他汀类药物对前列腺癌转移行为的影响

摘要

前列腺癌（CaP）是全世界第二常见的男性恶性肿瘤，2008年新诊断910000例(费雷等, 2010). CaP倾向于转移到骨髓基质（BMS），而CaP骨转移的发展几乎总是导致CaP相关的死亡率(乔治，1988). 转移过程是一个复杂的多步骤过程，可以通过修改在体外利用人体初级BMS的入侵室(冗长的等, 1998;斯科特等, 2001;雄鹿等, 2005). 这些在体外模型不仅可以确定CaP转移到BMS的机制，还可以阐明治疗药物如何干预转移过程。

最近的证据表明脂质代谢和他汀类药物的使用与钙磷的行为有关。大规模流行病学数据显示，服用他汀类药物的患者CaP进展率较低(普拉茨等, 2006)报告显示，筛选出的CaP发病率(穆托拉等, 2010)和非筛选(布鲁等, 2010)服用这些药物的男性人数减少，胆固醇水平较低的人患高风险疾病的几率较低(普拉茨等, 2008). 前列腺切除术后大病例组织学分析的进一步临床数据显示，服用他汀类药物的男性攻击性较小(勒布等, 2010)在接受放射治疗的患者中，服用他汀类药物的男性，尤其是那些具有高风险特征的患者，其CaP治疗失败指数降低(格特等, 2010).

这些观察的基础尚不清楚，但其影响可能与3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA（HMG-CoA）抑制剂对细胞行为、细胞间相互作用和与脂质代谢相关的细胞运动的多效性作用有关(Stancu和Sima，2001年). 为了更好地理解这一过程，我们在我们内部分类良好的CaP行为模型中研究了不同他汀类药物的作用，评估了特定他汀类化合物对人类BMS中细胞结合、迁移和早期细胞存活的差异影响。

材料和方法

结果

亲脂性他汀类药物减少BMS侵袭

我们之前已经证明BMS是转移性PECs最有效的化学引诱剂，并且可以使用原代人类BMS共培养物来模拟转移过程(雄鹿等, 2005;棕色等, 2006). 因此，我们提出了三个不同的问题：他汀类药物是否影响BMS微环境(图1A)，PEC直接(图1B)或BMS和PEC之间的相互作用(图1C). 他汀类药物不影响BMS诱导PEC侵袭的能力；尽管阿托伐他汀和辛伐他汀治疗BMS与对照组相比减少了侵袭（84±8.8%P（P）=0.18806和80±10.57%P（P）=0.14755），未达到显著水平(图1A). 除普伐他汀外，所有他汀类药物都能诱导PEC对BMS侵袭的相似且显著减少(P（P）>0.05），平均为对照组的66.68%（范围54–77%P（P）<0.05). 骨髓基质预处理(图1C)单独治疗PEC没有额外的益处（58.86%P（P）>与对照组相比，PC-3的侵入量为0.05），表明对PC-3细胞有直接影响，而对BMS的“土壤”没有直接影响。

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图1

他汀类药物直接影响CaP侵袭BMS的能力(一个)用他汀类药物（瑞舒伐他汀（ROS）、美伐他汀（MEV）、阿托伐他汀、辛伐他汀或普伐他汀）处理骨髓基质7天，然后在不含他汀类药的情况下进行Boyden小室试验，将其用作侵袭刺激物。(B类)PC-3用他汀类药物治疗30分钟，然后添加到博伊登室侵袭试验的顶部。(C类)PC-3细胞在侵袭试验前预处理30分钟，之前用他汀类药物处理BMS 7天。入侵归一化为TCP和BMS（PRAV）或DMSO车辆控制（阿托伐他汀、MEV、ROS、SIM）；n个=3(D类)用1处理PC-3μℳSIM卡或5μℳROS添加到Boyden室侵入试验顶部前30分钟，该试验在Matrigel层顶部含有汇合的BMEC层。*表示P（P）<0.05来自车辆控制。**表示P（P）>他汀类之间0.05。

他汀类药物的作用在BMEC/Matrigel屏障汇合时更为显著，该屏障模拟了血液BMS屏障。两者均为5μℳ瑞舒伐他汀和1μ辛伐他汀(图1D)完全抑制了对BMS的直接入侵（9.37%与100%,P（P）=0.0201和25.6%与100%,P（P）瑞舒伐他汀和辛伐他汀=0.0496与BMS+车辆控制），带5个μℳ瑞舒伐他汀将入侵降低到与TCP相似的水平(P（P）=0.21212）。根据制造商的说明激活辛伐他汀对辛伐他丁抑制BMS内皮细胞侵袭的能力没有影响（分别为13.5%±7.1%和14.8%±12.8%；P（P）=0.142) (补充图1).

他汀类药物对PEC与BMS结合的影响

当恶性PEC进入BMS时，它们在增殖和形成活菌落之前向BMS内的小生境迁移并结合(棕色等, 2010). 我们试图评估他汀类药物对这一过程的抑制作用。用他汀类药物孵育PEC达120分钟并不会改变PEC与BMS结合的能力(图2).

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图2

他汀类药物不抑制PEC与人BMS的结合。PC3-GFP细胞与1μℳ阿托伐他汀，SIM，MEV，5μℳROS或10μℳPRAV用于(一个) 30, (B类)60或(C类)与BMS融合培养物结合前120分钟。60分钟后，清洗未结合细胞，并使用FLUOstar OPTIMA光谱仪测定平均微孔荧光。数据表示为最大孔荧光预清洗的百分比；n个=3.

亲脂性他汀类药物减少BMS中PEC集落形成

以前的研究已经证明高剂量他汀类药物治疗PEC的抗增殖作用。然而，在BMS的高脂环境中，他汀类药物对PEC的抗增殖作用尚不清楚。因此，我们比较了他汀类药物在分离、克隆形成测定或BMS共培养中对PEC集落形成和增殖的影响。

普伐他汀，剂量高达100μ在克隆形成或BMS共培养分析中，对PC-3集落形成或细胞增殖没有影响(图3A). 然而，脂溶性他汀类和瑞舒伐他汀类药物在检测和细胞增殖中均对集落形成有显著影响。在克隆形成试验和BMS共培养中，亲脂性他汀类药物和瑞舒伐他汀显著降低了克隆数量，达到了相似的程度(表1)辛伐他汀最有效（分别减少75.44%和49.44%）。骨髓基质细胞集落小于对照组（0.19±0.025 mm²，0.21±0.03毫米²，0.21±0.03毫米²，0.19±0.03毫米²;P（P）<0.05）导致PEC总面积减少（12.8±3.34 mm²，20.7±4.5毫米²，18.68±4.1毫米²，14±3.8毫米²)在分别用瑞舒伐他汀、阿托伐他汀，美伐他汀和辛伐他汀处理的共培养中(图3B). 没有区别(P（P）>0.05）。

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图3

他汀类药物抑制单核细胞和BMS共培养中的集落形成，并抑制BMS共培养中的扩散。(艾岛)他汀类药物对PC-3细胞的毒性通过14天的克隆形成试验测定，并在第7天刷新。计数>32个细胞的菌落。(艾伊)在加入500个PC-3细胞之前，用他汀类药物预处理汇合BMS 60分钟。在固定共培养物和用泛细胞角蛋白DAB染色的PEC之前，每天更新他汀类药物8天。柱状图显示形成的前列腺集落数量(Bi公司)直方图显示BMS共培养和(Bii公司)柱状图显示在含有他汀类药物的BMS共培养中形成的总前列腺集落面积；*表示P（P）<0.05来自车辆控制。(Ci公司)在含有他汀类药物的BMS共培养中形成的典型前列腺集落的显微照片。(Cii公司)单用培养基DMSO、ROS、ATOR、MEV、SIM、PRAV在骨髓基质共培养中形成的单个集落的高倍显微照片；n个=3.

表1

BMS共培养中染色对前列腺上皮细胞集落形成的影响

	平均菌落数	s.e.公司。	折叠减少	P（P） -价值
无药物管制	118	12.84
DMSO低浓度控制	150.7	19.97
DMSO高控制	125	13.54
罗苏伐他汀	61.2	13.76	2.04	0.0095
阿托伐他汀	94.6	13.91	1.59	0.055
美伐他汀	85.8	13.56	1.76	0.0315
辛伐他汀	63.2	4.72	2.38	0.0117
普伐他汀	125.8	27.79	0.94	0.7928

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缩写：BMS=骨髓基质；DMSO=二甲基亚砜；BMS共培养试验中他汀类药物处理后PC-3集落形成。PC-3细胞用1μℳ阿托伐他汀、美伐他汀、辛伐他汀，5μℳ瑞舒伐他汀或10μ普伐他汀在BMS共培养中每天服用8天。菌落计数>32个细胞。表1显示了菌落的平均数量、与相关载体对照组相比菌落数量的折叠减少以及治疗组与各自载体对照组之间的显著差异。

通常情况下，BMS共培养中的PC-3菌落在BMS中形成了迁移PEC的大型弥漫菌落。细胞表现为间充质形态，呈泪滴状，在缺乏治疗剂或DMSO载体控制的情况下，跛足前缘呈皱褶状(图3C，控制）。脂溶性他汀类药物引起BMS菌落的显著形态学变化。前列腺上皮细胞集落紧密堆积，所含细胞少于对照组。在高倍镜下，与对照组共培养的间充质形态相比，它们显示出不同的形态，PEC更圆，细胞前缘没有明显的跛足。虽然一些细胞保留了泪滴的外观，但前缘没有跛足，尾部扭曲，显得更长、更宽和弯曲(图3C). 普伐他汀没有出现这些形态学效应。

他汀类药物抑制侵袭的机制

他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶阻止HMG-CoA-转化为甲羟戊酸(图4A). 因此，我们通过提供下游代谢产物甲羟戊酸、胆固醇或戊二醛化剂GGPP和FPP来恢复入侵。用GGPP或甲羟戊酸钠处理PC-3-GFP细胞对其侵袭BMS的能力没有显著影响(P（P）分别为0.259和0.619）。胆固醇和FPP都降低了PC3-GFP对BMS的侵袭，但这种降低并不显著（75.51%±2.25%P（P）=0.158和54.9%±8.24%P（P）分别为0.056）。在用1μ辛伐他汀或5μℳ瑞舒伐他汀和通过BMEC/Matrigel屏障对未治疗BMS的侵袭性进行评估。在侵袭试验中添加甲羟戊酸完全恢复/增强了对BMS的侵袭（66.67%±13.26%P（P）=0.1126和117.42%±17.79%P（P）瑞舒伐他汀和辛伐他汀分别为0.0033）。然而，在下游代谢物的添加中，只有GGPP能够完全恢复瑞舒伐他汀治疗对BMS的侵袭（82.42±5.52%P（P）=0.229). 与无他汀类药物对照组相比，在辛伐他汀处理的细胞中添加GGPP导致侵袭增强（122±7.83%P（P）=0.0185). 添加FPP或胆固醇都不会影响瑞舒伐他汀或辛伐他汀抑制BMS侵袭的能力。辛伐他丁的激活对恢复曲线没有影响，GGPP（111.5±8.59%）P（P）=0.9079）和甲羟戊酸（67.04±8.03%P（P）=0.0547）恢复PC3-GFP细胞对BMS的侵袭能力(P（P）=0.1391和P（P）分别在GGPP或甲羟戊酸钠存在下，辛伐他汀活化与未活化的比较=0.2267）(补充图2).

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图4

香叶基香叶基焦磷酸盐恢复他汀抑制的BMS侵袭(一个)甲羟戊酸途径的图示，强调他汀类药物和双膦酸盐的代谢阻断。(B类)在利用BMEC屏障层的BMS共培养分析中，描述在他汀类药物块下游添加甲羟戊酸途径代谢物（甲羟戊酸钠、FPP、GGPP或胆固醇）的效果的直方图。(Bi公司)5存在下的侵入恢复试验μℳ罗斯。(Bii公司)1存在下的侵入恢复试验μℳSIM卡。

讨论

这是首次报道不同他汀类药物对CaP细胞向人体BMS迁移和在人体BMS内迁移的比较效应。结果表明，CaP向BMS迁移并通过BMS，以及对恶性PEC在该位置克隆生长的能力有明显影响。然而，这种作用仅限于亲脂性他汀类药物，而亲水性他汀普伐他汀类则没有这种作用。这类药物的两种基本亚型的差异效应已经得到了很好的描述；脂溶性他汀类药物在细胞膜上扩散，并在肝脏和其他组织中发挥代谢作用；亲水性他汀类药物需要通过细胞膜进行主动转运，以便在细胞内发挥作用。因此，亲水性药物的这种作用主要是肝脏的，而不是外周的(Stancu和Sima，2001年;加伍德，2010年)这一事实对乳腺癌和其他癌症等肿瘤的疗效有重大影响(坎贝尔等, 2006;科塔姆拉朱等, 2007;科尤特克等, 2007). 在本文的结果中，这种差异作用是显而易见的，在解释他汀类药物作用的人群研究数据或计划在CaP中进行基于他汀类的预防试验时，这可能是一个重要的考虑因素。

流行病学研究表明，尽管他汀类药物的使用不会影响钙磷蛋白的发病率，但它确实降低了临床进展的风险和钙磷蛋白相关的死亡率；其机制尚不清楚。他汀类药物可诱导多种恶性上皮细胞凋亡在体外但是10-20的浓度μℳ使用远远超过了人类生理上可以实现的。我们利用具有降低PEC毒性的他汀类药物浓度，评估其在侵袭和早期转移中的潜在作用。我们使用的他汀类药物浓度高于当前他汀类给药方案检测到的血清水平，例如，每天服用40 mg的患者辛伐他汀的峰值血浆浓度为7.2 nℳ（3 ng ml）⁻¹) (纳吉布等, 2003). 然而，在淋巴瘤或骨髓瘤患者的试验中(范德斯佩克等, 2006)辛伐他汀的最大耐受剂量为每天15mg/kg，这将显著增加到达外周器官的循环血清水平。固体肿瘤患者每天45毫克/千克洛伐他汀治疗方案诱导的血清峰值3.9μℳ (蒂伯特等, 1996).

使用经验证的人类BMS共同培养模型(雄鹿等, 2005)，我们已经证明，亲脂性他汀类药物都会影响PEC侵袭BMS的能力(图1和​和3）三)启动和发展肿瘤集落。BMS预处理(图1A)对他汀类药物促进或抑制这一过程的能力没有影响。图1B（仅PC-3治疗）和图1C（BMS和PC-3的预处理）显示出相似的侵袭减少。利用更复杂的转移模型，使用BMEC和基底膜，重现了血BMS屏障，瑞舒伐他汀和辛伐他汀都完全抑制了对BMS的定向侵袭。这些数据表明，他汀类药物直接影响PEC，但对其微环境没有影响。他汀类药物阻断CaP迁移的确切机制尚不清楚，但有几个可能的病因。

最近一项针对35岁以上无癌男性的大型队列研究表明，胆固醇水平理想/临界的男性（<200 mg dl）⁻¹–<240毫克分升⁻¹)发生高等级CaP的风险较低，但其CaP总发病率没有降低(蒙杜尔等, 2010). 这支持了其他研究，即低胆固醇与器官受限或低等级CaP无关，但与高等级癌症风险降低相关(普拉茨等, 2008). 进一步的流行病学研究也表明，低胆固醇与晚期疾病呈负相关（OR=0.42，95%CI=0.13–1.36）。这项研究中的数字很小，但资深作者(普拉茨等, 2008)和其他(所罗门和弗里曼，2008年)他们继续提出他汀类药物影响钙磷的细胞内胆固醇代谢，而钙磷的代谢被认为是失调的。肝脏对他汀类药物的摄取和对肝脏特异性酯酶的需求，例如，在前药辛伐他汀的情况下，限制了他汀类物质在外周循环中的可用性(默克公司，2005年). 因此，假设他汀类药物通过阻断肝脏中的HMG-CoA还原酶而不是肿瘤中的HMG CoA还素酶发挥作用，并且胆固醇的降低影响肝外部位的肿瘤。在这里，我们已经表明辛伐他汀可以在没有激活的情况下直接作用于PC3-GFP细胞(补充图1)提示辛伐他汀可能在外周发挥作用。胆固醇是脂筏的基本成分，脂筏是细胞膜微域，调节来自膜结合受体（如酪氨酸激酶）的信号级联。用辛伐他汀隔夜治疗CaP或胶质瘤细胞48小时后，脂筏胆固醇降低70%，而添加外源性胆固醇可逆转这种效果(庄等, 2005;吴等, 2009). 这种减少抑制了Akt1丝氨酸-三氢嘌呤激酶/蛋白激酶-B信号通路并诱导细胞凋亡，这种作用可以通过补充胆固醇来逆转。验证体内研究表明，胆固醇水平升高增加了pAkt1信号传导，促进了肿瘤生长，同时也减少了细胞凋亡。

上述研究证明了胆固醇通过促进肿瘤生长和防止细胞凋亡在CaP进展中的作用。然而，在本研究中，我们专门模拟了他汀类药物对CaP细胞向人类BMS的侵袭和迁移能力的影响。在这些经验证的侵袭共培养模型中，胆固醇在他汀类治疗后无法恢复侵袭表型。我们之前已经证明，入侵BMS主要发生在最初的4小时内(雄鹿等, 2006). 在本研究中，PC-3细胞在检测前预处理30分钟，表明CaP细胞胆固醇合成的减少不是抑制侵袭的因素。这一观察得到了共培养分析数据的支持；共培养物在FCS和马血清中生长，两者都含有胆固醇。值得注意的是，入侵是针对造血活性脂肪细胞丰富的人类BMS，其中含有高胆固醇水平。用亲脂性他汀类药物处理的所有共培养物均显示PC-3细胞增殖，但形成较小的紧密堆积的上皮细胞集落，其形态与对照组不同，失去了跛足的皱褶前缘，后缘扭曲，表明运动障碍。综上所述，这些模型表明，对BMS侵袭的抑制，而不是对BMS增殖的抑制，与循环和局部组织胆固醇水平没有直接关系。

一个关键因素可能是他汀类药物的作用，特别是它们对甲羟戊酸和类异戊二烯轴的作用，损害了癌细胞的迁移机制。肿瘤细胞接触他汀类药物通过HMG-CoA还原酶抑制下调甲羟戊酸的表达。这会影响膜的完整性、细胞信号传导、蛋白质合成和细胞周期进展。他汀类药物对这些过程的干扰可能会抑制肿瘤的发生、生长和转移(布德劳等, 2007). 甲羟戊酸是类异戊二烯FPP和GGPP的前体，对信号蛋白（如G蛋白Ras和Rho）向质膜的移位至关重要，在质膜上，它们通过控制细胞分化、增殖和迁移介导信号转导(海格等, 2006). 与胆固醇或FPP不同，GGPP的加入完全恢复了PC-3细胞侵袭BMS的能力，这表明亲脂性他汀类药物通过阻止需要香叶基香叶酰化的新生信号蛋白移位到细胞表面来发挥作用。这将导致细胞表面信号蛋白的减少，从而阻止细胞检测到BMS或BMS脂肪细胞的侵入性刺激(棕色等, 2010).

进一步的研究支持甲羟戊酸/G-蛋白轴很重要的观点。赵等(2010)证明了10μℳ洛伐他汀通过AKT及其下游靶点4E-结合蛋白1和S6激酶1以GGPP依赖的方式抑制EGFR二聚体和信号传导。洛伐他汀还诱导了与缺乏GGPP标签的RhoA表达增加相关的细胞骨架紊乱。与甲羟戊酸或GGPP共培养可恢复RhoA活性和EGF信号。这表明，对BMS侵袭和通过BMS侵袭的抑制更可能是由类异戊二烯损失引起的，而不是CaP细胞内源性胆固醇生成的损失。后一个因素可能至关重要；癌细胞的移动能力是转移的基础，其抑制抑制了BMS中转移性CaP的存活(冗长的等, 1998).体外研究表明Rho/Rac轴在间充质细胞向变形虫转化和侵袭/迁移中的关键重要性(桑兹·莫雷诺等, 2008); 这些步骤对前列腺癌和其他癌症的进展至关重要。因此，脂溶性他汀类药物可能抑制转移行为的重要成分，这些抗迁移作用可能是本文和临床报道的钙磷相关观察的原因(普拉茨等, 2006;排水沟等, 2010).

在这里，我们使用经验证的前列腺癌上皮侵袭模型来检测他汀类药物对CaP转移中迁移途径的影响。我们首次在实验室环境中表明，他汀类药物直接作用于恶性PEC，并阻止HMG-CoA形成GGPP。GGPP的丢失导致恶性PEC侵袭BMS和通过BMS的能力显著降低，从而降低其在BMS内形成集落的能力。这种他汀类药物的作用并不普遍，因为在我们的模型中，亲水性他汀普伐他汀对PC-3细胞系没有影响。总之，他汀类药物似乎作用于CaP转移的两个关键成分；减少肿瘤生长，可能通过降低胆固醇，但也如本文所述，通过抑制内皮细胞迁移和BMS侵袭所需的香叶基香叶基-戊基化途径。

脚注

参考文献