卵磷脂：视黄醇酰基转移酶对细胞从血清视黄醇结合蛋白中摄取维生素A至关重要^*

人血清RBP的表达与纯化

RBP的表达和纯化大肠杆菌基本上如前所述完成(21). 简单地说，将人RBP（hRBP）cDNA克隆到pET3a表达载体中，并根据标准方案在BL-21 DE3细胞中表达。采集细菌细胞并通过渗透休克进行裂解。不溶性材料通过离心法造粒，清洗并在7中溶解米盐酸胍和10m米二硫苏糖醇。过夜培养后，通过超速离心去除不溶物，上清液用于hRBP复性过程。hRBP通过滴加溶解材料重新折叠成含有150μCi[11,12-^三H] ROL公司([^三H] ROL）（PerkinElmer生命科学）和最终浓度为1m的非放射性标记ROL（Sigma）米.对10 m处透析复性holo-hRBP米Tris/HCl缓冲液，pH 8.0，并加载到DE53阴离子交换色谱柱（Whatman，Piscataway，NJ）上。用NaCl（0–1）线性梯度洗脱Holo-hRBP米)10米米Tris/HCl缓冲液，pH 8.0。通过SDS-PAGE和紫外可见光谱检查收集的组分，以确保适当的蛋白质/维甲酸比率。将含有至少90%holo-hRBP的馏分混合在一起，并在Centricon离心过滤装置（截止10000 Da）（密立波，比勒里卡，马萨诸塞州）中浓缩至5 mg/ml[^三H] ROL在闪烁计数器中定量（印第安纳波利斯州贝克曼·库尔特）。Holo-hRBP等分样品在使用前保存在−80°C。

Holo-RBP腹膜内注射及其测定[^三H] ROL在小鼠组织中的积累

Holo-hRBP（100μl，含0.4μCi[^三H] ROL和5nmol非放射性标记的ROL）腹膜内注射到野生型和拉特^−/−老鼠。注射后，在不同时间点（1、2、3和6 h）处死小鼠，并采集组织和血液。血清（100μl）和来自肺、肾或脂肪组织的一只眼睛或组织（10 mg）在100μl PBS（137 m）中均质米氯化钠，2.7米米KCl，4.3米米纳₂高性能操作₄，1.4米米赫₂人事军官₄pH7.3）与5 ml闪烁混合物（Opti-Fluor，PerkinElmer Life Sciences）混合，并且[^三H] ROL含量在Beckman LS 6500闪烁计数器（Beckman Coulter）中定量。

降RBP药物治疗；血液和组织采集

上午8:00，从每只动物的尾静脉采集一份小血样，以测定该时间点的RBP水平(t吨=0）并保持在冰上，直到血清分离。随后，立即用30 mg/kg体重的非那替尼（多伦多研究化学品公司）、A1120（西格玛）或ATRA（西格马）灌胃给小鼠，这些药物溶于200μl的菜籽油中，菜籽油的体积与作为载体对照的菜籽油相同。在治疗后4、8和24小时采集尾静脉血样。然后通过腹腔注射含有氯胺酮（80毫克/千克体重）和木聚嗪（20毫克/千克重量）的混合物将小鼠麻醉10米米磷酸钠，pH 7.2，100 m米NaCl，剪断右心房后直接从心脏抽血。然后用10ml PBS灌注小鼠，并通过颈椎脱位杀死小鼠。解剖肝脏、肾脏、肺、眼睛和性腺脂肪组织，称重，并立即在液氮中速冻，然后在−80°C下储存，直至再次使用。

HepG2细胞分泌RBP的分析

人肝癌HepG2细胞保存在补充有10%胎牛血清和1%青霉素/硫酸链霉素的DMEM中，并在37°C和5%CO中培养₂当细胞汇合时，取下培养基，用PBS冲洗细胞两次。然后将细胞在含有10 mg/ml牛血清白蛋白（Sigma）和20μg/ml环己酰胺（Sigma-）的DMEM中预培养30 min。将溶解于乙醇中的ATRA（Sigma）以最终浓度2μ米，并在37°C下培养细胞2 h。然后以2μ的最终浓度添加ROL米，细胞再培养1小时。仅使用乙醇（0.1%，v/v）作为载体对照。收获细胞和培养基，并在−80°C下分别冷冻，直至进行进一步分析。

免疫印迹法

按照制造商的说明，在M-PER哺乳动物蛋白质提取试剂（Thermo Scientific，Marietta，OH）中均质所有组织样品。在肝脏中测定RBP时，使用20μg总蛋白。为了测定RBP血清水平，将2μl血清用40μl含有完整的Mini-EDTA-free蛋白酶抑制剂（Roche Applied Science）的PBS稀释，并将4μl该溶液用于免疫印迹分析。为了量化HepG2细胞中的RBP蛋白水平，对10–20μg总蛋白细胞裂解物和50μl无细胞培养基进行免疫印迹分析。样品经过SDS-PAGE，然后电印在PVDF膜（Bio-Rad）上。对于肝脏、肺和脂肪组织中LRAT和CRBP1的测定，采用SDS-PAGE分离10-30μg总蛋白，并如上所述进行免疫印迹。然后用溶解在Tris缓冲盐水（15 m）中的无脂奶粉（5%，w/v）封闭膜米氯化钠和10 m米含0.01%吐温100（TBS-T）的Tris/HCl，pH 7.5），清洗后在4°C下与适当的一级抗体孵育过夜。对于RBP检测，使用1:1000稀释的兔抗人RBP血清（DakoCytomation，Denmark）。为了检测CRBP1，采用多克隆兔抗体（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司），稀释度为1:2000。对于LRAT检测，使用非商业性抗LRAT单克隆抗体，稀释度为1:2000(19). β-肌动蛋白抗血清（Cell Signaling，马萨诸塞州波士顿）的稀释度为1:1000，或Ponceau S染色液（马萨诸塞省阿什兰市波士顿生物制品公司）用作总蛋白可视化的负荷控制。使用的二级抗体为辣根过氧化物酶结合抗兔IgG（Promega，Madison，WI）或稀释1:5000使用的抗鼠IgG。使用ECL系统（GE Healthcare）开发免疫印迹。用ImageJ软件对扫描的免疫印迹单条带进行定量。

mRNA的分离和定量PCR分析

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）进行总mRNA分离。使用纳米滴分光光度计（ND-1000，Thermo Scientific）测量RNA浓度和纯度。使用Applied BioSystems逆转录试剂盒（Applied BioSystems，Carlsbad，CA）将1μg总RNA逆转录为cDNA。使用TaqMan探针（应用生物系统）进行qRT-PCRCyp26a1细胞（Mm00514486_m1），Stra6系列（Mm00486457_m1），拉特（Mm00469972_m1）和RBP（Mn00803266_m1）。β-肌动蛋白（Mm01205647_g1）和18S rRNA（4319413E）探针组用作内源性对照。所有实时实验均使用ABI Step One Plus qRT-PCR仪器（Applied BioSystems）进行。

维甲酸的HPLC分析

如前所述，在暗红色安全灯下从70-100μl血清或30mg组织中提取非极性类视黄醇(22). 萃取溶液由200μl甲醇、400μl丙酮和500μl己烷组成。去除有机相，并用500μl己烷重复萃取。然后将收集的有机相汇集在SpeedVac（德国汉堡埃彭多夫）中进行干燥。将残留物溶解在200μl HPLC溶剂中（己烷/乙酸乙酯，90:10，v/v）。使用正相Zobax Sil（5μm，4.6×150 mm）柱（安捷伦，圣克拉拉，加利福尼亚州）进行HPLC。用10%乙酸乙酯/己烷以1.4 ml/min的流速实现等速色谱分离。对于维甲酸的定量，之前使用模式化合物ROL和RE（Sigma）缩放HPLC。

CRBP1对细胞ROL摄取量没有显著贡献

我们发现了野生型拉特^−/−小鼠蓄积[^三H] ROL来自肺部和眼睛中的hRBP。排除这些差异是由ROL血清水平变化和/或Stra6系列mRNA水平，我们比较了年龄和性别匹配的小鼠。这两种基因型之间ROL血水平无明显变化(图2D类). 此外，Stra6系列肺和眼睛中的mRNA水平相当(图2E类). 有趣的是，Lrat公司^−/−小鼠表现出明显升高Stra6系列白色脂肪组织中的mRNA水平(图2E类)。

在细胞培养研究中，CRBP1与STRA6介导的维生素A摄取有关(16). 有趣的是，拉特^−/−与野生型对照动物相比，小鼠的肝脏、肺和脂肪组织中CRBP1蛋白升高(图2F类). 因为[^三H] ROL没有在患者的眼睛和肺部积聚拉特^−/−小鼠和Stra6系列在这些组织中表达，我们得出结论，在缺乏LRAT的情况下，仅CRBP1不能显著增强STRA6介导的ROL摄取。

维甲酸诱导依赖性维生素A的摄入和储存

我们的分析表明，LRAT对小鼠肺部和眼睛从循环holo-RBP中摄取细胞ROL至关重要。然而，STRA6与LRAT的偶联也可能有助于调节血液维生素A稳态，因为这两种蛋白质都由ATRA调节基因编码(13,20). 因此，我们测试了急性全身ATRA治疗是否会增加循环holo-RBP对ROL的摄取，以及此过程是否需要LRAT。我们首先在野生型小鼠中记录ATRA和载体单独治疗的剂量-反应曲线，并在不同时间点从尾静脉采集血液。30 mg/kg和10 mg/kg ATRA治疗4 h后显著降低血清RBP水平，而5 mg/kg治疗的小鼠未观察到ATRA的这种作用(图3,A类和B类). 下一步，我们用木棒将野生型和Lrat公司^−/−服用ATRA（30 mg/kg）的小鼠或单独服用溶媒。同样，ATRA治疗4小时后，野生型小鼠的血清RBP水平显著降低。在ATRA治疗后，RBP血清水平增加了8小时，并在24小时达到初始值(图4,A类和B类). 与野生型小鼠相比，当拉特^−/−用最高剂量（30 mg/kg）的ATRA治疗小鼠(图4,A类和B类)。

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图3。

维甲酸剂量依赖性地降低野生型小鼠的血清holo-RBP水平。 A类野生型小鼠单次口服不同剂量的ATRA后的血清RBP水平。从每只动物的尾静脉采集一个小血样(n个=每个基因型和条件3个）。显示了血清中RBP的代表性免疫印迹分析。用Ponceau S染色的白蛋白作为负荷控制。B类显示了不同剂量ATRA后血清RBP水平的定量。进行单因素方差分析，然后进行LSD事后分析(第页< 0.05),一≠b.误差条、瑞典。

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图4。

维甲酸降低野生型小鼠血清holo-RBP水平，但不降低拉特^−/−老鼠。 A类和B类WT和拉特^−/−小鼠单次口服30 mg/kg ATRA。从每只动物的尾静脉采集一个小血样(n个=每个基因型和条件3个）。A类，血清中RBP的代表性免疫印迹分析。白蛋白的Ponceau S染色用作负荷控制。B类，不同组血清RBP水平的量化。黑色钻石，车辆处理小鼠；开放三角形,拉特^−/−用ATRA处理的小鼠；开放的圆圈、用ATRA治疗的WT小鼠。进行单因素方差分析，然后进行LSD事后分析(第页< 0.05),一≠b.C类和D类单次灌胃30 mg/kg ATRA和溶媒4 h后，血清RBP和ROL水平。血清RBP水平通过免疫印迹分析定量(C类)，和ROL水平通过HPLC分析进行定量(D类). 作为负荷控制，PVDF膜用非特异性蛋白染料Ponceau S染色图3A类对应于白蛋白的分子质量（66 kDa）。#，第页< 0.0001; *,第页<0.05（学生）t吨将每个基因型与载体对照进行比较。进行单因素方差分析，然后进行LSD事后分析(第页< 0.05),一≠b.误差线、瑞典。

然后我们处理野生型和拉特^−/−使用ATRA（30 mg/kg）或溶媒的小鼠，4小时后处死动物以收集血清和组织。血清RBP水平的测量再次显示，与仅接受溶媒治疗的同胞相比，ATRA治疗的野生型动物的RBP水平显著下降，但在拉特^−/−老鼠(图4C类). 然后通过HPLC分析测定血清ROL水平。在野生型小鼠中，ROL的血清水平显著降低，反映了RBP的降低(图4D类)。拉特^−/−ATRA治疗后，小鼠血清ROL水平也略有下降(图4D类). 然而，这种减少明显低于野生型小鼠。

ATRA治疗后holo-RBP迅速下降可能是由于组织中STRA6和LRAT活性增加以及通过肾小球滤过清除无ROL RBP所致。因此，我们接下来测量Stra6系列和拉特通过qRT-PCR分析ATRA治疗动物的mRNA表达水平，并将其与载体治疗对照动物进行比较(图5). ATRA治疗显著增加Stra6系列和拉特野生型小鼠肺内mRNA的表达(图5,A类和B类). 我们还证实了在蛋白水平诱导LRAT表达(图5C类). 令人惊讶的是，ATRA对眼部没有显著影响拉特表达，只有适度增加Stra6系列检测到表达(图5,D类和E类). 为了排除这种阴性结果是由眼部组织中缺乏ATRA引起的可能性，我们测定了眼部组织中ATRA的表达水平Cyp26A1细胞qRT-PCR显示该ATRA诱导的标记基因的mRNA表达被诱导了18倍(图5F类) (24)。

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图5。

ATRA治疗诱导拉特和Stra6系列小鼠眼外组织中的表达。WT和拉特^−/−老鼠(n个=4/组），每公斤体重服用30毫克ATRA或仅服用溶媒。4小时后，Stra6系列和拉特mRNA表达通过qRT-PCR分析测定，LRAT蛋白水平通过免疫印迹测定。A类,Stra6系列WT小鼠肺部mRNA水平。B类,拉特WT小鼠肺部mRNA表达。C类，野生型小鼠肺中LRAT蛋白水平。代表性免疫印迹显示在左侧。D类,Stra6系列WT小鼠眼部mRNA表达。E类,拉特WT小鼠眼部mRNA表达。F类,Cyp26a1细胞WT小鼠眼部mRNA表达。G公司,Stra6系列WT小鼠脂肪组织中的mRNA水平。H（H）,Stra6系列肺组织中的mRNA水平拉特^−/−老鼠。我,Stra6系列眼睛中的mRNA水平拉特^−/−老鼠。J型,Cyp26a1细胞mRNA在眼内的表达拉特^−/−老鼠。K,Stra6系列脂肪组织中的mRNA水平拉特^−/−老鼠。18S用作肺、肝和脂肪组织中mRNA表达的内部对照，β-肌动蛋白用于眼睛。数据表示平均值±S.E(误差线) *,第页< 0.05; 学生的t吨测试。

Stra6系列经ATRA治疗的肺组织中mRNA表达也显著增加拉特^−/−老鼠(图5H（H）)眼睛里只有轻微的增加(图5我)尽管视力增加了16倍塞浦路斯26a1mRNA表达(图5J型)。Stra6系列两种基因型的白色脂肪组织中的表达也显著增加(图5,G公司和K). 因此，我们得出结论：Stra6系列和拉特在眼外组织（如肺）中的表达有助于野生型小鼠从holo-RBP中快速摄取维生素A，而仅诱导STRA6不足以增加这种摄取拉特^−/−老鼠。

ATRA以LRAT依赖的方式在肝细胞中保留RBP

肝脏分泌holo-RBP，并构成血液维生素a稳态的主要贡献者。维生素A缺乏时，肝脏ROL的缺乏会阻止holo-RBP分泌到循环中。因此，我们研究了ATRA依赖性诱导Lrat公司肝脏中的表达可以通过将肝脏ROL转化为酯形式来阻止holo-RBP的释放。正如预期的那样，qRT-PCR和免疫印迹分析表明，与经载体处理的对照组相比，ATRA处理的野生型小鼠诱导了LRAT(图6,A类和B类). 为了分析这种肝脏LRAT表达增加是否会导致RBP在肝脏滞留，我们测量了拉特^−/−和野生型小鼠。令人惊讶的是，与对照组相比，ATRA治疗后肝脏RBP水平显著升高，与基因型无关(图6C类). HPLC分析显示两种基因型的肝脏ROL水平均无变化，但拉特^−/−与野生型小鼠相比，小鼠的ROL水平较低(图6D类). ATRA治疗后RBP mRNA水平保持不变(图6E类)，表明观察到的肝RBP升高不是由于从头开始的生物合成。因此，我们推测肝RBP的LRAT和ROL非依赖性增加可以通过ATRA与肝细胞RBP的结合来解释。此前的研究报告称，RBP与ATRA和ROL具有相似的亲和力在体外(25)ATRA结合后的RBP保留在肝细胞中(26). 为了证实ATRA对RBP释放的影响，我们用ATRA或载体处理人类肝癌HepG2细胞2小时，然后添加ROL。（细胞与环己酰胺预先孵育，以避免ATRA诱导的基因表达变化）。与经载体处理的细胞相比，经ATRA培养的HepG2细胞显示出更高的RBP水平。(图6F类). 当我们测量介质中的RBP水平时，情况正好相反(图6F类)表明ATRA减少了细胞释放RBP。这些观察结果可以解释ATRA治疗后小鼠肝脏中RBP的LRAT依赖性增加。然而，两种基因型中肝脏RBP的积累和缺乏ATRA对循环holo-RBP的影响拉特^−/−小鼠排除了这种机制对仅在野生型动物中观察到的血清RBP水平快速下降的显著贡献的可能性。

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图6。

ATRA抑制肝细胞释放RBP。WT和Lrat公司^−/−老鼠(n个=4/5组）用30 mg ATRA/kg体重或相同体积的溶媒进行治疗。A类和B类，肝脏拉特信使核糖核酸(A类)和蛋白质水平(B类)在WT小鼠中。C类代表性免疫印迹分析WT和拉特^−/−小鼠对载物和ATRA治疗。β-肌动蛋白作为负荷对照。D类WT和Lrat公司^−/−老鼠。E类，肝脏Rbp mRNA水平。F类，HepG2细胞在加入ATRA（2μ米最终浓度）或仅限车辆。2小时后，ROL（2μ米添加最终浓度），并将细胞再培养2 h。收集细胞和培养基，并通过免疫印迹分析测定RBP蛋白水平。数据表示平均值±S.E(误差线)来自三个独立的实验，第页< 0.05; 学生的t吨测试。

长期维生素A缺乏时ROL优先转运到眼睛

我们发现了Stra6系列和拉特在非眼部周围组织（如肺）中的表达受ATRA调节，而ATRA不诱导眼部LRAT表达(图5). 这种差异表明，眼睛循环holo-RBP对ROL的摄取并不取决于维生素A的状态(例如在长期缺乏维生素A的情况下仍可能发生）。因此，我们分析了限制摄入维生素A 20周的野生型小鼠不同组织的维甲酸含量，并将数据与维生素A充足的对照动物的数据进行了比较。HPLC分析显示，与摄入维生素a充足（VAS）饮食的同胞相比，摄入维生素a缺乏饮食的小鼠肝脏和肺部的维生素a水平严重不足(图7,A类和B类). VAD动物的血清ROL水平也较低，但这种差异没有达到统计学意义(图7C类). 相反，VAD和VAS动物眼睛中的维甲酸含量具有可比性(图7D类). 我们还测量了拉特和Stra6系列这些组织中的mRNA水平(图8)。拉特与VAD动物相比，VAS动物在肝脏和肺部的mRNA水平显著升高(图8,A类和B类)。Stra6系列VAS小鼠肺部的mRNA水平也较高(图8B类). 相反，Lrat公司与VAS小鼠相比，VAD小鼠眼睛中的mRNA水平较高，而Stra6系列mRNA表达模式相反(图8C类). 这种调节可以确保在长期限制摄入维生素A的情况下，眼睛主要利用循环holo-RBP来支持视力。

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图7。

受维生素A饮食限制的小鼠眼睛维甲酸稳态得以维持。断奶后，雄性野生型小鼠(n个=5/条件），维持维生素a缺乏或充足（4000 IU维生素a/kg）饮食。20周后，处死动物，测定血清和组织中的维甲酸水平。A类，肝脏中的总视黄醇水平。B类，肺部总维甲酸水平。C类，眼睛中的总维甲酸水平。D类、血清ROL水平。

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图8。

Stra6系列和拉特表达受动物的维生素A状态影响。断奶后，雄性野生型小鼠(n个=5/条件）维持在VAD或VAS（4000 IU维生素a/kg）饮食中。20周后，处死动物，从肝脏、肺部和眼睛中分离出总RNA。Stra6系列和拉特通过qRT-PCR分析测定mRNA表达。A类,拉特肝脏中的mRNA水平。B类,拉特和Stra6系列肺部mRNA表达。C类,拉特和Stra6系列mRNA在肺中的表达。18S核糖体RNA用作肺部和肝脏mRNA表达的内部对照，β-actin用于眼部mRNA表达。数据表示平均值±S.E(误差线). *,第页< 0.05; 学生的t吨测试。