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公共科学图书馆一号。2012; 7（7）：e40769。
2012年7月16日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0040769
预防性维修识别码：项目经理3397927
PMID：22815811

PP1/NIPP1在引导人癌细胞迁移中的作用

克里斯蒂娜·马丁·格拉纳多斯,* 阿兰·普雷斯科特,2 内尔·范德塞尔,三 阿莱德·范·伊恩德,三 米盖尔·始新世,2 伊莎贝拉·克拉斯卡, 贾尼娜·格内曼,三 莫妮克·贝伦斯,三 马蒂厄·博伦,三 约翰·福雷斯特,和科林·麦凯格*
梅迪·帕森斯，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

电梯度存在于许多发育和再生组织以及肿瘤周围。模拟内生电场在体外对许多细胞类型的行为有深远影响。有趣的是，特定的细胞类型以阴极方式迁移，其他类型以阳极方式迁移，还有一些以长轴垂直于电矢量的方式极化。这些引人注目的现象可能体内相关性，因为癌症转移的决定因素之一是在细胞外引导刺激下，在吸引和排斥迁移之间切换的能力。我们提供的证据表明，宫颈癌细胞系HeLa在生理强度的直流电场中阴极迁移，而强转移前列腺癌细胞系PC-3-M则阳极迁移。值得注意的是，蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶-1（PP1）及其调节因子NIPP1的遗传破坏减少了这些细胞系中的定向迁移。相反，NIPP1的诱导表达以PP1依赖的方式将HeLa细胞的定向反应从阴极切换到轻微阳极。值得注意的是，诱导高活性PP1/NIPP1全酶，进一步将定向迁移转移到阳极。我们证明PP1与NIPP1的关联上调了GTPase Cdc42的信号传导，并证明在过度表达NIPP1细胞中对Cdc42进行药理学抑制可以恢复阴极迁移。总之，我们提供了NIPP1调节细胞定向迁移的第一个证据。此外，我们确定PP1/NIPP1是一种新的分子罗盘，通过上调Cdc42信号控制定向细胞迁移，并提出PP1/NIPP1可能有助于癌细胞迁移特性的方式。

介绍

细胞迁移在胚胎发育和伤口修复等许多过程中起着关键作用，对迁移线索的信号调节错误会导致肿瘤转移、炎症和癫痫等病理现象[1]–[4]上皮细胞、内皮细胞、神经细胞和免疫细胞等会受到各种刺激，这些刺激会引导细胞迁移。除了广泛认可的化学信号，如生长因子和细胞因子外，还测量了损伤组织、炎症部位和肿瘤周围的离子性内生电场（EF）[5]–[10]这些电信号可以在伤口愈合、胚胎发育和肿瘤发生过程中作为方向性指导线索[11]因此，破译细胞对EF反应背后的分子机制非常重要。向细胞和组织施加稳定的直流电（DC）EF在体外模拟内源性EF的作用[12]这已经鉴定了许多细胞表面受体、磷酸化信号蛋白和转导电信号的第二信使。例如，表皮生长因子受体（EGFR）和整合素是几种细胞类型中电信号的首批传感器。EGFRs在脂质双层平面内易位，积聚在细胞的阴极和顶端。对于角质形成细胞和角膜上皮细胞，这发生在EF暴露后5-10分钟内[13],[14]因此，EGF信号变得极化，导致ERK1/2的阴极激活增强，F-actin的下游阴极聚合和定向迁移[13]–[15]据报道，类似的发现支持了胚胎和成人神经祖细胞的阴极趋电性[16]此外，整合素α5和α5ß1在阴极迁移的成纤维细胞上重新分布和聚集，上皮细胞中的β1整合素也是如此[17],[18]此外，消耗ß4整合素或添加抗整合素β1亚单位抗体抑制EF定向迁移[18],[19].

蛋白质酪氨酸（Tyr）激酶在迁移中的作用已经得到了很好的研究，而蛋白质磷酸酶的作用直到最近才开始受到重视[20]事实上，已知参与趋电性的唯一磷酸酶是脂质磷酸酶“第十染色体上缺失的磷酸酶张力蛋白同源物”（PTEN）[7].

蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶-1（PP1）是已知的最保守的酶之一，在蛋白质合成、RNA剪接、细胞周期进展和糖原代谢等一系列细胞过程中发挥着重要作用[21],[22]大量调节亚单位与PP1催化亚单位相关，以确定其细胞定位和底物特异性，并通过PP1全酶介导这些许多生理过程的控制[22]–[24]NIPP1（蛋白磷酸酶1的核抑制剂）是一种高度保守且普遍表达的蛋白质，最初被描述为PP1抑制剂[25]–[27]NIPP1是一种支架蛋白，磷脂酶、激酶、剪接因子和染色质修饰剂等多种蛋白质围绕其功能聚集。NIPP1包含两个主要的PP1相互作用位点，它们位于中心域和C末端域，其中氨基酸残基200-203代表RVxF-型PP1对接位点。最近的证据表明，NIPP1对PP1的作用是底物依赖性的：它有效地阻断了许多PP1底物的去磷酸化，但促进了通过其叉头相关（FHA）结构域募集的底物的去磷酸化[28]有趣的是，与过表达野生型NIPP1（W.T-NIPP1）结合的PP1在Thr-320高度磷酸化，这是一个使PP1失活的标记，而与C末端截短的NIPP1蛋白（ΔC-NIPP1[28].

PP1作为细胞极性和迁移的调节器的作用开始显现。PP1与调节肌动蛋白细胞骨架的几种蛋白质相互作用，并有助于细胞突起和粘连的形成[24]此外，最近的一份报告确定了PP1在控制肠神经细胞迁移中的功能作用[29]在这里，我们研究了PP1和NIPP1水平是否调节宫颈癌衍生HeLa细胞系的运动和定向迁移。此外，我们利用HeLa Tet-Off（HTO）细胞探索了NIPP1相关PP1对定向迁移的贡献，这些细胞被设计成可诱导表达W.T.NIPP1、C末端截断NIPP1（ΔC-NIPP1）或NIPP1的PP1结合突变体（mNIPP1[28],[30]我们使用直流电场（EF）作为一种易于控制的引导线索，已知其可以控制正常细胞和肿瘤细胞的定向细胞迁移[31],[32]在这里，我们证明PP1和NIPP1水平对于单个HeLa细胞的最佳随机运动和对DC EF的定向迁移是必需的。通过检测高转移前列腺癌衍生细胞系PC-3-M的趋电性，我们确认NIPP1水平是定向细胞迁移所必需的。此外，我们证明PP1与NIPP1的结合起着指南针的作用，通过调节整合素和生长因子受体的表达以及Cdc42 GTPase活性来控制细胞迁移的方向。这些结果确定了NIPP1在细胞迁移中的功能作用，并揭示了PP1/NIPP1是控制细胞对电引导信号的定向反应的第一个蛋白Ser/Thr磷酸酶复合物。

结果

PP1和NIPP1是HeLa和PC-3-M细胞响应电引导线索的随机和定向迁移所必需的

最近的一项研究表明，用蛋白磷酸酶1和2A抑制剂冈田酸（okadaic acid）处理肠道神经嵴细胞会导致细胞无定向突起和细胞随机运动[29]因此，我们研究了PP1在调节宫颈上皮癌衍生HeLa-Tet-Off（HTO）细胞对电引导信号的定向迁移中的潜在作用。为此，我们测试了先前验证的靶向所有三种PP1亚型的siRNAs对单个细胞随机运动和细胞对应用EF（趋电性）的定向迁移反应的影响[33]PP1蛋白水平在转染48小时后降低85%(图1A). 在没有EF的情况下，对照组和PP1敲除（KD）细胞随机迁移(图1B). 当应用DC EF时，82%±5的对照siRNA细胞阴极迁移（右侧为红色）(图1B; 看见视频S1). EF处理增加了迁移距离、迁移速度和对照siRNA细胞的定向性(图1C). 然而，PP1缺失完全损害了趋电性，57%±2的PP1 siRNA细胞阴极迁移（红色，右侧），43%±2阳极迁移（黑色，左侧）(图1B、C; 看见视频S2). 此外，我们观察到，与对照siRNA细胞相比，缺乏PP1的细胞显示出更少的细胞突起和更多的应激纤维(图1D). 尤其是，PP1的丢失降低了未经处理和EF处理细胞中丝状体的形成(图1E).

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PP1缺失会损害HeLa细胞的趋电性。

答：。用siRNA处理亲代HeLa-Tet-Off（HTO）细胞会在转染48小时后严重消耗PP1水平。用识别所有亚型的PP1抗体观察内源性PP1水平。B。图表显示，PP1的丢失会削弱电池向阴极迁移的能力。每条线代表单个细胞的迁移轨迹。每个细胞迁移轨迹的起点都在原点。末端位置在右侧的电池轨迹显示为红色（“C”，阴极），而在左侧的电池轨迹则显示为黑色（“A”，阳极）。作为对照，对EF处理的细胞进行分析。控制siRNA细胞强烈向阴极迁移；PP1 siRNA处理的细胞无法迁移以响应DC EF。刻度显示迁移距离，单位为µm。C、。PP1耗竭强烈降低了迁移距离、速度和方向性，以响应生理性DC EF。误差条为S.E.M。第页显示了距离、速度和方向上的显著差异值。D。用DC EF处理的对照细胞和PP1缺失细胞中内源性PP1的定位和丝状蛋白的分布。用识别所有亚型（绿色）的PP1抗体观察内源性PP1水平，并用罗丹明-指骨肽（红色）检测聚合肌动蛋白。细胞核已用DAPI（蓝色）染色。箭头标记细胞PP1水平显著下降，这与肌动蛋白丰富突起形成缺陷有关。显示了具有代表性的图像。比例尺为50µm。E.公司。通过计数100个细胞来量化丝状伪足细胞的数量。误差条为S.E.M。第页显示了显著差异的值。图像显示了控制siRNA和PP1 siRNA细胞突起的细节。箭头标记了对照细胞中的大量丝状伪足，并勾勒出PP1 siRNA细胞中细胞边缘主要缺乏丝状伪满的区域。

此外，我们研究了PP1相互作用子NIPP1在肌动蛋白突起形成以及HTO细胞随机和定向迁移中的可能调节作用。首先，我们通过测试先前验证的靶向NIPP1的siRNAs的作用来检测NIPP1是否是迁移所必需的[34]转染48小时后NIPP1蛋白水平降低80%(图2A). 在没有EF的情况下，对照组和NIPP1敲除（KD）细胞随机迁移(图2B). 在EF存在下，对照细胞表现出强烈的阴极迁移；87%±4的对照siRNA细胞阴极迁移（红色，右侧），13%±4阳极迁移（黑色，左侧）(图2B; 看见视频S3). 然而，NIPP1 KD细胞的阴极迁移非常迟缓，其中57%±3的NIPP1 siRNA细胞阴极迁移（红色，右侧），43%±3阳极迁移（黑色，左侧）(图2B、C并查看视频S4). 此外，在没有EF的情况下，与对照siRNA处理的细胞相比，NIPP1 siRNA细胞中的细胞迁移速度和距离降低了两倍(图2C). 与EF处理的对照siRNA细胞相比，暴露于EF的细胞中，NIPP1丢失导致的迁移速度和迁移距离的减少甚至更大，EF处理后细胞迁移速度减少了四倍，迁移速度下降了两倍以上(图2C). 与之前的报告一致，DC EF促进了对照HTO细胞中肌动蛋白聚合和富含肌动蛋白细胞突起的形成(图2D). 然而，NIPP1 KD细胞的细胞突起较少(图2D). 特别是，未经处理和EF处理的NIPP1 KD细胞中形成丝状体的能力严重受损(图2E).

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PP1相互作用物NIPP1的缺失会损害HeLa细胞的趋电反应。

答：。用siRNA处理亲代HeLa-Tet-Off（HTO）细胞会在转染48小时后严重降低NIPP1水平。通过SDS/PAGE和免疫印迹分析细胞裂解物。检测到与所有PP1亚型相对应的条带，并使用GAPDH作为负荷控制。B。图表显示，NIPP1的丢失会削弱细胞向阴极迁移的能力。控制siRNA细胞强烈向阴极迁移；NIPP1 siRNA处理的细胞显示阴极反应大大降低。刻度显示迁移距离，单位为µm。图表之间的比例不同，以便包括所分析的每个细胞的轨迹。C、。NIPP1耗竭强烈降低了迁移距离、速度和对生理DC EF的定向。数据来自至少三个实验。误差条为S.E.M。第页显示了距离、速度和方向上的显著差异值。D。用DC EF处理的对照细胞和NIPP1缺失细胞中内源性NIPP1的定位和丝状蛋白的分布。内源性NIPP1水平用兔抗NIPP1抗体（绿色）识别，聚合肌动蛋白用罗丹明-阴茎肽（红色）检测。细胞核用DAPI染色（蓝色）。NIPP1定位于EF处理和未处理细胞的细胞核，其水平被siRNA耗尽。比例尺为50µm。E.公司。通过计数100个细胞来量化丝状伪足细胞的数量。误差条为S.E.M。第页显示了显著差异的值。图像显示了控制siRNA和NIPP1si RNA细胞中细胞突起的细节。箭头标记了对照细胞中的大量丝状伪足，并勾勒出NIPP1 siRNA细胞边缘主要缺乏丝状伪满的区域。

为了进一步验证我们的数据并排除靶向NIPP1的siRNA可能产生的非靶向效应，我们还检测了IPTG治疗后通过靶向NIPP1的shRNA表达而导致NIPP1水平降低的高转移性人类前列腺癌细胞系PC-3-M的趋电反应。IPTG治疗5天后，NIPP1水平降低约70%(图3A). 我们首次表明，PC-3-M细胞对阳极显示出非常强大的趋电反应，如强负向性−0.9所示(图3B、C并查看视频S5)NIPP1的丢失强烈降低了这些细胞对DC EF的定向反应(图3B、C并查看视频S6).

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PP1相互作用物NIPP1的缺失会损害PC-3-M细胞的趋电反应。

答：。用IPTG处理PC-3-M细胞可诱导NIPP1耗竭。通过SDS/PAGE和免疫印迹分析细胞裂解产物。检测到PP1亚型对应的条带，并使用GAPDH作为负荷控制。B。曲线图显示，NIPP1的缺失会削弱PC-3-M细胞的无序迁移能力。对迁移轨迹进行了三个小时的跟踪。每个细胞迁移轨迹的起点都在原点。结束位置在右边的单元格轨迹显示为红色，而在左边的单元格轨迹显示为黑色。当向电池施加直流EF时，阴极标记为“C”，阳极标记为“A”。控制置乱PC-3-M细胞强阳极迁移（负方向值）；表达靶向NIPP1的shRNA的细胞表现出极低的阳极反应。刻度显示迁移距离，单位为µm。图表之间的比例不同，以便包括所分析的每个细胞的轨迹。C、。NIPP1耗竭强烈降低了对生理性DC EF的迁移距离和方向性。数据来自至少三个实验。误差条为S.E.M。第页显示了距离、速度和方向上的显著差异值。

总之，这些数据表明PP1和NIPP1都是HeLa和PC-3-M细胞对DC EF的定向迁移反应所必需的。

PP1/NIPP1控制细胞定向迁移

接下来，我们采用相反的方法，探讨NIPP1的过度表达及其与PP1的结合对EF诱导的定向迁移的影响。为此，我们使用了之前描述的HeLa-Tet-Off（HTO）细胞系，该细胞系在缺乏多西林的情况下表达三种不同的NIPP1变体(图4A)[28],[30]从培养基中去除强力霉素三天后，通过Western blotting评估NIPP1变体的表达(图4B). 这些变体包括与（部分）非活性PP1相关的FLAG-tagged W.T-NIPP1、与组成活性PP1复合的C末端刻痕FLAG-NIPP1（ΔC-NIPP1）和缺乏功能性RVxF-型PP1结合基序的点突变（mNIPP1(图4A).

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NIPP1在HTO细胞中的表达以及通过其与PP1的结合控制EF诱导的定向迁移。

答：。HeLa-Tet-Off（HTO）细胞系去除强力霉素后表达的内源性NIPP1和不同的FLAG-标记NIPP1变异体卡通。所有三个NIPP1变体都有一个叉头关联域（FHA）。W.T.NIPP1中的一致PP1结合序列RVTF已突变为FLAG-mNIPP1变体中的RATA。FLAG标记的ΔC-NIPP1蛋白中不包含C末端自抑制（ID）结构域，导致组成活性PP1/NIPP1全酶的表达。B。去除强力霉素后，通过Western blotting证实NIPP1变体的表达。通过SDS/PAGE和免疫印迹分析细胞裂解产物。检测到PP1亚型对应的条带，并使用GAPDH作为负荷控制。C、。在EF处理和未处理的HTO细胞中，NIPP1在HTO细胞的表达和定位被ICC证实。已使用抗-FLAG抗体和罗丹明指骨肽检测FLAG标记的NIPP1变体（绿色）和F-actin（红色）。细胞核用DAPI染色。在EF处理和未处理的细胞中，NIPP1过度表达定位于细胞核。比例尺为50µm。曲线图显示，生理强度（200mV/mm）的EF在表达不同NIPP1变体的HTO细胞中诱导了不同的迁移反应。EF处理的HTO细胞显示为对照。在无EF和有EF的情况下，追踪迁移轨迹三个小时。每个单元格在0小时的位置位于原点（0，0）。末端位置在右侧的单元格为红色，而在左侧的单元格为黑色。当对电池施加直流EF时，阴极标记为“C”，阳极标记为“A”。刻度显示迁移距离，单位为µm。请注意，为了包括所分析的每个细胞的轨迹，图表之间的刻度是不同的。

通过免疫细胞化学检测三种不同NIPP1变体的定位。与内源性NIPP1类似，FLAG标记的W.T-和ΔC-NIPP1强烈定位于EF处理和未处理细胞的细胞核(图4C，单元格图像）。还可以观察到NIPP1（mNIPP1）的FLAG标记PP1结合突变体的核周染色(图4C，单元格图像）。

接下来，我们测试PP1与NIPP1的结合是否影响HTO细胞的趋电性。没有EF，所有细胞类型的细胞迁移都是随机的(图4C，“无EF”图）。然而，表达FLAG标记NIPP1变体的HTO细胞在EF中表现出一系列不同的行为。72%±3的亲代HTO细胞向阴极迁移（右），28%±3向阳极迁移（左），方向性为0.27±0.05(图4C; 看见视频S7). W.T-NIPP1的过度表达将阴极反应转变为轻微阳极反应，只有35%±12的细胞阴极迁移，65%±12阳极迁移，直接性为-0.12±0.05(图4C; 看见视频S8). 此外，ΔC-NIPP1的过度表达诱导了方向性反应的强烈转变。只有16%±5的细胞是阴极迁移的，84%±5显著的细胞是阳极迁移的，方向性为-0.55±0.04(图4C; 看见视频S9). 有趣的是，mNIPP1的过度表达并不影响阴极迁移，并且细胞的行为与亲本HTO细胞相似；80%±13为阴极迁移，20%±13为阳极迁移，阴极指向性强，为0.52±0.1(图4C; 看见视频S10).

这些结果表明，NIPP1对定向迁移的控制依赖于其与PP1的关联。当NIPP1过度表达并能够结合PP1时，阴极迁移转移到轻微阳极。此外，组成活性PP1/NIPP1全酶的诱导诱导了更强的阳极反应。然而，NIPP1的PP1结合突变体引起阴极迁移，与亲本细胞相似。

PP1/NIPP1控制迁移过程中的中心体定位

在几种细胞类型中观察到中心体位置和细胞迁移方向之间的相关性[35]在许多情况下，中心体位于前缘的后面和细胞核的前面。因此，我们接下来的目的是通过探索HTO细胞中心体的位置和细胞运动方向之间是否存在相关性，来验证通过测量过度表达FLAG标记NIPP1变体的HTO细胞的定向反应所获得的结果。HTO细胞（无EF）中心体随机定位(图5). EF极化阴极中亲代细胞的中心体（极化指数（PI））====================================================================================0.46（见实验程序）；图5). 然而，过表达W.T-NIPP1的细胞向阴极和阳极显示出几乎相同的中心体分布（PI = −0.09;图5). 在过度表达W.T.NIPP1的细胞中，EF诱导的阴极中心体极化的破坏依赖于PP1与NIPP1结合，因为过度表达mNIPP1细胞的中心体向阴极极化（PI====================================================================================0.77），以及亲代细胞（PI====================================================================================0.46;图5). 有趣的是，组成活性PP1/NIPP1全酶的诱导诱导了中心体的强阳极极化（PI = −0.23）和细胞的强烈阳极迁移(图4C,​,5).5). 这些发现表明，中心体在迁移过程中的位置反映了HeLa细胞的定向迁移。最重要的是，该数据表明PP1与NIPP1的结合控制着向阳极中心体极化和阳极迁移的转换，可能反映了在这两个过程中类似的细胞骨架机制的参与。

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HTO细胞中的中心体极化反映了EF中的定向迁移。

答：。DC EF使亲代HTO细胞中的中心体极化到阴极，如通过计数5个区域的细胞所见，即顶部（t）、右侧（EF处理的细胞中的阴极）、底部（b）、左侧（EF处理的细胞中的阳极）和细胞核中心（标记为白点）。B。亲代细胞和mNIPP1细胞将其中心体阴极定位在EF中，而W.T.NIPP1的过度表达会破坏阴极中心体极化，ΔC-NIPP1过度表达会将中心体的阴极极化转变为阳极极化。每例中计数100个细胞，结果以百分比表示。

抑制Cdc42逆转NIPP1诱导的阳极迁移和中心体极化

NIPP1对丝状伪足形成的影响(图2)，定向细胞迁移(图4C)和中心体在生理EF中的定位(图5)依赖于PP1。有趣的是，对HTO细胞的全基因组分析发现，NIPP1也以PP1依赖的方式影响许多基因的表达[30]已经证实，GTPase Cdc42在迁移细胞中控制丝足延伸和中心体定位[36]–[38]角膜上皮细胞对DC EF的定向迁移由Cdc42/Rho开关控制[39]总之，这些数据导致了一个诱人的假设，即NIPP1诱导的阳极极化是通过Cdc42信号介导的。为了验证这一观点，我们首先分析了W.T-NIPP1或ΔC-NIPP1过度表达而非mNIPP1显著上调的基因列表，所有这些基因都与亲本HTO细胞系相比[30]和未发布的数据（请参见材料和方法). 有趣的是，我们发现24个基因参与细胞骨架动力学、细胞-基质相互作用和Cdc42通路，并通过W.T-NIPP1或ΔC-NIPP1的过度表达而激活，但不通过mNIPP1激活(表1).

表1

与亲代HTO细胞相比，HTO细胞中W.T-NIPP1（WT）或ΔC-NIPP1的过度表达显著上调，但mNIPP1不上调的Cdc42通路基因列表。
基因折叠更改类别
父母重量ΔCmNIPP1型
DDR2（DDR2） 12三1受体酪氨酸激酶
表皮生长因子受体 1121受体酪氨酸激酶
EPHA2型 1三41受体酪氨酸激酶
EPHA4型 1211受体酪氨酸激酶
EPHB2型 1211受体酪氨酸激酶
FGFR1型 1221受体酪氨酸激酶
ITGA1公司 1141整合素受体
ITGA2公司 1211整合素受体
ITGA5公司 1211整合素受体
ITGA6公司 1441整合素受体
ITGA11公司 1161整合素受体
ITGAV公司 1221整合素受体
ITGB1标准 1121整合素受体
ITGB2标准 1641整合素受体
ITGB3型 1441整合素受体
ITGB4标准 1121整合素受体
ITGB5标准 1221整合素受体
CFL2型 11三1肌动蛋白重塑蛋白
ACTR3（行动3） 1121肌动蛋白重塑蛋白
IQGAP1 1121Ras GTPase活化样蛋白
6月 1221转录因子
ACTA1公司 1211细胞骨架蛋白
活性剂2 1321081细胞骨架蛋白
动作2 128651细胞骨架蛋白

接下来，我们在一个生理EF中测量了HTO细胞中的Cdc42 GTPase活性，并验证了所测活性是否被特异性和细胞渗透性的Cdc42GTPase抑制剂ML141（CID2950007）所抑制[40]我们发现DC EF在所有HTO细胞中诱导Cdc42 GTPase活性小而显著的增加(图6A; p<0.001），用10µM ML141处理这些细胞后，完全消除了Cdc42 GTPase活性（在所有病例中，无ML141和有ML141的样本比较p值均<0.01）。有趣的是，抑制Cdc42并不影响亲代细胞的阴极迁移（直接性====================================================================================0.42±0.06;图6B; 看见视频S11). 然而，W.T.NIPP1过度表达导致EF定向迁移的逆转通过抑制Cdc42（定向====================================================================================0.29±0.05;图6B; 看见视频S12). 类似地，当Cdc42被ML141抑制时，暴露于EF的ΔC-NIPP1细胞（阳极迁移）失去了这种反应，甚至表现出中等的阴极反应（定向====================================================================================0.2±0.1;图6B; 看见视频S13). EF-刺激这些细胞（+ML141）促进应力纤维的形成（数据未显示），并诱导细胞扩张和皱褶，同时肌动蛋白细胞骨架起泡（数据未示出）。在许多观察到强烈皱褶的情况下，细胞会脱落。ML141处理的ΔC-NIPP1细胞中G1亚群（死亡细胞）的增加（通过流式细胞术测定）可能是这些细胞中观察到的低迁移和分离的原因。相反，ML141不会导致亲本、mNIPP1和W.T-NIPP1细胞的活性缺陷(图S1).

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Cdc42 GTPase对HTO细胞的药理学抑制作用。

答：。ML141对在完整培养基中培养的未刺激细胞和过度表达FLAG-NIPP1蛋白变体的EF刺激HTO细胞中Cdc42 GTPase活性的影响。G-LISA在父母、W.T-NIPP1、ΔC-NIPP1和mRATA细胞中测定的Cdc42-GTP水平，在没有或存在DC EF的情况下，以及在电刺激前用10µM ML141预处理的细胞中。第页在完全培养基中，W.T-NIPP1和ΔC-NIPP1的亲本值分别为0.1和0.01；第页在所有病例中，无ML141和有ML141的样本比较值均<0.01。B。Cdc42抑制可挽救阴极极化，这与中心体定位有关。与ML141孵育的EF处理细胞迁移的定向值。Cdc42抑制挽救了因W.T-NIPP1过表达而降低的阳性细胞定向性。当用Cdc42抑制剂预处理细胞时，ΔC-NIPP1细胞显示的强负向性值接近于0。为了简化无亲本EF时的定向值，图中未包括W.T-NIPP1、ΔC-NIPP1和mNIPP1（带或不带ML141）。如果没有ML141，这些值为−0.07±0.04；0.05±0.09; −分别为0.08±0.05和−0.01±0.04；ML141为-0.07±0.04；0.09±0.05; −分别为0.07±0.05和−0.01±0.04。在没有EF值的情况下，所有病例的EF值都非常接近于0，并且四条线之间的差异在任何病例中都没有统计学意义。至少从三个实验中对数据进行了量化。误差条为S.E.M。第页显示了方向性的显著差异值。按照材料和方法中的说明计算中心体的极化指数。当用Cdc42抑制剂ML141处理细胞时，W.T.NIPP1和ΔC-NIPP1细胞的极化指数与亲代细胞的极化指标相似。

抑制过表达NIPP1但不能结合PP1（mNIPP1）的细胞中的Cdc42 GTPase并不影响其强烈的阴极迁移（直接性====================================================================================0.57±0.03;图6B; 看见视频S14). 这些结果清楚地表明，NIPP1过度表达引起的EF诱导迁移方向的转变取决于NIPP1与PP1的关联，并且它是由Cdc42 GTPase活性介导的。

我们还研究了抑制HTO细胞中的Cdc42是否可以恢复W.T-NIPP1和ΔC-NIPP1细胞中心体向阴极的极化。我们证明，Cdc42抑制使亲代细胞的中心体PI增加到与mNIPP1细胞（PI====================================================================================在两种情况下均为0.76），恢复了W.T-NIPP1细胞的阴极中心体极化（PI====================================================================================最显著的是，在ΔC-NIPP1细胞（PI====================================================================================0.62）(图6B). 这些发现表明EF诱导的中心体向阴极极化是Cdc42 GTPase非依赖性的。然而，在W.T.NIPP1和ΔC-NIPP1细胞中观察到的中心体阳极极化需要与PP1和Cdc42 GTPase活性相关。

讨论

具体而言，我们发现PP1和NIPP1都能积极调节细胞突起的形成，这两种蛋白质的正常水平是癌源性细胞最佳趋电性所必需的。此外，我们还表明PP1与NIPP1的结合控制着定向迁移和中心体极性。

PP1与NIPP1结合通过Cdc42-GTPase控制细胞极性

微管组织中心或中心体朝向前缘的方向有助于微管生长到片层，微管介导高尔基衍生小泡向前缘的传递，为前缘突起提供膜和相关蛋白，从而促进极化迁移[41],[42]除了建立细胞极性外，Cdc42还调节中心体向前缘的重新定向[36],[38]事实上，许多迁移的细胞类型，包括成纤维细胞、神经元和巨噬细胞，在2D培养的迁移过程中，将高尔基复合体和中心体重新定向到前沿[43]–[45]。这种重新定向也发生在伤口愈合过程中[46]，DC EF的应用[47]，剪切应力[48]，早期开发[49]以及向T细胞呈递抗原期间[50]我们已经证明，在HeLa细胞中，中心体朝向细胞的前缘，过度表达不同NIPP1变体的细胞中的中心体极化正好反映了细胞迁移的方向，即亲代和mNIPP1细胞中的阴极中心体偏振，W.T细胞轻度阳极化，ΔC-NIPP1细胞强阳极化。这些发现表明PP1与NIPP1的结合调节细胞极性。我们还表明，Cdc42 GTPase活性对亲代HTO细胞中阴极中心体极化的建立不是必需的，但对这些细胞中的阳极极化是必需的。

PP1/NIPP1定向迁移上调Cdc42信号

小GTPases Rac、Cdc42和Rho的时空协同活动支持多种细胞中的极化细胞迁移[51]–[55]Rho调节应力纤维的形成、运动和局部粘连，而Rac参与跛足，Cdc42更具体地参与丝状足的形成，丝状足是细胞前缘“感知”引导刺激的结构[56]Rho GTPases对极化细胞迁移的贡献，最初是在趋化过程中观察到的，现已扩展到以阴极为引诱剂的趋电性[57],[58]在这个模型中，Rac和Cdc42的活性在细胞面对引诱剂的一侧升高，Rho的活性较低。相反，在远离引诱剂的一侧，Rho活性较高，Cdc42和Rac活性相对较低。Rho激活位于Rac下游，Rac和Rho均位于Cdc42下游，因此这些GTPase激活之间的相互作用产生特定的GTPase级联，对肌动蛋白细胞骨架和细胞迁移产生特定影响[59]与此模型一致，我们的数据显示，具有内源性NIPP1和PP1水平的亲代HTO细胞向一个吸引人的线索迁移，即阴极。然而，我们在两种癌细胞系中的发现与阴极极化由Cdc42驱动的观点不一致，因为用Cdc42抑制剂ML141治疗亲代HTO细胞并不影响阴极迁移。相反，W.T-NIPP1和ΔC-NIPP1过度表达在HeLa细胞中诱导的阳极反应需要Cdc42-GTP酶活性，这表明Cdc42是PP1/NIPP1的下游效应器。

这里，我们已经证明（1）NIPP1是丝状伪足形成所必需的(图2)，它控制细胞定向迁移(图4)和中心体定位(图5)在生理EF中，以PP1依赖的方式。有趣的是，HTO细胞的全基因组分析发现NIPP1也以PP1依赖的方式影响许多基因的表达[30]Cdc42在迁移细胞中控制着丝状体的延伸和中心体的定位[36]–[38]总的来说，这些数据表明NIPP1诱导的阳极极化是由Cdc42信号介导的，因此我们在本手稿中的研究旨在证明这一特定假设。

为了支持NIPP1与PP1结合通过调节Cdc42活性来控制定向反应的机制模型，我们表明PP1与NIPP1结合控制与Cdc42信号传导相关的一系列基因的表达(表1)当在完全培养基中培养时，PP1-associated NIPP1的过度表达增加了Cdc42 GTPase活性。我们认为，这些细胞中不同数量和类别的膜受体的极化分布可能有助于电信号的传递和趋电性的变化。特别是，整合素受体的高表达水平可能与EGFR协同作用，放大ΔC-NIPP1细胞的阳极反应。除了膜受体外，Ephrin A和B受体在过表达PP1相关NIPP1的细胞中上调，并与癌细胞的吸引/排斥行为有关[60],[61]最近有人建议在高转移性肺癌细胞中作为电刺激的传感器[62]并可能有助于此处测试的细胞的趋电特性。

潜在生理/病理意义

除了化学梯度外，上皮细胞以及乳腺和前列腺肿瘤中也存在电梯度[8],[10],[63]有趣的是，乳腺和宫颈组织的电成像已用于临床检测恶性肿瘤[8],[9],[64]前列腺上皮、阴道上皮和宫颈上皮的管腔电位约为−10至−50 mV[65],[66]这样的管腔电位对应于前列腺上皮内5 V/cm的跨上皮电压梯度[63]和1.7 V/cm，假设前列腺管的细胞厚度为20µm，宫颈上皮为300µm(图7). 与Djamgoz等人提出的模型中描述的前列腺细胞类似。，[63]在上述电生理条件下，宫颈上皮细胞会向管腔（阴极）迁移。这些组织中的这种电压梯度与本研究中用于诱导趋电性的DC EF强度相当。细胞对电梯度的定向反应发生改变，有可能增加向管腔的迁移或促进周围组织的定植。考虑到（1）NIPP1在宫颈中表达，也分别在来源于宫颈和前列腺肿瘤的HeLa和PC-3-M细胞中表达[67]（2）NIPP1水平与肿瘤的恶性表型密切相关[68]，（3）NIPP1水平及其与PP1的相关性控制着细胞的定向迁移，这表明PP1/NIPP1的上调有望逆转“默认”阴极极化（朝向管腔），并促进周围组织的侵袭(图7).

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漫画展示了宫颈上皮的基本组织，以及解释PP1/NIPP1如何促进肿瘤细胞侵袭的机制模型。

宫颈和阴道上皮的管腔电位约为−25至−50 mV[65],[66]。这种管腔电位对应于1.7 V/cm（170 mV/mm）的跨上皮电压梯度。在这些电生理条件下，当子宫颈上皮细胞翻转上皮衬里层时，它们会向管腔迁移（绿色箭头）。NIPP1的上调及其向PP1的募集将逆转向管腔的迁移，鼓励周围组织的侵袭（红色箭头）。

总之，我们提供了NIPP1对细胞迁移进行稳态调节的第一个证据。此外，我们确定Ser/Thr磷酸酶全酶PP1/NIPP1是一种新的分子罗盘，通过上调Cdc42信号传导，控制细胞极化和定向细胞迁移，以响应生理性DC EF。这些有趣的发现表明，基于Ser/Thr磷酸酶的机制可以获得细胞“转移”表型，并为药物干预提供了新的机会。

材料和方法

化学试剂、细胞培养和敲除

细胞培养基和试剂购自Invitrogen（英国佩斯利）和Clontech（美国加利福尼亚州）。Cdc42抑制剂ML141在堪萨斯大学专业化学中心合成。当使用ML141时，在应用EF之前用抑制剂预处理细胞培养1小时（也适用于没有EF刺激的对照）。所有实验至少进行了三次，并在去除强力霉素后表达不同转基因的HeLa-Tet-Off（HTO）细胞的低传代中进行[28],[30]Tanuma等人和Van Dessel等人描述了HTO细胞的培养条件。[28],[30]在所有情况下，FLAG标记的NIPP1变体的表达不高于内源性NIPP1水平的两倍。一氧化碳2-在室内空气中进行的实验使用了独立介质。

分别从Dharmacon（Thermo Fisher Scientific，Tournai，Belgium）和Invitrogen（英国佩斯利）购买了针对三种人类PP1亚型、NIPP1和加扰对照SiRNA的SiRNA双链。Van Dessel等人和Qian等人分别描述了针对PP1和NIPP1的siRNAs序列[30],[33]使用Lipofectamine RNAiMAX试剂（英国佩斯利Invitrogen）对亲代HTO细胞进行NIPP1敲除，并在48–72小时后进行分析，如Nuytten等人。[34].

用含有靶向PPP1R8的shRNA的pLKO_IPTG_1xLacO（Sigma-Aldrich，Dorset，UK）转导PC-3-M-Luc细胞（美国加利福尼亚州Xenogen Corporation）（TRC904-218076：TCCCACTTTTCTAGGATCATT公司)或不靶向任何人类基因的非靶向shRNA（Sigma-Aldrich，Dorset，UK），并用嘌呤霉素选择（Sigma-Aldrich，Dorset，UK）。在200µM异丙硫代-β-半乳糖苷（IPTG）浓度下诱导shRNA的表达（英国多塞特Sigma-Aldrich），3-5天后显示出最佳诱导效果。

趋电性实验

如前所述，在层粘连蛋白预涂层板上设计了尺寸为4 cm×1 cm×0.5 mm的趋电室[7]表达三种NIPP1变异体的HTO细胞和亲本HTO细胞以低密度接种在培养箱中16–20小时，以防止电极产物扩散到培养物中，直流EF通过琼脂糖电桥提供，琼脂糖桥通过斯坦伯格溶液烧杯将银/氯化银电极连接到培养箱两侧的培养基贮存器。用蔡司Axiovert 100（德国耶拿）显微镜监测趋电室内的细胞迁移，并用恒温箱将温度控制在37°C。DC EF（200 mV/mm）施加3小时以测试培养物的趋电性。

中心体极化的分析

DC EF刺激1–2 h后，用100%冰镇甲醇固定HTO细胞15 min，用0.3%Triton X-100渗透5 min，用10%驴血清、0.2%牛血清和PBS中的BSA封闭30 min。细胞在一级抗体溶液中培养过夜（来自德国海德堡圣克鲁斯生物技术公司的兔抗中心蛋白抗体，在PBS中0.2%BSA中稀释1∶200）。细胞清洗三次并在二级抗体溶液中培养（驴抗兔二级抗体Alexa fluor 488在0.2%牛血清白蛋白PBS中）。细胞清洗三次，细胞核用1µg/ml 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（英国多塞特Sigma-Aldrich）染色3分钟。清洗后，将Hydromount（美国国家诊断公司）添加到样品中，并在试管上放置尺寸为4 cm×0.8 cm的盖玻片。细胞在蔡司LSM 700共焦显微镜上成像（德国耶拿蔡司）。将细胞分为五个部分，即中央和4×90°的顶部、底部、左侧和右侧扇区，并对这些区域内的中心体进行计数。每个治疗组统计100个细胞，细胞类型和细胞计数为百分比。未提供EF的细胞作为对照。还使用以下公式计算极化指数（PI）：

圆周率 =  （%电池阴极极化-%电池阳极极化）/（%电池极化到阴极+%电池极化至阳极。

G-LISA公司

按照制造商的说明和说明，使用Cytoskeline（cat.Nr.BK127，Cytosclear，Inc.，Denver，CO，USA）的G-LISA试剂盒测量了4个HTO细胞系中存在和不存在EF和Cdc42抑制剂的Cdc42-GTP水平[40].在放置在培养箱中的趋电室中进行电刺激10分钟。在应用DC EF之前，用10µM ML141抑制剂处理细胞1小时。阳性对照包括试剂盒中提供的Cdc42-GTP，阴性对照包括仅含缓冲液的样品。

Western Blot分析

HTO细胞培养物在添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂（瑞士巴塞尔罗氏诊断公司）的裂解缓冲液中进行裂解（cat.Nr.C2978；Sigma-Aldrich，Dorset，UK）。在4–12%Bis–Tris凝胶（Novex、Invitrogen、Paisley，苏格兰）上通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS/PAGE）对蛋白质进行分馏，然后转移到硝化纤维素膜（Invitrogen，Paisley、苏格兰）上，使用30µg总蛋白进行免疫印迹分析。用1∶400的兔抗FLAG（Sigma-Aldrich，Dorset，UK）和1∶500的山羊抗PP1抗体（Santa Cruz Biotechnology，Heidelberg，Germany）检测膜；兔抗GAPDH（Abcam，Cambridge，U.K）按1∶2000使用。制备小鼠NIPP1单克隆抗体（mAb 15B8C11），并对细菌表达的全长NIPP1与His-PP1以1∶1的比例复合进行筛选。这些抗体通过蛋白A亲和层析从杂交瘤培养基中纯化和富集，并显示可识别位于NIPP1中心结构域的表位（氨基酸143-224）。使用与IRDye800或680荧光团（Rockland，Immunochemicals，Reading，UK）结合的驴抗羊、兔或鼠IgG[H+L]检测抗体结合，然后使用Li-Cor Odyssey系统分析免疫印迹。

免疫细胞化学

用细菌表达的多组氨酸标记的NIPP1 143–224片段在家兔体内提高抗体。这些抗体在与CNBr激活的Sepharose 4B（英国赫特福德郡GE Health care）相连的His-NIPP1-143-224上进行亲和纯化。

在施加DC EF指定时间后，将HTO细胞固定在含有8%甲醛的PBS中的培养箱中15分钟。小心移除培养箱顶部后，用1%NP-40渗透的PBS清洗细胞10分钟，然后再次清洗并在10%驴血清或PBS中BSA中封闭30分钟。然后将细胞在兔抗FLAG抗体（Sigma-Aldrich，Dorset，UK）中以5µg/ml的浓度在0.2%BSA的PBS中孵育2小时，或与纯化的兔抗NIPP1抗体在1%BSA中以1∶125稀释过夜。将细胞清洗三次，并用Alexa-FluroTM488和594与PBS中0.2%BSA中的IgG（抗兔、山羊或小鼠）二级抗体（分子探针）结合，以1∶1000的比例使用TRITC-卟啉（英国多塞特Sigma-Aldrich）培养45分钟。用0.2%的BSA在PBS中清洗细胞三次，用1µg/ml 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（英国多塞特Sigma-Aldrich）对细胞核染色3分钟。清洗后，将Hydromount添加到试管中，然后将尺寸为4 cm×0.8 cm的盖玻片放在顶部的4 cm×1 cm处。在4°C的温度下将腔室放置一夜干燥。细胞在蔡司LSM 700共焦显微镜上成像（德国耶拿蔡司）。

细胞迁移的时间推移成像和量化

每隔5分钟记录一次时间推移图像，持续3小时，并使用ImageJ软件和细胞跟踪和趋化插件分析100个细胞的迁移轨迹。迁移方向余弦θ，其中θ是EF矢量和连接细胞起始和终止位置的直线之间的角度，被用作指示细胞在存在和不存在DC EF的情况下如何直接迁移的参数[13],[69].一个电池正朝着阴极移动，其方向性为1；沿着场线向阳极完美移动的电池的方向性为-1。因此，细胞群定向值的平均值可以客观量化细胞迁移的方向。一组随机迁移的细胞的平均定向值为0。使用以下参数分析迁移率。细胞迁移速度是细胞迁移轨迹的总长度除以给定的时间段。距离是单元格的起始位置和结束位置之间的直线距离。

基因表达分析

之前描述了稳定表达W.T-NIPP1或mNIPP1的HTO细胞系的全基因组表达谱（Van Dessel等人，2010年），数据可在GEO获得，登录号为GSE19642标准ΔC-NIPP1细胞系的全基因组表达谱与表达HTO细胞系的W.T-NIPP1和mNIPP1的基因表达谱相同。将W.T-NIPP1或ΔC-NIPP1过度表达而非mNIPP1显著上调的基因列表与Cdc42通路相关的基因列表进行比较。后一列表由144个基因组成，这些基因都与基于Ingenuity pathway Analysis（Ingenuiity Systems Inc，USA）和Human Protein Reference Database®的Cdc42通路相连。

FACS分析

细胞在没有强力霉素的情况下培养3天。分别收集粘附细胞和漂浮细胞组分，最后通过温和离心将其聚集在一起。将细胞重新悬浮在1ml冰镇70%乙醇（v/v）中，并在室温下固定至少30分钟。细胞被调整到大约0.5×105细胞/ml，在PBS+1%w/v BSA中洗涤2倍。然后在1000 g下旋转细胞5分钟，并在1 ml染色缓冲液（50µg/ml碘化丙啶、50µg/ml核糖核酸酶A、0.1%（v/v）PBS）中在室温下重新悬浮20分钟，并避光，然后使用BD-FACSCalibur进行流式细胞术分析。

统计分析

实验至少进行了三次，数据是重复或三次测定的平均值。误差条显示平均值的标准误差（S.E.M）。使用Student t检验进行统计分析。

支持信息

图S1

FACS分析显示ML141在亲本、W.T-NIPP1、ΔC-NIPP1和mNIPP1 HeLa-Tet-Off细胞的细胞周期中的作用。ML141（1 h预处理）对亲代、W.T-NIPP1和mNIPP1细胞的细胞周期没有影响，但ΔC-NIPP1的G1亚群似乎增加。进行了三个具有类似结果的实验，并显示了一个具有代表性的实验。

（畅通节能法）

视频S1

影片显示了对照siRNA-处理的亲代HeLa-Tet-Off细胞在生理EF中的迁移（阴极向右，t====================================================================================3小时）。

（MOV）

视频S2

电影显示PP1 siRNA处理的亲代HeLa Tet-Off细胞在生理EF中的迁移（阴极在右侧，t====================================================================================3小时）。

（移动电话）

视频S3

显示对照siRNA处理的亲代HeLa Tet-Off细胞在生理EF中迁移的电影（阴极向右，t====================================================================================3小时）。

（移动电话）

视频S4

电影显示NIPP1 siRNA处理的亲代HeLa-Tet-Off细胞在生理EF中的迁移（阴极在右侧，t====================================================================================3小时）。

（MOV）

视频S5

电影显示了生理EF中对照非靶PC-3-M细胞的迁移（阴极向右，t====================================================================================3小时）。

（移动电话）

视频S6

电影显示NIPP1 shRNA PC-3-M细胞在生理EF中的迁移（阴极向右，t====================================================================================3小时）。

（移动电话）

视频S7

显示亲代HeLa-Tet-Off细胞在生理EF中迁移的影片（阴极向右，t====================================================================================3小时）。

（移动电话）

视频S8

显示W.T.NIPP1-HeLa-Tet-Off细胞在生理EF中迁移的影片（阴极向右，T====================================================================================3小时）。

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视频S9

显示ΔC-NIPP1-HeLa Tet-Off细胞在生理EF中迁移的电影（阴极向右，t====================================================================================3小时）。

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视频S10

电影显示了mNIPP1-HeLa-Tet-Off细胞在生理EF中的迁移（阴极向右，t====================================================================================3小时）。

（移动电话）

视频S11

电影显示ML141预处理亲代HeLa-Tet-Off细胞在生理EF中的迁移（阴极向右，t====================================================================================3小时）。

（移动电话）

视频S12

显示ML141预处理的W.T-NIPP1-HeLa Tet-Off细胞在生理EF中迁移的电影（阴极向右，T====================================================================================3小时）。

（移动电话）

视频S13

电影显示了ML141预处理的ΔC-NIPP1 HeLa-Tet-Off细胞在生理EF中的迁移（阴极在右侧，t====================================================================================3小时）。

（移动电话）

视频S14

电影显示ML141预处理mNIPP1细胞在生理EF中的迁移（阴极向右，t====================================================================================3小时）。

（移动电话）

鸣谢

我们承认堪萨斯大学专业化学中心是ML141探针的供应商。我们感谢Linda Duncan在FACS分析实验期间提供的技术援助，感谢Ines Royaux提供稳定的shRNAs PC-3 M Luc细胞系。我们非常感谢田沼信弘和岛广弘提供的HTO细胞系。

脚注

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

基金：这项工作由威康信托基金（Wellcome Trust）向CDM提供的079518/z/06/z赠款和阿伯丁大学发展信托基金（University of Aberdeen）向JVF提供的资金资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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