2-脱氧-D-葡萄糖联合治疗对乳腺癌细胞放射敏感性和化学敏感性的增强作用

摘要

简介

乳腺癌是最常见的恶性肿瘤，是全世界女性癌症相关死亡的主要原因[1-三]. 年龄在这类癌症的发病率中起着关键作用，因为已经发现年轻乳腺癌患者的预后比年长的绝经前或绝经后患者差。大量研究指出，34岁以下患者的存活率很低。40-49岁年龄组的女性预后最好[4,5]. 数据表明，激素机制可能在这种年龄预后关系中起关键作用，因为年龄组之间的生存模式差异仅见于激素受体阳性肿瘤患者，而在激素受体阴性肿瘤患者中不存在[5]. 流行病学数据表明，女性乳腺癌的发病率与高脂肪饮食密切相关。此外，乳腺癌细胞具有显著的脂肪生成能力，这些细胞中脂肪代谢的抑制与它们的生长停滞和凋亡有关[2,6].

乳腺癌的治疗包括手术、化疗、放射治疗、激素治疗或联合治疗[1,7]. 雌激素/孕激素受体（ER/PR）阳性的乳腺癌肿瘤对激素治疗有60%的反应，而ER/PR阴性的肿瘤对激素疗法只有5%到10%的反应[7]. 乳腺癌的激素治疗通常在手术、化疗和/或放射治疗后进行。这种疗法旨在通过阻断雌激素的作用来帮助预防疾病复发。三苯氧胺（Tamoxifen）是一些女性在最初治疗乳腺癌后服用长达5年的一种药物，通过阻断乳腺癌细胞上的ER来帮助预防肿瘤复发。激素治疗药物的作用是减缓癌细胞的生长速度，癌细胞在雌激素及其受体的作用下生长[7,8].

放射治疗是癌症治疗中的一种重要治疗方式。近60%的癌症患者接受放射治疗[9]单独或联合手术和化疗[10-12].

不幸的是，常规放射治疗的疗效受到以下因素的限制：1）存在低氧、固有抗辐射和具有修复能力的肿瘤细胞；2） 肿瘤的遗传、代谢和微环境异质性[10]; 和3）对正常健康组织的不良损伤[10,11,13,14]. 因此，只有在全面了解肿瘤和正常组织放射生物学的基础上，开发有效的方法，选择性地增强肿瘤的放射损伤，同时减少对正常组织的损伤，才能显著提高治疗效果[10,11,15]. 在保守手术后，放射治疗现在已成为减少局部肿瘤复发的常规疗法。然而，一些癌细胞对电离辐射诱导的损伤具有内在的抵抗力，这种治疗实际上可以诱导肿瘤细胞增殖和重新繁殖，从而导致对辐射的反应减弱和肿瘤局部控制不佳。更重要的是，缺氧与耐药性和放射治疗敏感性降低有关，部分原因是缺氧诱导因子1（HIF-1）的上调和生存分子的激活，如Akt和活化B细胞的核因子-κB（nuclear factor-κB）的核因子kappa-light-chancer。与缺氧相关的治疗耐药性是癌症临床治疗中的一个重要问题，抑制糖酵解可能为克服这种耐药性提供一种新的方法。事实上，一些研究表明，在缺氧条件下，细胞对糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）的敏感性增加[16]. 己糖激酶是糖酵解反应中的第一种酶，可能是2-DG诱导细胞凋亡的关键调节因子[14,16,17]，因为它使葡萄糖进行新陈代谢(图1). 最近发表的数据支持己糖激酶活性在Akt介导的细胞凋亡预防中的作用[14,17]. 它也不受HIF的调节，因此，当有更多的酶被一定量的2-DG抑制时，细胞可能会变得更具抵抗力[18].

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图1

糖酵解途径及其与磷酸戊酯途径的代谢联系。实心箭头表示糖酵解反应，而虚线箭头表示磷酸戊酯途径。绿色箭头表示糖酵解下游丙酮酸的进一步代谢。五价砷化合物（H_三亚洲标准组织₄)通过在甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）反应中引起砷分解来消除三磷酸腺苷（ATP）的生成（摘自Pelicano H等人，致癌基因2006；25:4633-46，经允许）[16]. HK=己糖激酶；PGI=磷酸葡萄糖异构酶；PFK=磷酸果糖激酶；TPI=三磷酸异构酶；PGK=磷酸甘油酸激酶；PGM=磷酸甘油变位酶；PK=丙酮酸激酶；PDH=丙酮酸脱氢酶；LDH=乳酸脱氢酶。

加速葡萄糖摄取[19]厌氧糖酵解期间（沃伯格效应）[14-17,20-26]糖酵解代谢和呼吸之间的调节缺失[27]，是恶性细胞中发现的主要代谢变化。一般来说，癌细胞的糖酵解速率和磷酸戊酯循环活性增加，呼吸速率略有降低[24,25,27]. 肿瘤中葡萄糖摄取和糖酵解增强是由多种原因引起的，包括基因表达中与致癌转化相关的改变、线粒体突变和实体肿瘤中的缺氧，这些都会导致葡萄糖转运蛋白和糖酵素的水平和活性增强[14,16]. 研究表明，葡萄糖剥夺可通过代谢氧化应激诱导转化的人类细胞类型产生细胞毒性。此外，与非转化人类细胞相比，转化人类细胞类型似乎对葡萄糖剥夺诱导的细胞毒性和代谢氧化应激更敏感[20]. 葡萄糖类似物已被发现能显著抑制癌细胞中的葡萄糖代谢在体外和体内[14,17,20,21]. 在已研究的许多葡萄糖类似物中，2-DG已被证明是抑制细胞代谢和三磷酸腺苷（ATP）生成最有效的[14,17,20,21]. 2-DG是葡萄糖的一种结构类似物，通过氢取代羟基而在第二个碳原子上有所不同(图2A)由于摄取增加，细胞内己糖激酶或磷酸化活性高，以及细胞内磷酸酶水平低，似乎通过代谢捕捉在癌细胞中选择性积累(图2B) [17,21]. 2-DG通过葡萄糖转运蛋白扩散到细胞。一旦进入细胞，2-DG被己糖激酶磷酸化为2-脱氧-D-葡萄糖-6-磷酸（2-DG-6-P）。2-DG-6-P不是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或磷酸己异构酶的底物。因此，一旦形成，2-DG-6-P就不会进一步代谢，因此，糖酵解和戊糖磷酸途径的输出会减少，2-DG-6-P将在细胞中积累，直到被磷酸化酶去磷酸化[16-18,23].

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图2

（A） 葡萄糖和2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）的结构比较。2-DG和葡萄糖在第二个碳上不同。（B） 2-DG动作示意图。2-DG通过葡萄糖转运蛋白进入细胞，并被己糖激酶磷酸化。由于细胞内磷酸酶水平低，2-DG-PO4被困在细胞中。2-DG-PO4无法进行进一步代谢。细胞内高水平的2-DG-6-PO4导致己糖激酶的变构和竞争性抑制。这导致葡萄糖代谢受到抑制（摘自Aft RL等人[17]英国癌症杂志2002；87:805-12，经出版商许可）。

2-DEOXY-D-葡萄糖功能

导致DNA损伤无误修复和固定的细胞过程需要不断流动的代谢能量，而代谢能量通常由癌细胞中增强的糖酵解提供。然而，在正常细胞中，呼吸途径是能量（ATP）生成的主要贡献者[10,15,16,28]. 2-DG的两个特性，即对糖酵解的抑制和在癌细胞中的优先积累，为进一步研究2-DG作为抗肿瘤剂的作用机制奠定了基础。据推测，最初用2-DG处理的癌细胞会因细胞内能量耗尽而表现出应激反应[16,17,27]. 应激反应导致葡萄糖转运蛋白表达水平增加，葡萄糖摄取增加，从而使更多的2-DG进入细胞。由于高细胞内2-DG浓度，己糖激酶和己糖磷酸异构酶受到抑制；ATP等能源储备进一步耗尽；最后，细胞激活细胞死亡途径[16,17]. 此外，在缺糖或用葡萄糖类似物2-DG治疗时，癌细胞中也发现了与代谢氧化应激相一致的促氧化剂生成增加和硫醇代谢的严重破坏[27].

然而，含有癌基因或癌病毒的培养细胞发生恶性转化，导致进入细胞的葡萄糖量绝对增加。这是通过GLUT1葡萄糖转运蛋白基因的转录激活介导的，导致葡萄糖转运蛋白mRNA和蛋白质水平升高。GLUT1蛋白在癌细胞中的表达增加，据报道在细胞应激和葡萄糖缺乏期间也会增加[17,18].

研究表明，2-DG的细胞毒作用在不同的肿瘤细胞系之间是异质的。虽然在一些细胞中发现了严重的生长抑制和细胞死亡，但也有少数报告对生长和克隆形成性产生了边际影响。许多因素促成了这两种不同的反应，包括葡萄糖依赖和糖酵解的程度、ATP耗竭形式的能量缺乏和氧化应激（线粒体代谢）的失衡[23]、葡萄糖转运蛋白水平、c-Myc状态、p53和p21状态[23]以及凋亡调节B细胞淋巴瘤（Bcl）家族蛋白的水平[2,23,29,30]尤其是Bcl2/Bcl-2-相关X蛋白（Bax）比率[23]. 2-DG在缺氧条件下的细胞毒性作用更大，HIF-1的敲除显著提高了缺氧条件下细胞对2-DG的敏感性，提示抑制HIF-1可能提高2-DG等糖酵解抑制剂的临床疗效[14,16,23]. 与单层培养（MLC）相比，2-DG对生长为球形的肿瘤细胞（形成微缺氧区）的毒性更大[14,23].

2-DG诱导的细胞死亡可能是凋亡或坏死，具体取决于细胞类型和环境因素。虽然在c-Myc过度表达的细胞中发现了诱导凋亡的作用，但在耐药的人癌细胞（KB-DR）中也有报道称凋亡死亡增强，这可能与2-DG诱导的glut受体过度表达有关[23]. 已有研究表明，2-DG诱导细胞凋亡与Bcl2无关，而2-DG的细胞毒作用与p53状态无关[23]. 较高水平的过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶降低了p53过表达细胞对2-DG的敏感性，这表明在p53过度表达细胞中2-DG增强细胞杀伤的机制涉及氧化应激。葡萄糖和氧气是糖酵解酶基因转录物的有力调节器，因此，除c-Myc激活外的基因改变也有望使转化细胞对葡萄糖剥夺敏感。此外，葡萄糖本身通过碳水化合物反应元件（choRE）刺激糖酵解酶基因编码的转录，这是一种CACGTG基序，与c-Myc的核心结合位点序列相同[23].

2-脱氧-D-葡萄糖作为放射增敏剂

分析在几种肿瘤细胞系中观察到的2-DG的辐射修饰作用表明，2-DG相对于辐射的给药时间在决定作用方面起着关键作用。通常发现，在照射前（<5分钟）或照射后（<5分钟）立即添加2-DG时，增敏作用更高[10,14,23]，在培养基中存在2到4小时[14,17,23]. 研究还表明，糖酵解抑制剂2-DG在辐照后数小时内可选择性地抑制糖酵化速率高的细胞（如癌细胞）的辐照后修复过程，从而增强辐射造成的损伤[15,16,28].

有报道称，除了能量代谢外，参与损伤反应途径的许多基因的表达也发生了变化，包括DNA修复和凋亡、转录调节物、细胞信号转导等，这些基因可以显著影响肿瘤细胞的放射增敏。在各种人类肿瘤细胞系中，观察到2-DG诱导的辐射反应改变存在很大程度的异质性，而这种异质性与能量状态（ATP水平）下降的程度没有很好的相关性，因此，2-DG引起的其他干扰也在细胞对放疗和化疗药物损伤的反应的改变中发挥重要作用。这些包括（但不限于）葡萄糖转运蛋白（GLUT1和GLUT2）、生前和生产调节因子，即c-Myc、ras、p53、p21、Bcl2/Bax比率等，以及氧化应激的失衡[23].

研究发现，人脑胶质瘤细胞系（BMG-1）产生的多细胞瘤球体（MTS）中2-DG的放射增敏程度比MLC中高出近2.5倍，这与MTS中糖酵解增强有关[23]以及与肿瘤相关的内源性氧化应激和诱导的代谢性氧化应激之间的协同作用[14].

许多研究表明，2-DG可选择性增强化疗药物和电离辐射对癌细胞的损伤，同时减少对正常细胞的损伤[14,21,23]. 2-DG通过抑制DNA修复过程和从潜在致命损伤中恢复等机制使癌细胞对辐射敏感[21,23]. 然而，尽管过去曾多次尝试测试2-DG在放射治疗中的作用，但只有一项针对人脑胶质瘤的临床试验研究表明2-DG提高了放射治疗的疗效[10,15,21].

放射增敏也被认为是由于硫醇代谢的破坏，导致氧化应激相关的细胞以凋亡的形式死亡[23]. 这里值得一提的是，不适当的方案设计实际上可能会通过2-DG降低初级治疗药物的疗效，正如已经报道的放射免疫疗法组合[23]. 2-DG治疗人乳腺癌细胞系导致细胞生长停止，且呈剂量依赖性[17]. 然而，评估葡萄糖使用量、乳酸生成量和能量状态可能有助于预测肿瘤对放疗和2-DG联合治疗的反应[10].

2-环氧-D-葡萄糖作为化疗药物

2-DG与特定的化疗药物协同作用，导致细胞死亡，最敏感的化学物质似乎是那些导致DNA损伤的化学物质[19-21,23]. 此外，2-DG已被证明能抑制人乳头状瘤病毒的转录，这表明它是一种理想的佐剂，可以提高化疗治疗耐药宫颈癌的疗效[23]. 2-DG还增强了顺铂和阿霉素的细胞毒性[16,20,23,27]. 根据一些研究的结果[20,23,27,31]有人提出，2-DG可能是化疗耐药患者的良好化疗增敏剂，因为它可以改变活性氧物种（ROS）或氧化还原状态，并使细胞对化疗药物造成的进一步损伤敏感。研究发现，与2-DG或阿霉素单独使用相比，2-DG和阿霉素联合使用对快速分裂的细胞（如T47D乳腺癌细胞株）具有显著的细胞杀伤能力，而对缓慢生长的细胞（例如MCF-7乳腺癌细胞系）没有影响[19]. 2-DG作为放射治疗和化疗的辅助药物显示出良好的效果在体外和体内[14].

正常组织毒性

在正常细胞中，生长受外部生长信号和营养支持的调节。相反，癌细胞对大多数外部生长信号失去了反应性，因此，以葡萄糖形式提供的营养物质可能在维持癌细胞生存能力方面发挥着独特的作用。因此，正常细胞和转化细胞以相反的方式对营养物质消耗或葡萄糖缺乏作出反应。正常细胞通过增加葡萄糖转运蛋白的表达或修饰进行补偿，而转化细胞则通过葡萄糖剥夺受到应激，导致一系列应激相关基因的表达，随后细胞死亡。在许多正常细胞类型中，葡萄糖缺乏导致葡萄糖转运的最大速度增加。这被归因于几种机制之一；转运体从细胞间室转移到质膜，谷氨酸转运体的糖基化模式发生变化，蛋白质周转减少，或mRNA和蛋白质合成增加[17]. 当糖酵解被抑制时，正常细胞中完整的线粒体使其能够利用替代能源，如脂肪酸和氨基酸，产生代谢中间产物，通过呼吸进入三羧酸循环，以生成ATP[16,18]. 因此，线粒体正常的细胞对抑制糖酵解的药物不太敏感[16].

2-DG在厌氧生长细胞中产生的效果是好氧生长细胞的四到五倍。有氧和缺氧细胞中糖酵解阻断的结果不同。在需氧细胞中，如果2-DG抑制糖酵解，则ATP不能通过该途径生成。然而，由于O₂可用于线粒体，氨基酸和/或脂肪酸可以作为能量提供碳源，进行氧化磷酸化（OxPhos），产生ATP。相反，当缺氧细胞中的糖酵解被阻断时，其他碳源不能被线粒体用作O₂不可用，因此无法进行OxPhos。因此，当缺氧细胞中的糖酵解被阻断时，它就没有其他生成ATP的方法，因此，最终会屈服于这种治疗[18].

讨论

一般来说，癌细胞表现出糖酵解和磷酸戊酯循环活性增加，而呼吸速率仅略有降低。最初，这些代谢差异被认为是呼吸机制“受损”的结果，而肿瘤细胞被认为通过增加糖酵解来弥补这一缺陷。然而，如果癌细胞增加葡萄糖代谢，形成丙酮酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）作为一种补偿机制，以响应氧化能代谢副产物形成的活性氧，那么，葡萄糖代谢的抑制有望使癌细胞对过氧化氢水平升高的药物（即电离辐射和化疗药物，如氧化还原循环已知并产生ROS的醌类药物）敏感。虽然不可能剥夺细胞的葡萄糖体内2-DG是一种相对无毒的葡萄糖类似物，它通过葡萄糖转运蛋白与葡萄糖竞争吸收，并在糖酵解的切入点被己糖激酶磷酸化。2-DG和葡萄糖之间的竞争被认为会抑制葡萄糖代谢，从而产生化学诱导的葡萄糖剥夺状态。尽管有报道称，磷酸化形式的2-DG（2-DG-6-P）可以通过戊糖循环的第一步（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）导致NADPH的一个分子再生，但2-DG-6-P似乎无法在戊糖循环中进一步代谢，也无法代谢为丙酮酸。Ahmad等人[20]研究表明，给小鼠注射2-DG可能是一种有效的抑制葡萄糖代谢的方法，在达到非常高的水平（致死剂量50≥2 g/kg体重）之前不会引起毒性，并且当剂量高达200 mg/kg时，人类可以耐受。因此，使用2-DG作为葡萄糖代谢抑制剂体内可能为限制过氧化氢代谢的多形式癌症治疗提供了一种非常有效的补充，以提高人类癌症的放射和化学敏感性。

Singh等人[32]研究表明，快速分裂的DU145前列腺癌细胞的生长速度依赖于高水平的葡萄糖消耗，而相对生长缓慢的LNCaP细胞的生长速率则不太依赖于葡萄糖。他们发现，这两种细胞系的糖酵解能力与葡萄糖缺乏引起的生长抑制程度直接相关。他们的结果也与早期的研究一致，这些研究表明，糖酵解能力与几种大鼠肝癌肿瘤的生长速度之间存在直接关系，并进一步支持了这样一种假设，即大多数癌细胞的快速增殖需要高糖消耗。Zhao等人[33]也表明，有氧糖酵解增加是癌症的一个特征，抑制糖酵分解可能提供一种有希望的策略来优先杀死癌细胞。他们提出，曲妥珠单抗单独使用或与其他化疗药物联合使用时，对禽红细胞增多症癌基因B2（ErbB2）阳性乳腺癌具有显著疗效。他们的研究表明，曲妥珠单抗与糖酵解抑制剂联合使用，通过下调ErbB2阳性癌细胞中的热休克因子1（HSF1）和乳酸脱氢酶A（LDHA），抑制糖酵化，从而对ErbB2-阳性乳腺癌具有抗肿瘤作用，从而抑制肿瘤生长。此外，通过HSF1和LDHA增加糖酵解有助于trastuzumab耐药性[32]. 据了解，葡萄糖代谢似乎与细胞内过氧化氢的解毒有关，其他作者认为肿瘤细胞内过氧化氢生成增加。有人提出，肿瘤细胞增加葡萄糖代谢的程度可以预测肿瘤对葡萄糖剥夺诱导的细胞毒性和氧化应激的敏感性。因此，当使用糖酵解代谢抑制剂（即2-DG）剥夺葡萄糖时，与葡萄糖利用率低的肿瘤细胞和正常细胞相比，葡萄糖利用率高的肿瘤细胞对呼吸依赖性代谢氧化应激导致的细胞死亡更敏感。据推测，这是因为高糖利用率的癌细胞产生更多的O₂和H₂O（运行）₂从它们的线粒体电子传递链。2-DG在临床上是葡萄糖的相关竞争对手，因此会产生化学诱导的葡萄糖剥夺状态。2-DG抑制动物的葡萄糖代谢，除在非常高的水平（>2 g/kg体重）下外，它对动物无毒。人体可耐受高达200 mg/kg体重[19].

Zhang和Aft[21]，关于分析2-DG加/不加其他化疗药物的效果(图3)据报道，2-DG与阿霉素、5-氟尿嘧啶、曲妥珠单抗和环磷酰胺联合使用对细胞毒性有更大的加性作用。一方面，他们没有观察到2-DG与顺铂在乳腺癌细胞中的细胞毒性增强，而乳腺癌细胞存在于头颈癌中[20]. 另一方面，体内获得的数据显示了2-DG的放射增敏效应。在本研究中，与对照组相比，2-DG或放射治疗显著抑制肿瘤生长。虽然高剂量辐射几乎完全抑制了辐射治疗组的肿瘤生长，但添加2-DG进一步增强了辐射的疗效。更重要的是，2-DG和辐射联合处理后，辐射增强效果长期稳定。之前的一些研究也表明，2-DG可以增强辐射对小鼠胰腺癌和头颈癌的影响。因此，对于p53阳性的癌症，当与2-DG联合使用时，低剂量的辐射可能有效[21,31].

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图3

与2-脱氧-D-葡萄糖SKBR3细胞的药物组合总结，使用指定的试剂培养24小时（摘自Zhang F等人[21]癌症研究与治疗杂志2009；5补充1:S41-3，未经出版商事先许可，允许使用）。

结论

2-DG单独或与电离辐射和化疗药物等其他细胞毒性药物联合诱导细胞对代谢应激反应的确切分子机制似乎很复杂，尚待完全阐明。利用已建立的肿瘤细胞系阐明2-DG的放射增敏和化学增敏的各种机制，对于设计使用2-DG进行癌症治疗的有效方案非常有用。

脚注

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