糖尿病。2012年11月；61(11): 2679–2690.
尽管肌内脂质水平升高，但周脂素2改善骨骼肌胰岛素敏感性
，1 ，2 ，1 ，1 ，三 ，4 ，1 ，2 ，5 ，6 ，4和1，
马德琳·博斯玛
1荷兰马斯特里赫特马斯特里赫德大学医学中心NUTRIM营养、毒理学和代谢学院人类生物学系
Matthijs K.C.Hesselink公司
2荷兰马斯特里赫特马斯特里赫德大学医学中心NUTRIM营养、毒理学和代谢学院人体运动科学系
劳伦·斯帕克斯
1荷兰马斯特里赫特马斯特里赫德大学医学中心NUTRIM营养、毒理学和代谢学院人类生物学系
西尔维·蒂默斯
1荷兰马斯特里赫特马斯特里赫德大学医学中心NUTRIM营养、毒理学和代谢学院人类生物学系
玛丽亚·若昂·费拉兹
三荷兰阿姆斯特丹学术医学中心医学生物化学系
弗里茨·马蒂森
4荷兰瓦赫宁根大学人类营养部营养、代谢和基因组组
丹尼斯·范·贝尔登
1荷兰马斯特里赫特马斯特里赫德大学医学中心NUTRIM营养、毒理学和代谢学院人类生物学系
格特·沙尔特
2荷兰马斯特里赫特马斯特里赫德大学医学中心NUTRIM营养、毒理学和代谢学院人体运动科学系
马克·德贝茨
5荷兰马斯特里赫特大学医学中心心理健康与神经科学学院神经科学系
K.Verheyen方正
6荷兰马斯特里赫特大学医学中心分子细胞生物学系
桑德·克尔斯滕
4荷兰瓦赫宁根大学人类营养部营养、代谢和基因组组
帕特里克·施劳温
1荷兰马斯特里赫特马斯特里赫德大学医学中心NUTRIM营养、毒理学和代谢学院人类生物学系
1荷兰马斯特里赫特马斯特里赫德大学医学中心NUTRIM营养、毒理学和代谢学院人类生物学系
2荷兰马斯特里赫特马斯特里赫德大学医学中心NUTRIM营养、毒理学和代谢学院人体运动科学系
三荷兰阿姆斯特丹学术医学中心医学生物化学系
4荷兰瓦赫宁根大学人类营养部营养、代谢和基因组组
5荷兰马斯特里赫特大学医学中心心理健康与神经科学学院神经科学系
6荷兰马斯特里赫特大学医学中心分子细胞生物学系
2011年10月7日收到；2012年4月20日验收。
摘要
2型糖尿病的特点是骨骼肌中脂质储存过多。肌细胞内脂质（IMCL）储存过多，超过细胞内需要，导致脂毒性事件，最终导致胰岛素抵抗的发生。脂滴（LD）涂层蛋白可以控制骨骼肌中适当的脂质储存。周脂蛋白2（PLIN2/脂肪分化相关蛋白[ADRP]）是骨骼肌中表达最丰富的LD-coating蛋白之一。在这里，我们通过研究体外PLIN2敲除和体内外过度表达的影响，来研究PLIN2在肌细胞脂质处理和胰岛素敏感性中的作用。PLIN2敲低降低了LD的形成和三酰甘油（TAG）的储存，略微增加了脂肪酸（FA）的氧化，并增加了棕榈酸在二酰甘油和磷脂中的掺入。PLIN2在体外的过度表达增加了细胞内TAG的储存，同时提高了胰岛素敏感性。体内肌肉特异性PLIN2过度表达导致LD积累增加，并减缓高脂饮食诱导的氧化磷酸化（OXPHOS）链亚基蛋白质含量增加。二酰甘油水平不变，而神经酰胺水平增加。尽管IMCL积累增加，PLIN2的过度表达改善了骨骼肌胰岛素敏感性。我们的结论是，PLIN2对骨骼肌中的脂质储存至关重要，因为PLIN2可以增强多余FA向LD中TAG储存的分配，从而减缓脂毒性相关的胰岛素抵抗。
脂滴（LD）在真核细胞中起着重要作用。因此，细胞内脂质水平需要严格控制。事实上，细胞内脂质储存不当会导致细胞功能受损。在肥胖患者中，由于脂肪组织缺乏储存能力，脂类会溢出进入循环，因此，脂类可能会在组织外积聚，包括骨骼肌（肌细胞内脂类[IMCLs]）。这种异位脂肪储存超过细胞内需求，可能导致脂肪中毒事件，包括胰岛素抵抗的发展(1，2). 矛盾的是，在耐力训练的运动员和2型糖尿病患者中，IMCL都增加了(三，4)这表明异位脂肪堆积本身并不导致胰岛素抵抗。
迄今为止，对这一运动员悖论的解释主要集中在脂质周转、氧化能力和脂质中间产物水平上(5–8). 有趣的是，一次运动可以通过将更多脂肪酸（FA）分配给骨骼肌中的三酰甘油（TAG）合成，从而防止脂质诱导的胰岛素抵抗(9). 因此，增加TAG储存库可能会提高胰岛素敏感性。细胞内TAG储存在LD中，LD越来越被认为是动态细胞器。它们由含有TAG、二酰甘油（DAG）、胆固醇酯、视黄醇酯和游离胆固醇的中性脂质核心组成(10)被磷脂单层包围(11)和蛋白质外壳，由多种LD-coating蛋白质组成(12). 越来越多的证据表明，LD-coating蛋白介导LD动力学，包括LD合成、生长和融合、细胞内转运、细胞器相互作用、分解和脂肪分解(13，14).
LD-coating蛋白最具特征的家族是紫苏素（PLIN）蛋白家族，包括PLIN1、PLIN2（脂肪菲利普和脂肪分化相关蛋白[ADRP]）、PLIN3（尾相互作用蛋白，47kDa[TIP47]）、PRIN4（脂肪细胞蛋白S3-12）和PLIN5（OXPAT，脂滴储存蛋白5[LSDP5]）。而PLIN1的表达仅限于脂肪组织，在控制LD的储存和降解方面起着关键作用(15，16)，PLIN2在多个组织中表达，包括肝脏、小肠和骨骼肌(17，18). 骨骼肌中的PLIN2先前显示与IMCL共定位(19). 有趣的是，骨骼肌普林2与肥胖对照组相比，2型糖尿病患者的基因表达较低(20). 此外，体重减轻和二甲双胍治疗均导致IMCL水平降低(21，22)，证明可以增加骨骼肌PLIN2水平，同时改善胰岛素敏感性(23). PLIN2可能通过促进以TAG形式高效储存IMCL而参与防止脂肪毒性。然而，迄今为止，还没有进行功能丧失和功能获得研究，以表征PLIN2在骨骼肌中的功能，这是获得PLIN2对肌肉作用的更多功能洞察力所必需的。在这里，我们旨在研究PLIN2在肌细胞脂肪积累、脂肪毒性和胰岛素敏感性中的作用。
研究设计和方法
细胞培养实验。
C2C12细胞（英国泰丁顿LGC）保存在Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）（荷兰布雷达Invitrogen）中，该培养基含有添加10%FCS的抗生素，生长在细胞外基质（ECM）凝胶涂层（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）细胞培养板上，并在一周的DMEM中加入2%的FCS（差异化媒体）进行差异化。用200–800µmol/L FAs（6–24小时）（与BSA结合的辛酸、油酸或棕榈酸；BSA与FA的比率为1:2.5）或仅用BSA处理细胞作为对照。对于抑制性RNA（RNAi）实验，使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）作为转染试剂，用10 nmol/L隐形RNAi寡核苷酸转染细胞。通过转染pENTR1A-pUC实现PLIN2的过度表达普林2用Lipofectamine-2000（Invitrogen）构建。
脂质代谢。
体外14如前所述测量C-棕榈酸酯代谢(24). 使用Schwartz和Wolins方法测量细胞内甘油三酯水平(25).
动物研究。
向C57Bl6小鼠喂食低脂（10%脂肪能量）或高脂肪饮食（HFD；45%脂肪能量）（荷兰威基比杰杜尔斯泰德研究饮食服务公司）8周。解剖胫骨前（TA）。从Charles River（马萨诸塞州威明顿）购买7周龄雄性Wistar大鼠。给大鼠喂食食物(n个=4）（SSNIFF；荷兰乌登生物服务公司）或HFD(n个=12）（45%的能量来自脂肪，D01060502；研究饮食，新泽西州新不伦瑞克）。马斯特里赫特大学动物护理和使用委员会批准了这些实验。总干预持续3周。开始饮食一周后，对大鼠进行插管，然后进行基因电穿孔和高胰岛素-正常血糖钳夹，其间有一周的恢复期。
电穿孔。
在异氟醚麻醉下，通过体内DNA电穿孔技术实现小鼠PLIN2在大鼠左TA肌肉中的过度表达。左TA肌肉经皮注射75μg pENTR1A-pUC普林2构建，并用空载体注射右侧TA肌肉作为对照。如前所述，在最后一次注射后15 s内，ECM 830电穿孔器（加利福尼亚州圣地亚哥BTX）以1 Hz的频率产生一个800 V/cm的高压脉冲和四个80 V/cm的低压脉冲(27).
高胰岛素-正常血糖钳夹。
如前所述进行夹紧(28). 简言之，禁食6小时后，以13 mU/kg/min的速度持续输注胰岛素120分钟。调整葡萄糖输注速度，使血糖浓度保持在4.5–5.5 mmol/L范围内。大鼠在整个过程中保持清醒。在完成夹钳前45分钟，每公斤140µCi的2-(三H（H）(N个))-脱氧-d日-给予葡萄糖。
脂质种类。
如前所述，测量骨骼肌DAG、TAG和神经酰胺水平(28).
蛋白质斑点。
使用针对PLIN2（德国海德堡Progen）、PLIN3（德国海德堡Santa Cruz）、PLIN 5（Progen），Akt磷酸化（pAkt）和Akt脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）（荷兰莱顿Cell Signaling Technology）、比较基因鉴定58（CGI-58）的抗体进行蛋白质印迹研究（Novus Biologicals，Littleton，CO）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化剂1-α（PGC1α）（Calbiochem，阿姆斯特丹，荷兰）、解偶联蛋白3（UCP3）（由L.J.Slieker，Eli Lilly提供）和OXPHOS（Mitosciess，Eugene，OR）。蛋白质表达值根据肌动蛋白表达进行标准化（西格玛阿尔德里奇，密苏里州圣路易斯）。二级抗体含有红外染料。蛋白质定量通过Odyssey红外成像系统（LI-COR生物技术，林肯，NE）上的扫描进行。
统计分析。
采用单变量方差分析评估各组之间的差异，然后进行Tukey真实显著差异事后检验（细胞研究）和未配对（细胞研究t吨测试（动物实验）。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
结果
PLIN2蛋白的表达是在脂质负载时诱导的。
我们首先检查了肌管中TAG的积累是否确实与PLIN2的表达改变有关。为此，将C2C12小鼠肌管与不同类型的FA（200μmol/L）孵育(). 辛酸是一种优先氧化的短链脂肪酸，不会增加TAG水平，而与油酸盐或棕榈酸酯孵育会导致心肌细胞TAG的显著积累以及PLIN2蛋白表达的增加。PLIN2蛋白水平的诱导依赖于FA浓度，但在FA浓度为200μmol/L时达到最大诱导(补充图1一个)在FA培养时间，当FA浓度保持在200μmol/L时(补充图1B类). 接下来，我们确定了脂质过载对PLIN2蛋白含量的体内影响。我们发现这两种疾病都是为期8周的HFD()禁食6或24小时(补充图1C类)小鼠骨骼肌中PLIN2蛋白水平显著升高。
PLIN2基因敲除降低细胞内中性脂质积累。一个：C2C12肌管与80µmol/L BSA孵育过夜，BSA与200µmol/L油酸盐（OA）、棕榈酸盐（PA）、辛酸盐（OctA）或单独的BSA络合，作为对照。PLIN2和TAG水平表示为相对于对照治疗的折叠变化*P（P）与对照组相比<0.05。B类：喂食HFD或正常饮食8周的C57Bl6小鼠TA肌肉中PLIN2蛋白的表达。C类和D类：用PLIN2 siRNA（P2）或打乱对照（S）转染C2C12肌管，并用200µmol/L BSA-偶联油酸盐、棕榈酸盐或仅80µmol/L BSA孵育过夜。随后，采集细胞以测量PLIN2蛋白表达和TAG水平#P（P）<0.05与对照组（FA效应）和*P（P）与相应FA处理的扰乱对照相比，<0.05。数据表示为平均值±SEM。n个= 3–4.D类和E类：电子显微镜照片。D类比例尺代表2微米。E类：油酸处理条件（PLIN2击倒后LD尺寸增加）。比例尺表示0.5微米。
PLIN2对于细胞内LD储存至关重要。
为了进一步了解PLIN2对有效储存TAG的重要性，我们使用小干扰RNA（siRNA）敲除了肌管中的PLIN2。与用干扰对照寡核苷酸转染的细胞中的PLIN2水平相比，普林2mRNA水平降低了90%(补充图2一个)蛋白质水平平均下降85%(). 即使在油酸盐或棕榈酸酯孵育时，PLIN2的敲除也阻止了FA诱导的TAG积累和LD形成，这表明PLIN2对LD中TAG的储存至关重要(). LD-coating蛋白PLIN3的蛋白表达不受PLIN2敲除的影响，但该蛋白的代偿性增加除外(补充图2B类). 请注意，LD-coating蛋白PLIN1、PLIN4和PLIN5在C2C12细胞中不表达。电子显微镜成像证实，油酸盐和棕榈酸酯导致对照细胞中大量脂质积聚，而在PLIN2敲除细胞中装载FA后，这种脂质积聚基本上不存在(). 与对照细胞相比，PLIN2敲除细胞中存在的少数LD的大小显著增大。
PLIN2的敲除增加了细胞的氧化能力。
PLIN2敲低细胞中LD储存能力的缺乏可以通过增强脂肪氧化能力或减少FA摄取来补偿。为了研究这些可能性，我们使用了一种无偏见的方法，在PLIN2敲低的细胞中进行了全基因组表达分析(和). 具体而言，功能基因本体分类的过度表达分析显示，与FA转运和脂质储存相关的许多途径受到抑制(). PLIN2基因敲除后下调的基因示例包括传真2和阿帕特9(). 此外，PLIN2敲除后，与呼吸电子传递链和葡萄糖/碳水化合物代谢相对应的基因本体类增加()，表明线粒体功能相关基因表达的补偿性增加（整个治疗条件下的平均PLIN2敲除效应：Pgc1α折叠变化（FC）=3.2，Mterf公司FC=2.2，Mrps33型FC=1.5，Mfn1公司FC=1.3，以及Mtrf1l公司FC=1.8）().
表1
在六种处理条件下选择的基因的表达模式，从每个处理条件的四个样本池中获得
与基因表达水平一致，PLIN2的敲除增加了OXPHOS复合物的蛋白表达（总OXPHOS-单变量方差分析PLIN2敲除效应P（P）< 0.05; 复杂I，P（P）= 0.095; 二、，P（P）= 0.052; 三、，P（P）< 0.05; 和V，P（P）< 0.01) (和补充图3). 因此，我们接下来通过测量PLIN2敲低是否导致脂肪氧化能力的补偿性增加，以应对较低的脂质储存能力14C-棕榈酸酯氧化。PLIN2的减少倾向于增加总量14C-棕榈酸酯氧化(P（P）= 0.055) (). 然而，完成14C-棕榈酸酯氧化成CO2未受影响(). 相反，倾向于增加14C-棕榈酸酯氧化可能归因于不完全氧化（酸溶性代谢物[ASMs]；P（P）= 0.108) (). 因此，PLIN2敲除对棕榈酸氧化的影响不大，这表明线粒体密度的增加只是部分补偿了TAG储存量的减少。
PLIN2击倒细胞中脂质代谢和氧化能力的改变。一个：用PLIN2 siRNA（P2）或打乱控制siRNA（S）转染细胞培养物中OXPHOS复合物I、II、III和V的蛋白表达，以任意单位（AU）表达。n个=每种处理条件下为4。OA，油酸盐；PA，棕榈酸。3小时分析14PLIN2敲除细胞和阴性对照细胞中的C-FA氧化速率：总氧化（总和14C-CO公司2和14C ASM）(B类)，完全氧化为CO2(C类)和不完全氧化为ASM(D类).n个=每种处理条件6。14C-棕榈酸酯并入总中性脂质(E类)，标签(F类)、磷脂(G公司)和DAG(H（H）). 将数值标准化为蛋白质水平。结合到TAG、DAG和磷脂中的表达与对照条件有关。我：胰岛素刺激的脱氧葡萄糖摄取。J型：胰岛素刺激的pAkt磷酸化*P（P）< 0.05. 误差条代表SEM。
PLIN2的敲除增加了棕榈酸与DAG和磷脂的结合。
在PLIN2击倒的情况下，缺乏将FA作为TAG储存在LD中的能力，导致总FA氧化增加的趋势14C-棕榈酸酯未完全氧化14C-ASM。因此，在缺乏细胞TAG储存能力的情况下处理FA的另一种可能性是将FA储存在TAG以外的脂质物种中。因此，14测定了C-棕榈酸盐在总中性脂质、TAG、DAG和磷脂中的掺入。与加扰控制相比，3小时14PLIN2击倒细胞的C-棕榈酸酯孵育导致棕榈酸酯在总中性脂池中的掺入量降低(P（P）< 0.01) (). 除了细胞内总脂质储存减少外，FA掺入中性脂质的过程也从TAG转向DAG和磷脂。14与打乱的对照细胞相比，PLIN2敲除细胞中C-棕榈酸酯掺入磷脂和DAG的量增加(P（P）<0.01和P（P）分别<0.05），平衡低纳入TAG(P（P）< 0.01) (). PLIN2基因敲除不会影响胰岛素信号(P（P）=0.0528，对于基础pAkt，P（P）=0.82，对于胰岛素刺激的pAkt，以及P（P）=0.094（脱氧葡萄糖摄取）().
总之，PLIN2对LD的形成和稳定性以及细胞内TAG的储存至关重要。PLIN2基因敲除仅略微增加FA氧化。
PLIN2过度表达可防止棕榈酸诱导的胰岛素刺激葡萄糖摄取损伤。
除TAG储存外，脂质中间积累被认为对胰岛素信号产生负面影响(30)，而有效的TAG存储被认为是无害的(28，31). PLIN2敲除研究的结果表明，PLIN2对于将FA有效储存到惰性TAG中是必要的。因此，我们接下来研究了PLIN2的过度表达是否可以促进有效的肌肉TAG储存，从而防止脂肪诱导的胰岛素信号损伤。因此，我们在体外过度表达PLIN2，以研究其对IMCL处理的潜在有益影响。PLIN2过度表达导致PLIN2表达增加两倍()细胞内TAG存储量增加了六倍(P（P）= 0.04) ()、和增加了14C-棕榈酸酯并入总中性脂质(P（P）=0.013）、DAG和TAG(P（P）=0.003和P（P）=0.042），同时减少其并入磷脂(P（P）= 0.006) (). 接下来，我们测试了PLIN2-facilitated intermyocellular TAG storage是否可以防止棕榈酸诱导的胰岛素信号传导中断。为此，将PLIN2-和空载体转染的C2C12肌管与400μmol/L棕榈酸酯孵育过夜，已知棕榈酸酯会损害胰岛素信号(32). 与该假设一致，PLIN2过度表达挽救了棕榈酸介导的胰岛素刺激葡萄糖摄取损伤(P（P）< 0.05) ().
PLIN2过度表达可保护C2C12肌管免受棕榈酸诱导的胰岛素抵抗。一个：Western blot显示PLIN2过度表达的效率。B类：标签级别。并入中性脂质(C类)，标签(D类)，DAG公司(E类)和磷脂（PL）(F类). 合并到TAG、DAG和PL中是相对于控制条件表示的。G公司：胰岛素刺激的脱氧葡萄糖摄取。EV，空向量；PA，棕榈酸酯（400μmol/L）；PL，磷脂；C、 控制；DPM，每分钟解体次数*P（P）< 0.05. 误差条代表SEM。
体内，PLIN2单侧过度表达。
为了研究PLIN2的过度表达是否对体内胰岛素敏感性也有有利影响，我们在喂食食物或HFD的大鼠肌肉中单侧过度表达PLIN2。我们使用体内基因电穿孔方法，以同一动物的对侧腿作为对照，在大鼠一侧腿的TA肌肉中异位表达PLIN2。如Western blotting所示，PLIN2在大鼠TA肌肉中显著过度表达（全肌裂解物中平均为2.5倍）()以及免疫荧光显示许多LD被PLIN2包裹(). PLIN2过度表达肌肉中的LDs较大且数量较多()表明PLIN2过度表达后IMCL水平增加。
基因电转移介导的PLIN2在大鼠TA肌肉中的过度表达。一个：典型的Western blot显示PLIN2在左TA肌肉中过度表达。EV，空矢量。SR-肌动蛋白、肌动蛋白B类：喂食HFD大鼠右腿（对照组，空载体）和左腿（PLIN2载体）TA肌段的脂质堆积（红色，Oil-red-O）和PLIN2表达（绿色）（PLIN1和脂质重叠呈黄色，但取决于细胞内LD的横切位置）。细胞膜被染成蓝色。显示了具有代表性的图片。右下面板上的图像是上面所选图片的放大。C类：假电穿孔和PLIN2电穿孔肌肉样品的超微结构（透射电子显微镜[TEM]）。（该图的高质量数字表示可在在线期刊上获得。）
无偏全基因组表达分析表明，在HFD大鼠中，PLIN2电穿孔肌肉与对照肌肉中与脂质代谢和线粒体FA氧化相关的基因受到差异调节(和补充图4). 更具体地说，PLIN2过表达下调的基因示例包括Pgc1α（FC=−1.92），Cpt2号机组（FC=−1.74）和有丝分裂素(Mfn1公司FC=−1.53；Mfn2公司FC=−1.53）(). 这组下调基因在与氧化磷酸化、FA氧化和线粒体功能相关的基因集中过度表达(补充图4)包括过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）靶基因(补充图5). 包括上调基因SCD1型（FC=1.62）和PPARγ（FC=1.57），与脂质储存和碳水化合物代谢相关的基因集相关(). 因此，PLIN2的过度表达与FA氧化向脂质储存转变的代谢特征相一致。
PLIN2过度表达导致参与脂质代谢的蛋白质表达发生变化。
采用蛋白质印迹法将PLIN2过度表达介导的基因表达变化延伸至与线粒体功能（OXPHOS、PGC1α和UCP3）和脂解（ATGL、CGI-58和PLIN5）相关的蛋白质。在喂食食物的动物组中，PLIN2过度表达后，未观察到蛋白表达的显著变化。然而，在喂食HFD 4周的大鼠中，由于PLIN2过度表达，OXPHOS复合物I、III和V的蛋白质水平趋于降低(P（P）=0.075（对于复合物II）(补充图6一个)这表明，由于PLIN2过度表达，HFD诱导的OXPHOS蛋白表达上调被减弱。这些结果与观察到的线粒体功能和FA氧化相关基因的低基因表达水平相一致(和补充图4). PGC1α蛋白表达以及PLIN5，另一种被认为参与氧化过程的LD涂层蛋白(33)，在PLIN2过度表达后趋于减少(P（P）=0.062和P（P）分别=0.078）(补充图6B类和C类). ATGL、CGI-58和UCP3的蛋白表达没有显著变化(补充图6D类–F类).
PLIN2过表达增加心肌细胞脂肪储存，同时减弱HFD诱导的胰岛素抵抗。
我们接下来研究了TAG储存量的增加是否与脂肪毒性FA中间体DAG和神经酰胺的减少有关。有趣的是，尽管IMCL积累增加，PLIN2过度表达并没有增加DAG水平()PLIN2过表达也不影响DAG部分的FA组成（饱和度和FA链长度）(补充图7). 因此，PLIN2过度表达肌肉中总IMCL水平的增加与DAG水平的增加并不平行，这表明FA被存储为TAG。有趣的是，神经酰胺水平增加了23%()PLIN2过度表达。
在HFD大鼠TA肌肉中PLIN2的过度表达可提高肌肉的胰岛素敏感性。骨骼肌DAG(一个)和神经酰胺(B类)HFD大鼠PLIN2或空载体（EV）电穿孔肌肉中的水平。C类:三HFD大鼠对照组和PLIN2电穿孔TA肌的H标记脱氧葡萄糖摄取(n个= 11). 误差条代表SEM*P（P）< 0.05.
PLIN2过表达因此增加了IMCL水平，同时改变了有利于有效脂肪储存而非氧化的基因表达谱。因此，我们研究了PLIN2过度表达的这些后果是否会影响胰岛素敏感性。为此，实施了高胰岛素-正常血糖钳夹。正如预期的那样，与对照组（chow）大鼠相比，HFD大鼠体重增加明显更多（chow+1.91±0.41 vs.HFD+2.94±0.20 g/天，P（P）=0.01），3周的HFD喂养期足以阻止全身胰岛素敏感性，如钳夹稳定期较低的葡萄糖输注率所示（chow 31.8±1.0 vs.HFD 26.6±1.6 mg/min/kg，P（P）= 0.05). 在喂食HFD的大鼠中研究了PLIN2过度表达对胰岛素敏感性的影响。在夹具的稳定阶段，三静脉注射H标记的脱氧葡萄糖以研究肌肉特异性脱氧葡萄糖摄取，并将PLIN2过度表达的TA肌肉与同一大鼠的对照sham电穿孔肌肉进行比较。有趣的是，尽管IMCL累积总量显著增加()神经酰胺水平的增加()PLIN2过度表达的小腿的胰岛素敏感性未受损。相反，PLIN2过度表达的小腿与对照小腿相比，脱氧葡萄糖摄取显著增加11.1%(P（P）= 0.045) ().
讨论
LDs的蛋白外壳是调节细胞内脂质代谢的重要界面。PLIN2是非二糖组织中的主要LD包被蛋白之一。在当前的研究中，我们证明PLIN2在骨骼肌IMCL存储中发挥着重要作用。首先，我们发现PLIN2在用长链FA加载肌管时，以及在小鼠骨骼肌长期摄入HFD或禁食后上调。这些发现首次表明PLIN2在骨骼肌脂质代谢中的作用。在随后的功能丧失实验中，我们证明PLIN2在骨骼肌脂质处理中发挥着重要作用。siRNA介导的PLIN2基因敲除阻止了肌细胞内TAG的储存。此外，棕榈酸与DAG和磷脂的结合增加，这表明PLIN2对于LD中FA向TAG的通道化是必要的，并且在没有PLIN2的情况下，部分FA以除TAG以外的脂质中间体的形式被通道化储存。此外，当PLIN2被击倒时，LD的积累仅限于每个肌管中的几个LD，这表明PLIN2对LD的形成和/或稳定性至关重要。对LDs亚细胞定位的研究表明，PLIN2可能参与了LDs从内质网或细胞膜结构中萌发(37，38). 成纤维细胞和肝脏的研究表明PLIN2参与LD合成(39–41). 我们的结果支持PLIN2在骨骼肌LD合成、LD稳定性和TAG储存中的作用。
PLIN2基因敲除后，除了肌细胞内TAG含量降低外，我们还观察到LD较少，但每个细胞中存在的少数LD尺寸较大，这表明细胞通过最大化少数可用LD中的体积表面比来应对FA进入细胞的流量。后者与Bell等人的研究一致(42)其中，PLIN2基因敲除可以减少LD数量，同时增加LD大小。
通过限制神经酰胺、DAG和脂肪酰基辅酶A等脂毒性脂类物质的积累，增强多余FA向TAG储存的分配被认为有助于预防胰岛素抵抗(28，31). 由于我们的敲除研究表明PLIN2对肌细胞内TAG的储存至关重要，我们研究了PLIN2过度表达是否会影响脂质代谢和脂质诱导的胰岛素抵抗。因此，我们确定了体外C2C12肌管中PLIN2过度表达和体内大鼠TA肌肉中单侧、肌肉特异性异位PLIN2表达的影响。PLIN2过度表达显著增加了LD中TAG的积累，LD的数量和大小都较大，与以前的研究一致(40). 当PLIN2在肌管中过度表达时，棕榈酸短期并入TAG和DAG的量增加，表明FA向储存的通道增加。随着PLIN2在TA肌肉中持续过度表达（7天），IMCL总水平的增加与肌细胞内DAG水平的增加并不平行，这表明FA被有效地储存为中性TAG。此外，基因表达谱显示与脂质储存有关的基因的基因表达增加，进一步支持PLIN2促进肌细胞内TAG储存的观点。
TAG积累的增加与氧化能力的增加并不平行。相反，当PLIN2过度表达时，HFD诱导的线粒体密度增加被减弱，参与FA氧化和线粒体功能的基因被下调。人们可以假设，增加肌肉中有效储存TAG的能力将减少对增加脂肪氧化能力的需求。先前已经在抑制脂解的条件下描述了参与FA氧化的基因和蛋白质的表达减少(43，44). 最近的研究表明，线粒体基因由其转录因子PPARα和PGC1调节，需要通过LD的脂肪分解释放FA。因此，ATGL缺乏小鼠的特点是线粒体功能显著降低，可以通过给药过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂Wy14643来挽救(45). 同样，PLIN2过表达降低了几个PPARα靶基因的基因表达。可以假设PLIN2-facilitated LD储存减少了脂质周转，导致线粒体基因转录活性降低，这与我们的微阵列分析结果一致。在这方面，对肝细胞和胚胎肾细胞的研究报告称，PLIN2敲除后脂肪分解增加(41，42，44)，表明PLIN2可以保护液滴不被脂肪分解。IMCL合成、脂肪分解和氧化代谢之间的适当平衡可确保局部细胞内FA水平较低，从而防止脂肪毒性。
我们的研究是首次研究PLIN2过度表达对胰岛素敏感性的影响。在肌肉以外的组织中进行的PLIN2功能丧失研究显示，胰岛素敏感性的结果不一致(42，46–48). 在PLIN2抑制小鼠模型中，降低PLIN2活性可提高肝脏胰岛素敏感性(47，48)而siRNA介导的肝细胞中PLIN2和PLIN3的敲低损害了胰岛素敏感性(42). 在我们的研究中，我们假设PLIN2的过度表达，通过增加多余脂肪向TAG储存的分配，将提高胰岛素敏感性。然而，在体外，PLIN2在我们手中的敲除并不影响胰岛素敏感性，我们确实发现PLIN2的过度表达完全挽救了棕榈酸诱导的胰岛素信号损伤，同时增加了细胞内TAG的积累。尽管IMCL储存量增加，但通过显示HFD大鼠PLIN2电穿孔肌肉骨骼肌中胰岛素敏感性的改善，我们能够将此观察扩展到体内情况。尽管IMCL水平增加，但DAG水平未受影响，而且意外的是，PLIN2过度表达后神经酰胺水平增加。后者与Brown等人的研究一致(49)，描述了与肝脏脂肪酶活性降低相关的神经酰胺水平升高不会损害胰岛素敏感性(49). 这就为神经酰胺的亚细胞定位（而不仅仅是神经酰胺含量）可能是神经酰胺脂毒性潜力的决定因素留下了选择余地。
我们体内研究的一个局限性是，我们的结果仅适用于主要由IIb型纤维组成的TA肌肉中PLIN2的过度表达。然而，糖酵解肌容易发生脂质诱导的胰岛素抵抗(50). 因此，观察到PLIN2的过度表达导致以糖酵解为主的TA肌肉中脂质过度储存，同时改善胰岛素刺激的葡萄糖摄取，表明PLIN2介导的LDs中FAs分配的改善是缓解脂质诱导的胰岛素抵抗的有效方法。
我们的结论是，高水平的PLIN2有利于TAG在骨骼肌中的适当储存，从而防止胰岛素抵抗的发生。在这方面，我们最近观察到，与未经训练的受试者相比，训练后骨骼肌以及训练后受试者的PLIN2水平增加（未公布的数据），这进一步证明了高PLIN2浓度，即使IMCL含量高，也与胰岛素敏感性改善有关。同样，Coen等人(20)与BMI匹配的胰岛素敏感对照组相比，胰岛素抵抗肥胖受试者骨骼肌中的PLIN2基因表达水平较低，体重减轻和药物胰岛素敏感策略（曲格列酮或二甲双胍）均导致骨骼肌中PLIN2蛋白水平升高(23).
总之，通过体外和体内方法，我们确定PLIN2是IMCL储存的重要促进因素。PLIN2对于LDs中肌细胞TAG的储存至关重要。通过改善IMCL储存，PLIN2可防止脂肪毒性，从而提高胰岛素敏感性。
致谢
本研究得到了NUTRIM营养、毒理学和代谢学院以及研究生院VLAG的支持。荷兰科学研究组织创新研究的A Vici（918.96.618号拨款）和A Vidi（917.66.359号拨款）分别支持P.S.和M.K.C.H.的工作。
没有报告与本文相关的潜在利益冲突。
M.B.设计了这项研究，研究了数据，并撰写了手稿。M.K.C.H.参与了讨论，并审查和编辑了手稿。L.M.S.、S.T.、M.J.F.、F.M.、D.v.B.、G.S.和F.K.v.研究了数据。M.H.d.B.参与了讨论。S.K.和P.S.参与了讨论，并审查和编辑了手稿。P.S.是这项工作的担保人，因此，他可以完全访问研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。
本研究的部分内容于2010年7月25日至30日在科罗拉多州Steamboat Springs举行的FASEB夏季研究会议“脂滴：中性脂质储存的代谢后果”上发表。
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