呼吸道合胞病毒基质蛋白通过p53依赖性途径诱导肺上皮细胞周期阻滞

细胞和细胞培养试剂

从Lonza（Walkersville，MD）购买原代人支气管上皮（PHBE）细胞和无血清支气管上皮基础培养基以及生长补充剂。人肺泡上皮细胞系A549和人p53缺乏肺癌细胞系H1299购自美国型培养物收集中心（ATCC编号：CCL-185和CRL-5803），在37°C的Dulbecco改良Eagle's/Ham’s F-12培养基中，在5%CO2增湿培养箱中，以单层形式生长，培养基中含有5%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。H1299是一种人肺淋巴结衍生的非小细胞癌细胞系，其TP53基因部分缺失且不表达p53蛋白。p53表达H1299（p53^+/+)经pcDNA3.1-p53质粒转染后，从H1299中获得细胞株。G418（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）选择用于分离具有野生型p53蛋白的稳定表达细胞。Nutlin-3是一种通过p53积累而形成的细胞周期调节化合物，购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯），在captisol（密苏中州堪萨斯城CyDex）中稀释，使用浓度为10µM。

病毒和感染

如前所述，在人类上皮细胞系HEp-2中通过标准菌斑试验生长并滴定人类RSV A2亚型[28]在细胞达到70%的融合后，以指示的感染多重性（MOI）感染RSV。然后在不同时间采集细胞并用于分析。

细胞增殖测定和细胞周期分析

在细胞增殖试验中，用pSG-M和pSG-5转染A549和PHBE细胞作为载体对照。用nutlin-3处理细胞，作为p53诱导细胞周期阻滞的阳性对照。细胞被单独处理为载体对照。在处理后的指定时间点，将细胞清洗并重新悬浮在磷酸盐缓冲液（PBS）中。每天用血细胞仪测定细胞总数，用台盼蓝染色鉴定死亡细胞。采用流式细胞术进行细胞周期分析。简单地说，在收获细胞前4小时用10µM溴脱氧尿苷（BrdU）处理细胞（BD Bioscience，San Jose，CA）。然后用70%乙醇在−20°C下固定细胞30分钟，然后根据制造商的说明用异硫氰酸荧光素结合的抗BrdU抗体进行标记（加利福尼亚州圣何塞市BD Biosciences）。然后使用BrdU掺入和7-氨基-放线菌素D（7-AAD）（BD Biosciences，San Jose，CA）染色分析细胞周期特性。在Becton-Dickinson FACSort流式细胞仪上进行流式细胞术，并使用CellQuest或Modfit软件（BD Biosciences，San Jose，CA）确定细胞周期分布的量化。

蛋白质印迹和抗体

对于western blot分析，细胞用PBS洗涤两次，然后在含有2.5%β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中进行裂解。通过在95°C下加热5分钟，使总细胞蛋白质变性并还原。然后通过生物-Rad蛋白质分析测定蛋白质浓度（生物-Rad，大力士，CA）。蛋白质通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，并电转移到硝化纤维膜上。根据制造商的说明，用各自的一级抗体和辣根过氧化物酶结合二级抗体对膜进行检测。一级抗体是抗p53（DO-1）、抗磷酸-p53（丝氨酸-15）、抗p21、抗磷酸Rb（p780）和抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（抗GAPDH）（细胞信号，Danvers，MA）；反RSV（菲茨杰拉德工业公司，马萨诸塞州康科德）。单克隆抗体C781对M蛋白具有特异性[9]然后使用增强化学发光（ECL）西方印迹检测系统对免疫印迹蛋白进行可视化（GE Healthcare，Piscataway，NJ）。使用ImageJ软件对条带进行量化。

定量RT-PCR

按照制造商的说明，使用TRIzol RNA分离试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）分离总RNA。使用Superscript逆转录酶（Invitrogen，Carlsbad，CA）和寡核苷酸（A）引物将RNA逆转录成第一链cDNA。然后如前所述，通过实时PCR（RT-PCR）扩增cDNA[7]所有RT-PCR结果在分析前根据GAPDH标准化。RT-PCR中使用的引物序列如下：GAPDH（正向）5′-GGACCTGACCTGCTCTAG-3′（反向）5′-TAGCCCAGGATGGCCCTTGAG-3′; RSV-NS1（转发）5′-AGAGATGGCAGCATTCAT-3′（反向）5′-CAAAACACAATGCAATTCA-3′; RSV-NS2（正向）5′-ATCAATCACCAAC-3′（反向）5′-ATGTGCCTGTTTCATCA-3′; RSV-P（转发）5′-GGCAAGACTCAGGAATGAGG-3′（反向）5′-GTTTGGATGGATTGGTT-3′; RSV-M（正向）5′-AAAGACGATGACCCTGCATC-3′（反向）5′-TGGTAAATTTGCTGGCATT-3′; RSV-G（正向）5′-CAACCCAACATACCTCCACC-3′（反向）5′-GTGGATTGCAGGGTTGACTT-3′; RSV-N（正向）5′-AGGATTTTTATGGAATGCCTATGGT-3′（反向）5′-GCTTTGGGTTGTTCAATATGTAC-3′; RSV-L（向前）5′-cagccaaatccacaactt-3′（反向）5′-aattcctctctctctctctcacct-3′和p53（正向）5′-TCAACAGATGTTTTGCCAACTG-3′（反向）5′-ATGTGTGTGACTGTTGTAGATG-3′.

M蛋白表达诱导细胞周期阻滞

由于细胞增殖显著降低，我们接下来使用BrdU掺入和流式细胞术进行细胞周期分析。数据显示，在A549细胞中，pSG-M转染诱导了显著的G1期阻滞（G1期：51.4±2.2%vs.44.7±1.3%）(图2A） ●●●●。然而，在PHBE细胞中，观察到G1和G2/M期阻滞（G1期：67.1±0.5%vs.54.5±1.0%；G2期：15.5±1.2%vs.8.6±0.9%）(图2B). 数据表明，RSV-M本身足以诱导细胞周期阻滞。

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图2

RSV-M蛋白诱导A549和PHBE细胞的细胞周期阻滞。

用pSG-M或pSG-5（载体控制）转染细胞。转染后2天用流式细胞仪测定转染A549细胞（A组）和PHBE细胞（B组）的细胞周期相分布。使用BrdU掺入和7-AAD染色分析细胞周期特性。左侧面板是FACS数据，右侧面板是来自3个单独实验的每个周期的统计分析。误差条是平均值的标准误差（n=3）*第页-值<0.05。

M蛋白表达激活p53通路

收件人第一确定呼吸道合胞病毒感染是否诱导p53我们进行了一项动力学研究在里面受感染的A549细胞。Western blot分析显示RSV感染以时间依赖的方式诱导p53(图3A). 我们推断，这种诱导可能部分归因于RSV-M蛋白的表达。为了研究下游信号分子的p53诱导和激活是否部分是由于RSV M表达，我们进行了转染研究。

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图3

RSV感染和RSV-M蛋白表达诱导p53活化。

A组A549细胞在MOI为5 PFU/细胞时感染RSV。在指定时间制备细胞提取物，并使用抗p53 mAb（DO-1）进行western blot。用pSG-M（M）或pSG-5（V）转染A549细胞（左B组）或PHBE细胞（右B组）。在指定的时间点，制备总细胞提取物并用于western blot分析。使用特异性抗总p53（DO-1）、丝氨酸-15残基抗磷酸-p53、抗p21、780残基抗磷酸盐-Rb和抗RSV-M蛋白抗体来鉴定各自的分子。采用抗GAPDH抗体作为内部对照。C组，使用ImageJ软件对p53、phospho-p53、p21和phospho-Rb进行鉴定。误差条是平均值的标准误差（n=3）*第页-值<0.05。

A549细胞和PHBE细胞(图3，B组）转染pSG-M和pSG-5（载体控制）。在指定的时间点，制备细胞提取物，并使用p53单克隆抗体（DO-1）和磷酸化p53（丝氨酸-15）进行western blot分析。数据表明，RSV感染以时间依赖的方式增加了p53的表达和磷酸化。

接下来，我们检测了p53下游蛋白p21和磷酸化Rb。数据显示，p21在转染后24小时开始显著积累，72小时达到最大水平(图3B和C). RSV-M蛋白转染后Rb磷酸化水平降低，表明下游信号参与细胞周期阻滞。RSV-M蛋白表达水平与信号分子水平和磷酸化状态变化的最大影响一致。使用ImageJ软件对条带进行量化，数据显示RSV-M转染后与载体对照相比发生了显著的时间依赖性变化(图3C).

p53是RSV-M蛋白诱导细胞周期阻滞的必要条件

感染几种不同的病毒会导致p53激活，这对细胞周期调节至关重要。接下来我们研究了p53在RSV-M蛋白诱导的细胞周期阻滞中的作用。为此，使用p53缺陷细胞系（H1299）进行转染研究。

首先，用携带野生型（wt）p53（pCDNA3.1-p53）的质粒或仅用载体（pCDNA 3.1）转染H1299。稳定的H1299 p53^+/+用G418筛选H1299细胞株。然后通过蛋白质印迹分析评估p53的表达(图4A). 用pSG-M和空载体进行转染研究。细胞周期分析的数据表明，在H1299中，仅表达M蛋白不会导致细胞周期停滞（G1期：43.0±5.1%vs.45.9±3.5%）(图4B). 另一方面，在H1299中，p53^+/+pSG-M转染诱导G1期阻滞（G1期：53.3±10.3%vs.39.9±2.7%）(图4C). 这些结果表明，RSV-M蛋白诱导的细胞周期阻滞依赖于p53的表达。

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图4

p53是RSV-M诱导细胞周期阻滞所必需的。

面板A,对携带野生型p53 cDNA质粒转染的H1299细胞进行western blot分析。分离出稳定的转化子后，H1299细胞（B组）和H1299 p53^+/+用pSG-M（RSV-M）和pSG-5（载体）转染细胞（C组）。转染后48小时通过流式细胞术分析周期相分布。右侧面板是来自3个单独实验的每个周期的统计分析。误差条是平均值的标准误差（n=3）*第页-值<0.05。