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自然。作者手稿；PMC 2012年6月6日提供。
以最终编辑形式发布为：
自然。2011年11月17日；479(7373): 365–371.
2011年10月19日在线发布。 数字对象标识：10.1038/自然10572
预防性维修识别码：项目经理3368121
NIHMSID公司：NIHMS373069
PMID：22012258

长寿的跨代表观遗传秀丽线虫

埃里克·格里尔,1,2 特拉维斯·J·莫尔斯,1 Duygu Ucar公司,1 安娜·豪斯沃思,1 埃琳娜·曼奇尼,1 贾纳·P·林,1 贝瑞妮斯·贝纳永,1 杨石,2和安妮·布鲁特1
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关联数据

补充资料

摘要

染色质修饰物调节几种生物体的寿命，这引发了一个问题，即亲代染色质状态的变化是否会在下一代被不完全重新编程，从而影响后代的寿命。组蛋白H3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3）复合物由ASH-2、WDR-5组成，组蛋白甲基转移酶SET-2调节秀丽线虫寿命。在这里，我们表明H3K4me3染色质修饰物ASH-2、WDR-5或SET-2在亲代中的缺陷将后代的寿命延长到第三代。ASH-2复合体成员的寿命延长跨代遗传依赖于H3K4me3脱甲基酶RBR-2，并且需要后代中存在功能性生殖系。寿命的跨代遗传是H3K4me3甲基化复合物的特异性，与基因表达的表观遗传变化有关。因此，仅在父母身上操纵特定染色质修饰物可以诱导后代长寿的表观遗传记忆。

结果

已经描述了一些性状的跨代表观遗传，包括植物的花对称性和颜色1–三，蠕虫的子代生产4，果蝇的热应激反应和眼睛颜色5–7哺乳动物的皮毛颜色8–10然而，寿命的跨代表观遗传，以及更普遍的复杂性状，在很大程度上尚不明确。染色质调节剂已被证明可以调节几种物种的寿命11–18这增加了父母的染色质变化可能不会在代际间完全重置的可能性，从而也调节了后代的寿命。由ASH-2、WDR-5和SET-2组成的H3K4me3调节复合物的缺陷延长了秀丽线虫12我们询问H3K4me3调节复合体（ASH-2、WDR-5和SET-2）的成员仅在父母一代中的扰动是否可以调节后代的寿命秀丽线虫.

长寿的代际传承

我们首先关注WDR-5，这是ASH-2复合物的保守调节成分19其消耗降低H3K4me3水平12,20–22延长蠕虫的寿命12为了测试长寿是否可以通过跨代表观遗传方式遗传，我们将野生型雄性与wdr-5（ok1417）突变两性体以产生F1杂合两性体(图1a). 这些F1杂合雌雄同体进行基因分型，然后自交产生F2雌雄同株（野生型、杂合型和纯合型）wdr-5型基因座），在他们生下F3代后代后进行基因分型。同时，我们将野生型雄性与野生型雌雄同体杂交，以产生纯野生型后代，并控制杂交而非自交可能产生的任何有益的长寿效应(图1a). 检测了F3、F4和F5代蠕虫的寿命。有趣的是，野生型F3是P0的后代wdr-5型父母（+/+来自P0wdr-5型与纯野生型父母的后代（P0 N2父母的+/+）相比，父母的寿命仍延长了约20%（p<0.0001）(图1b). 这20%的寿命延长与纯F3的寿命延长幅度相似wdr-5（ok1417）突变体(wdr-5/wdr-5) (图1b). 基因野生型后代的寿命wdr-5（ok1417）突变亲本（来自P0的+/+wdr-5型父母）在F4代仍在延续(图1c)，但在F5代中不再扩展(图1d). 因此，wdr-5型只有父母一代的缺陷才能延长后代的寿命。由于F5代的寿命，野生型后代wdr-5型突变的父母不再延长寿命，F3和F4代中观察到的寿命延长不太可能是由于父母中可能存在的外来突变wdr-5型突变株。相反，寿命的跨代遗传可能是由于H3K4me3本身或另一种只能遗传有限代的分子中的表观遗传变化。

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wdr-5突变父母的野生型遗传后代延长了几代人的寿命

一，用于从生成野生型后代的方案wdr-5（ok1417）变异蠕虫。b–d段，野生型F3（b）、F4（c）、F5（d）后代的寿命wdr-5（ok1417）突变蠕虫（来自P0的+/+wdr-5型与野生型（N2）蠕虫的后代相比（来自P0 N2亲本的+/+）。平均寿命和统计数据见补充表1.

接下来，我们询问SET-2是否也观察到寿命的跨代表观遗传遗传能力，SET-2是一种H3K4me3甲基转移酶，与ASH-2和WDR-5一起发挥调节H3K4me3水平的功能12,20–22和寿命秀丽线虫12(图2). 与我们观察到的情况类似wdr-5型，遗传野生型后代集合-2（ok952）在F3和F4代中，突变体仍表现出约30%的寿命延长（p<0.0001）(图2b，c)，但不适用于F5代(图2d). 基因野生型F3是反向杂交的后代–P0集合-2（ok952）与野生型雌雄同体杂交的雄性也长寿(补充表1)这表明寿命的跨代遗传与父母一代的特定性别无关。

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来自set-2突变父母的野生型后代延长了几代人的寿命

一，用于从生成野生型后代的方案集合-2（ok952）变异蠕虫。b–d段，遗传野生型F3（b）、F4（c）和F5（d）后代的寿命集合-2（ok952）突变蠕虫（来自P0的+/+集合-2与野生型（N2）蠕虫的后代相比（来自P0 N2亲本的+/+）。平均寿命和统计数据见补充表1.

ASH-2对H3K4二甲基化（H3K4me2）转化为H3K4me3非常重要（参考。23).灰烬-2蠕虫击倒降低L3阶段全球H3K4me3水平12,22并延长使用寿命12。我们问是否灰烬-2只有父母一代的击倒才会影响几代后代的寿命。将野生型亲本蠕虫（P0）放在含有表达RNAi的细菌的平板上灰烬-2从出生到幼虫阶段L4，然后每天切换到含有OP50-1细菌和链霉素的平板上，持续三天，以选择性地阻止RNAi表达细菌的生长(图3a). 内源性灰烬-2在P0代中，mRNA和ASH-2蛋白水平显著降低，但在随后的世代中恢复到正常水平(图3b，c)，表明灰烬-2RNAi本身不是遗传的。F1、F2和F3代蠕虫的寿命，其中灰烬-2仅在P0亲本代中被击倒，与P0亲代中用空载体控制的蠕虫后代相比，仍显著延长（19-27%，p<0.0001）(图3d–g). 相比之下，F4代后代不再延长寿命(图3h). 我们在漂白P0蠕虫后获得了类似的结果，以避免RNAi表达细菌的潜在携带（数据未显示）。因此，父母中H3K4me3甲基转移酶复合物（ASH-2、WDR-5、SET-2）成分的改变会影响后代的寿命，这支持了寿命的跨代遗传可能是由于表观遗传变化引起的，这种表观遗传改变可能只会遗传有限的几代。

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仅在父母一代中敲除灰烬-2可延长几代人的寿命

一，从RNAi治疗的父母中产生野生型后代的方案。b条,灰烬-2不同代虫在第7天的mRNA水平灰烬-2RNAi或空载体（控制）仅在P0代。3个独立实验的平均值±标准误差***p=0.0002，配对t检验。c（c）处理后不同代虫L3期ASH-2蛋白水平灰烬-2RNAi或空载体（控制）仅在P0代。2个独立实验的代表。*：非特异性带；箭头：ASH-2；箭头：与ASH-2相关的蛋白质，可能是一种降解产物。d–h日，P0（d）、F1（e）、F2（f）、F3（g）和F4（h）代蠕虫的寿命，RNAi敲除灰烬-2仅限于父母。对照RNAi：空载体。平均寿命和统计数据见补充表2.

H3K4me3脱甲基酶和生殖系的重要性

H3K4me3脱甲基酶RBR-2对于ASH-2复合物成员缺陷引起的寿命延长是必要的12我们询问ASH-2复合体成员的缺陷导致的寿命跨代延长是否依赖于RBR-2。野生型F3的寿命由P0下降wdr-5型父母（+/+来自P0wdr-5型父母）不再在红色-2RNA干扰(图4a、b). 类似地，F3野生型派生自集合-2；红色-2父母（+/+来自P0集合-2；红色-2父母）不再长寿(补充图1). 总之，这些数据表明，由于H3K4三甲基化复合物成员缺陷而导致的寿命跨代遗传依赖于H3K4me3脱甲基酶RBR-2。野生型后代的寿命wdr-5型和集合-2突变体因缺乏红色-2还表明，这种延长的寿命不太可能是由wdr-5型或集合-2菌株。rbr-2型突变或击倒并没有导致后代寿命缩短(补充图2)这表明RBR-2缺乏本身不会以跨代方式影响寿命。

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ASH-2复合物成员缺陷导致的寿命跨代遗传取决于H3K4me3脱甲基酶RBR-2和完整生殖系的存在

a–b，遗传野生型F3后代的寿命wdr-5（ok1417）突变蠕虫（来自P0的+/+wdr-5型父母）在存在空载体（对照RNAi）（a）或rbr-2型RNAi（b）。c–d码，寿命前列腺素-1F3派生自wdr-5（ok1417）；前列腺素-1（bn101）变异蠕虫(pgl-1/pgl-1来自P0wdr-5；前列腺素-1位父母）与前列腺素-1（bn101）蠕虫在允许温度（16℃）（C）和限制温度（25℃）（d）下生长。平均寿命和统计数据见补充表3和4.

ASH-2复合物的调节导致的寿命取决于功能性生殖系12为了测试ASH-2复合物成员缺陷的蠕虫野生型后代是否也需要存在功能性生殖系以延长寿命，我们使用了温度敏感的雌性化fem-3（2006年）变种蠕虫，在限制温度下不产生成熟卵24.击倒灰烬-2和wdr-5型只有父母延长了F1代的寿命fem-3（2006年）允许温度（16°C）下的突变蠕虫，但限制温度（25°C）除外(补充图3). 为了独立检测ASH-2复合物突变体野生型后代的寿命是否需要生殖系，我们使用了前列腺素-1（bn101）在限制温度下不能形成功能性生殖系的温度敏感突变体25(图4c，d). F3代前列腺素-1后代wdr-5；前列腺素-1与之相比，突变父母的寿命不再延长前列腺素-1后代前列腺素-1限制温度（25°C）下的亲本(图4c、d). 因此，一个功能正常的成人生殖系对于ASH-2复合体成员缺陷的父母的野生型后代的长寿命是必要的。

寿命表观遗传记忆的特异性

然后我们问，寿命的跨代遗传是H3K4me3修饰物特有的还是其他标记的染色质修饰物也能观察到(设置-9,设置-15、和utx-1型)，以及更普遍的已知长寿途径中的基因：胰岛素信号传导(年龄1和多德-23)，线粒体(cco-1型和cyc-1型)和抗应力(asm-3型)12,17,18,26–32与我们观察到的情况相反灰烬-2和wdr-5，击倒设置-9,设置-15,utx-1型,年龄1,asm-3、cco-1、cyc-1、，和国防部-23只有父母没有延长F1代的寿命(图5a、b,补充图5). 类似地，遗传野生型F3是长寿的后代daf-2（e1370）33突变蠕虫（来自P0的+/+daf-2型父母）的寿命没有显著延长（6%p=0.1955）(图5c、d). 总之，这些发现表明，寿命的转基因延长对H3K4me3染色质修饰物是相对特异的，并进一步表明H3K4me3标记可能对世代之间寿命的表观遗传记忆很重要。与ASH-2复合物的成员不同，SET-9、SET-15和UTX-1以独立于生殖系的方式调节寿命12,17,18，寿命的跨代遗传也可能是由在生殖系中起作用的染色质调节器所特有的。

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其他寿命监管机构对寿命没有跨代影响

a–b、经处理的蠕虫P0（a）和F1（b）代后代的寿命集合-9、集合-15、utx-1、和wdr-5型RNAi仅在P0代。控制RNAi：空矢量。c（c），产生野生型后代的方案daf-2（e1370）变异蠕虫。d日，遗传野生型F3后代的寿命daf-2（e1370）突变蠕虫（来自P0的+/+daf-2型父母）。平均寿命和统计数据见补充表2和4.

基因表达的跨代遗传

接下来，我们确定寿命的跨代遗传是否与H3K4me3的可遗传变化相关。Western blot和免疫细胞化学显示，F3和F4代野生型后代的全球H3K4me3水平没有降低wdr-5型和集合-2父母或F1和F2代后代灰烬-2或wdr-5型只在父母中击倒(图6a、b,补充图6、7). 因此，寿命的跨代遗传不太可能由H3K4me3水平的遗传性全球下降介导。寿命的跨代遗传可能与H3K4me3在某些位点的可遗传局部变化有关，这可能影响与寿命有关的某些基因的表达。为了验证这个想法，我们比较了野生型后代的全基因组基因表达wdr-5型突变型和野生型祖先wdr-5型F4和F5代的突变后代(图6c). 对于每种情况，我们从蛋黄的第一天或第二天收集了三倍的L3期蠕虫(图6c)，与寿命分析所用样本对应的第一天蛋黄染色。微阵列（SAM）统计分析确定759个基因在wdr-5型与野生型蠕虫相比，无论是哪一代的纯突变体(补充表7)和产卵日(补充图8a)（p=2.38×10−116，超几何概率）。这些WDR-5调节基因丰富了长寿、发育和生长基因本体（GO）术语(补充图8b)，与WDR-5报告的功能一致12,21,22如预期，WDR-5调节基因与ASH-2调节基因显著重叠12（p=6.14×10−12超几何概率，补充图8c)并且富集H3K4me3（参考文献。34,35)（p=2.49×10−34超几何概率，补充图8d). 这些观察结果表明，WDR-5与ASH-2一起通过调节这些位点上的H3K4me3来调节基因子集。

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与野生型亲本后代相比，wdr-5突变亲本的野生型后代在基因表达上表现出差异，但在全球H3K4me3水平上没有差异

a–b，通过蛋白质印迹法（a）在F4代中或通过免疫细胞化学法（b）在来自遗传野生型后代的L3蠕虫的F3代中的整体H3K4me3水平wdr-5型父母(+/+从wdr-5型)或野生型父母(+/+来自N2），以及wdr-5型突变体(wdr-5型). 比例尺：50μm。c（c），从交叉生成野生型后代的方案wdr-5（ok1417）空变异蠕虫和野生型蠕虫。符号表示在卵子孵化的第一天（封闭符号）或第二天（开放符号），来自3个独立F2祖先的L3蠕虫的RNA样本。d日，WDR-5调控基因从产蛋第一天起的无偏分层聚类(补充表9). Pvclust值显示在树状图的每个节点上。大于95的值被视为重要。e（电子），对蛋清第一天的整个微阵列数据集进行主成分分析（PCA）(补充表5). PC：主要部件。符号表示卵生第一天收集的L3蠕虫的基因表达数据（图6c）。

我们询问一些WDR-5调节基因的表达是否可能是转基因遗传。有趣的是，WDR-5调节基因的一个重要亚群在来自wdr-5型F4代的突变蠕虫(图6d,补充图10a)，但不适用于F5代(图6d,补充图10a)与F5代恢复正常寿命一致。无偏分层聚类分析表明，WDR-5调控野生型后代的基因wdr-5型突变亲本与野生型亲本在F4代仍然单独聚集，但F5代没有聚集(图6d,补充图10a). 主成分分析（PCA）证实wdr-5型F4代的父母与野生型父母很容易区分，而F5代则不然(图6e,补充图10b). 具有跨代遗传表达的基因对H3K4me3的富集程度比偶然预期的略高（卵黄第一天和第二天的超几何概率分别为p=0.0123和p=0.0769），并且可能代表受H3K4me3标记丢失影响最大的基因。这些基因中有许多是已知的长寿调节因子，在生殖系中表达(补充表7). 对具有跨代遗传表达的基因进行GO分析表明，不同类型的代谢途径丰富了这些基因(补充图9，10c)增加了代谢变化可能在表型遗传力中发挥作用的可能性。具有跨代遗传表达的基因在放蛋的第一天与第二天是不同的，并且当来自不同放蛋日的样本合并时，这些基因不再被识别（E.L.G.和A.B.，数据未显示）。这可能是因为卵子孵化第一天产生的蠕虫可能更容易受到H3K4me3耗竭的影响，因为每个采集日可能代表快速变化的L3阶段的不同快照36或由于基因表达的跨代遗传中固有的随机性。总的来说，这些结果表明祖先H3K4me3状态影响后代数代的基因表达。

讨论

我们的研究提供了长寿的表观遗传的第一个例子。组蛋白甲基化标记和DNA甲基化通常在表观遗传重编程的世代之间被清除，但并不总是这样37,38我们的观察结果与特定基因座的H3K4me3可能不会被完全清除和补充的观点一致。或者，ASH-2/WDR-5/SET-2复合物可以控制负责组蛋白甲基化标记代际擦除和补充的基因的表达。父母中H3K4me3修饰物的调节也可能影响一种未知的蛋白质或RNA，而这种蛋白质或RNA又可能遗传并导致寿命改变。有趣的是，H3K4me3调节因子被认为在眼睛颜色的遗传中起作用果蝇属5,6和活性转录状态粘液菌39由于ASH-2 H3K4me3调节复合物在酵母和人类之间是保守的，因此在父母中操纵该复合物可能会对哺乳动物的寿命产生遗传影响。

补充方法

蠕虫菌株

wdr-5（ok1417）和集合-2（ok952）菌株由隐杆线虫病遗传中心。野生型（N2），wdr-5（ok1417）、和第2套（ok952）菌株的基因型mut-16（mg461），一种影响RNAi效率的突变，在几个实验室菌株中被发现为外来突变。这些菌株不含mut-16（mg461）突变。wdr-5（ok1417）通过将野生型N2雄性与wdr-5（ok1417）雌雄同体。第2套（ok952）通过将野生型N2雄性与集合-2（ok952）雌雄同体。寿命的跨代遗传在数量和世代数方面相似，无论是wdr-5（ok1417）和集合-2（ok952）蠕虫被回交4到9次或4到6次（参见补充表1)，反对简单的回交效应来解释野生型后代寿命的增加wdr-5型或集合-2父母。rbr-2（tm1231）变异蠕虫回交7次，daf-2（e1370）我们的实验室又将变异蠕虫回交了两次，集合-2（ok952）和rbr-2（tm1231）分别回交两次和六次，然后再交叉生成集合-2（ok952）；rbr-2（tm1231）然后再与野生型N2蠕虫杂交一段时间，wdr-5（ok1417）和pgl-1（bn101ts）在一起交叉生成wdr-5（ok1417）；pgl-1（bn101ts）然后再过一段时间pgl-1（bn101ts）蠕虫。对于涉及的十字架集合-2（ok952）；rbr-2（tm1231）为确保第二个突变位点的基因型，对每个独立株系的6个F3子代进行基因分型。温度敏感型fem-3（2006年）突变蠕虫要么保持在16°C，要么在出生时切换到25°C，并在其整个生命周期中保持在这个温度。温度敏感型前列腺素-1（bn101）和wdr-5（ok1417）；前列腺素-1（bn101）在F2亲本L4期，突变蠕虫要么保持在16°C，要么切换到25°C。这些蠕虫的F3子代在其整个寿命期间都保持在16°C或25°C。

RNA干扰

将成虫放在含有氨苄西林（100 mg·ml）的NGM板上−1)和IPTG（0.4mM）接种相应的细菌，并在4-6小时后移除，以获得同步的蠕虫种群。用表达相关基因dsRNA的载体转化的HT115（DE3）细菌均来自Ahringer文库（M.W.Tan的礼物），但RNAi至红色-2那是Open Biosystems图书馆的（K.Shen赠送的礼物）。在L4期，将P0蠕虫移至含有链霉素（300μg·ml）的NGM板上−1)接种抗链霉素的OP50-1细菌，以消除任何可能残留的对链霉素敏感的RNAi HT115（DE3）细菌。每天将P0蠕虫换成新鲜的OP50-1种子盘，直到生命的第6天（成年的第2天）。第6天，允许P0蠕虫产卵4-6小时，从这些培养皿中取出该阶段的后代，并检查其寿命。将幼成虫F1、F2、F3或F4放在新鲜OP50-1种子板上4-6小时，获得后续世代。在中执行RNAifem-3（2006年）突变蠕虫，一组P0蠕虫保持在16°C，以便它们为F1代产卵，而第二组P0蛔虫则在16°C~25°C下进行寿命分析。RNAi至红色-2在F3代的卵子或L1阶段启动wdr-5（ok1417）变异蠕虫，野生型的后代wdr-5（ok1417）变异蠕虫和野生型父母的野生型后代。

定量RT-PCR

连续两天将200条蠕虫与OP50-1细菌一起放入NGM培养皿中过夜。然后将蠕虫挑选到无细菌的NGM板上，并用M9缓冲液（22 mM KH）清洗三次2人事军官4，34毫微米K2高性能操作4，86 mM氯化钠，1 mM硫酸镁4). 将蠕虫颗粒重悬于Trizol（Invitrogen）中，然后在液体N中进行六次冻融循环2根据制造商的协议，使用寡核苷酸dT引物，使用Superscript II逆转录酶（Invitrogen）逆转录1μg总RNA。使用iQ SYBR green（Bio-Read）或LightCycler480 SYBR greenI master（Roche），使用以下引物对Bio-Rad iCycler或Roche LightCyscler 480II进行实时PCR：pan-actin F:TCGGTGGACAGAAGAAGAC，pan-actin-R:CATCCCAGTGTGACGATA，灰烬-2F： CGATCGAAACACAGAACGGA，灰烬-2R： TGCCGGAATCTGTGCAGTTTTT公司，wdr-5型F： CCCTGAAACAATACCAGACCG、，wdr-5型R： AACTGGATGAATCGGAGGC。实验重复进行，结果表示为2（−（靶基因周期数pan–肌动蛋白周期数））.

蛋白质印迹分析

蜗杆同步生长到L3阶段，并用M9缓冲液（22 mM KH）冲洗平板2人事军官4,34米公里2高性能操作4，86 mM氯化钠，1 mM硫酸镁4). 在M9缓冲液中多次清洗蠕虫，并在N液体中快速冷冻2将样品缓冲液（2.36%十二烷基硫酸钠、9.43%甘油、5%β-巯基乙醇、0.0945 M Tris HCl pH 6.8、0.001%溴酚蓝）添加到蠕虫颗粒中，并在液体N中反复速冻2在~15W（VirSonic 600）条件下将蠕虫提取物超声3次，持续30秒，煮沸2分钟，然后在SDS-PAGE（10%或14%）上进行解析，并转移到硝化纤维素膜上。将膜与一级抗体（H3K4me3（Abcam ab8580，Millipore 07-473），1:500；H3（Abcam ab1791），1:1000；ASH-2抗体50（B.J.Meyer博士的礼物），1:2000，α-管蛋白（Sigma T9026），1:1000），并使用辣根过氧化物酶结合抗兔二级抗体（Calbiochem 401393）和ECL Plus（Amersham Biosciences）可视化一级抗体。

整体免疫细胞化学

多次清洗蠕虫以去除细菌，并将其重新悬浮在固定溶液中（160 mM KCl、100 mM Tris HCl pH 7.4、40 mM NaCl、20 mM Na2EGTA、1 mM EDTA、10 mM亚精胺HCl、30 mM管道pH 7.4、1%Triton X-100、50%甲醇、2%甲醛），并在液态N中进行两轮快速冷冻2将蠕虫在4°C下固定30分钟，并在T缓冲液（100 mM Tris HCl pH 7.4，1 mM EDTA，1%Triton X-100）中短暂清洗，然后在37°C下添加1%β-巯基乙醇的T缓冲液中培养1小时。用硼酸盐缓冲液（25 mM H）清洗蠕虫三BO公司三，12.5 mM NaOH pH 9.5），然后在含有10 mM DTT的硼酸盐缓冲液中培养15分钟。在含有1%BSA的PBST（PBS pH 7.4，0.5%Triton X-100，1 mM EDTA）中阻断蠕虫30分钟，并用H3K4me3抗体（Millipore 07–473；1:100）和Alexa Fluor 594二级抗体（Invitrogen；1:25–1:100）孵育过夜。添加DAPI（2 mg/ml）以可视化细胞核。这些蠕虫被安装在显微镜载玻片上，并使用徕卡SP2共焦系统或蔡司Axioskop2+荧光显微镜进行观察。

单型基因分型

将单个蠕虫置于5μl蠕虫裂解缓冲液中（50 mM KCl，10mM Tris pH 8.3，2.5 mM MgCl2，0.45%NP40，0.45%吐温-20，0.01%明胶（w/v）和60 mg/ml蛋白酶K），并在−80°C下孵育1小时，60°C下孵化1小时，然后在95°C下培养15分钟。使用以下引物进行PCR反应：集合-2F： TGAAAGGATGACTCGTGGC，集合-2R： cgatgagaaaggggattttgtaac，wdr-5型F： TTGTGTTCGCTGTGCATG公司，wdr-5型R： GTATTTGCTCTCCGGTCGATC，mut-16型F： AATATTCGATCGGCAAGCAG公司，mut-16型R： CCCGCCGATACAGAAACTAA、，红色-2F： CAAGTGTCGTGTGATGCTGTGG，红色-2R： TGGCGATTGGAAACTCCGAG公司，前列腺素-1F： TGATGTGATTGCCGAGGAAACAC，前列腺素-1R；GCTGAAGAAGACTGAGACTAAGCGCTAAG公司，daf-2型F： acctggagttcgctcaagttttg公司daf-2型R： TGCTTCGCTTTCATCGGTC PCR反应根据制造商的协议（Qiagen）进行，PCR反应在琼脂糖凝胶上进行解析。daf-2型PCR产物用BlpI消化以区分野生型和daf-2（e1370）基因型。前列腺素-1PCR产物用MseI消化，以区分野生型和前列腺素-1（bn101）基因型。

微阵列分析

使用RNAqueous试剂盒（Ambion）分离总RNA。利用寡核苷酸阵列（Affymetrix，GeneChip秀丽线虫基因组阵列）。未经过滤的原始微阵列结果保存在基因表达总表（GEO）的子系列条目GSE31043下。使用RMA（稳健多阵列分析）进行背景调整和归一化。微阵列显著性分析中的两类非配对分析51用100个排列和1×106随机数生成器的种子和5%的错误发现率（FDR），用于比较wdr-5型突变体和野生型亲本的野生型后代。为了获得5%的FDR，在蛋清第一天（第1天）采集的样品使用1.06δ值，在蛋黄第二天（第2天）采集样品使用0.93δ值。然后使用这两个列表中显著变化的探针来比较来自野生型亲本的野生型后代和来自wdr-5型每代父母使用5%的FDR。为了获得5%的FDR，F4代在第1天使用0.66δ值，F5代在第2天使用0.09δ值，而F5代则在第2天用0.92δ值，第2天用0.61δ值。来自的野生型后代的类似结果wdr-5型当对整个标准化基因列表执行SAM时，观察到父母与野生型父母的野生型后代的比较。

分层聚类

每天WDR-5调节基因子集的完整连锁层次聚类(补充表9和10)使用基因簇3.0执行。使用Java Treeview对聚类结果进行了进一步分析。使用Pvclust进行进一步的统计分析52在聚类分析中，基因和阵列使用平均值居中。使用R包“Pvclust”应用完全连锁层次聚类。由于数据居中，使用非居中Pearson相关系数作为相似性度量，随后将其从1中减去以修改为不同。通过1000次引导复制进行了实验。

主成分分析

主成分分析（PCA）53是在所有标准化的基因列表上进行的(补充表5和6). 在进行主成分分析之前，对数据进行缩放以获得单位方差。使用了R包“Stats”中的Prcomp函数。绘制了第一主成分和第二主成分（PC1和PC2）。

来自ModENCODE的H3K4me3 ChIP-ChIP数据集以及数据集之间的比较

H3K4me3 ChIP-ChIP数据集由modENCODE联盟从L3阶段的蠕虫中生成34,35数据、协议和抗体信息可在modENCODE数据协调中心访问(http://interline.modencode.org)，登录ID 3550。批准在暂停出版期间使用该数据集（S.Strome，个人通信）。原始未过滤的ChIP-ChIP数据存放在GEO的子系列条目GSE30789下。H3K4me3 ChIP强度信号除以输入信号，对数变换，居中至平均零，并缩放至标准偏差1。使用ChIPOTle程序调用H3K4me3富集峰（4493）(54,http://sourceforge.net/projects/chipotle-2/)p值截止值为10−20、窗口大小500 bp、步长100 bp和Bonferroni p值校正。从WormBase WS170中获得了基因坐标列表（转录start-end）(网址：http://www.wormbase.org/). 通过识别与其5′区（转录起始点上游和下游500 bp）有峰值重叠的基因，将峰值映射到5062个基因。为了在不同数据集之间进行比较，使用以下公式计算超几何概率http://stattrek.com/Tables/Hypergeometric.aspx网址.

补充材料

1

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2

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三

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4

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5

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7

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致谢

我们感谢J.Lieb、A.Rechtsteiner和S.Strome分享他们的ModENCODE数据预发布和有益的讨论。我们感谢K.Shen、M.W.Tan和T.Stiernagle以及隐杆线虫病遗传学中心的菌株和试剂礼品。我们感谢B.Meyer慷慨捐赠ASH-2抗体。我们感谢A.Fire、S.Kim、J.Sage、S.Iwase、J.Lipsick、L.Pollina、A.Villeneuve和布鲁内特实验室的成员对手稿的有益讨论和批判性阅读。我们感谢S.Han在蠕虫提取物中筛选了不同的H3K4me3抗体，用于检测蛋白印迹。我们感谢R.Liefke和H.Tang在微阵列分析方面的帮助。这项工作得到了NIH R01-AG31198的资助，以及格伦医学研究基金会向a.B.E.L.G.的慷慨捐赠。E.L.G得到了NSF研究生奖学金、NIH ARRA-AG31198、T32-CA009361、Helen Hay Whitney博士后奖学金和NIH R01-GM058012（给Y.S.）的支持。T.J.M.得到NIH F32-AG037254的支持。J.P.L.得到了NIH T32-MH020016的支持。

脚注

作者贡献

E.L.G.在A.B.的帮助下构思和计划了这项研究。E.L.G.在A.B.的帮助下进行了实验并撰写了论文。E.L.G.在Y.S.的实验室进行了一些实验。T.J.M.进行了免疫细胞化学实验(图6b,补充图6c、7c)，D.U.执行Pvclust和PCA微阵列分析(图6d，e,补充图10a、b). A.G.H.帮助图3b、3c,图6a,补充图6a、b、和补充图7a、b.E.M.独立重复了跨代wdr-5型RNAi寿命实验(补充表2). J.P.L.帮助图3c和补充图7a、b.B.A.B.帮助进行生物信息学分析(补充表7). 所有作者都对结果进行了讨论，并对手稿进行了评论。

作者信息

未经过滤的原始微阵列结果保存在基因表达总表（GEO）的子系列条目GSE31043下。原始未过滤的ChIP-ChIP数据存放在GEO的子系列条目GSE30789下。

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