室可用的分子生物学技术，可以轻松设计和组装人才。我们预计，它们的易用性和多功能性将迅速扩大家畜基因组工程的领域，用于各种目的。

材料和方法

请参见SI材料和方法了解更多细节和表S4和第5章获取本研究中使用的TALEN和PCR引物的完整列表。所有TALEN均使用TALE-NT软件进行设计，并使用Cermak等人所述的方法进行组装(17)，进行了一些修改。在TALEN组装的最后一步中，生成了四个新的主干质粒来代替pTAL。第一对载体pC-TAL+231和pC-GoldyTALEN直接表达+231(19)和来自迷你Caggs启动子的GoldyTALEN支架(43). 第二对载体RCIscript-TAL+231和RCIscript-GoldyTALEN可用于基于上述pT3Ts载体的TALEN mRNA的体外转录(44). GoldyTALEN载体已通过Addgene提供，并与D.F.V.实验室金门TALEN试剂盒完全兼容，Addgene也可提供该试剂盒（#1000000016）。如前所述，创建中间数组并将其加入这些向量(17).

如前所述，TALEN信使核糖核酸是使用mMessage Machine T3试剂盒（Ambion）从SacI线性化RCICScript载体合成的(44)并以规定浓度注入细胞质。如前所述，使用碱性成纤维细胞核作用试剂盒（Amaxa Biosystems/Lonza）或Mirus LT1试剂盒（Mirus）培养和转染成纤维细胞(44). 通过Surveyor Assay（转基因）分析TALEN活性，并按照Guschin等人(45). 通过Surveyor分析或直接测序在胚胎或单个菌落中检测到指数。中描述的PCR分析SI材料和方法被开发用于检测大的缺失和反转。

补充材料

致谢

脚注

工具书类