肿瘤细胞的重要代谢特征之一是丙酮酸激酶同工酶M2（M2-PK或PKM2）的表达。丙酮酸激酶催化糖酵解的最后一个反应，将磷酸烯醇丙酮酸（PEP）转化为丙酮酸并生成ATP。有四种丙酮酸激酶同工酶：PKL（L-PK，肝亚型）(1)，PKR（R-PK，红细胞亚型）(2,三)、PKM1（M1-PK，肌肉同种型）和PKM2（胚胎和肿瘤同种型）(4). PKM1和PKM2由相同但不同的剪接基因编码(5). 与PKM1相比，PKM1主要在脑和肌肉等正常组织中表达(6,7)PKM2在增殖组织（即胚胎细胞、成体干细胞和迄今为止报道的所有肿瘤细胞）中表达，表明其具有高氧化磷酸化水平(8–11). 由于这种差异，人们认为PKM2可以作为临床癌症标记物(12). 已有研究表明，致癌转录因子c-Myc上调核RNA结合蛋白PTB、hnRNAP1和hnRNAP2，以促进PKM mRNA前体选择性剪接到PKM2 mRNA(13,14). PKM2也由低氧诱导因子1诱导(15).
PKM1仅以四聚体形式存在，与PEP的高亲和力不同，PKM2形成两种四聚体（高亲和力，低亲和力K（K）米PEP）和二聚体（低亲和力，高亲和力K（K）米对于政治公众人物）(16). PKM2需要1,6-二磷酸果糖（FBP）形成活性四聚体，但PKM1不需要(17,18). 最近的研究结果表明，PKM2可以在Y105被癌细胞中的酪氨酸激酶磷酸化(19,20). 磷酸化引起的PKM2构象变化导致FBP释放并将酶从四聚体转化为活性较低的二聚体形式(21,22)然而PKM2主要是非转化细胞中的四聚体(9,23). 这个有趣的现象提出了一个问题，即降低PKM活性对肿瘤细胞有什么好处。一种假设是PKM2活性降低会促进上游糖酵解中间产物的积累，这些中间产物是增殖所需核苷酸、氨基酸和脂质生物合成的前体(21).
除FBP外，非必需氨基酸丝氨酸是PKM2唯一已知的激活剂(24). 丝氨酸用于增殖细胞的蛋白质合成以及其他氨基酸的合成，如甘氨酸和半胱氨酸。此外，丝氨酸衍生甘氨酸用于核苷酸合成。丝氨酸也是合成脂质的前体，如磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂(25). 因此，丝氨酸对于合成细胞增殖所需的核苷酸、蛋白质和脂质非常重要。本文的研究是为了确定PKM2是否有助于癌细胞从糖酵解中间体进行从头生成丝氨酸的能力。丝氨酸合成始于糖酵解中间体3-磷酸甘油酯（3-PG）。我们假设PKM2表达细胞中丙酮酸激酶活性的降低会导致3-PG的积累，然后3-PG可以转化为丝氨酸。随着丝氨酸水平的增加，丝氨酸依赖的PKM2激活可以提供一个反馈回路，恢复生长细胞中的糖酵解通量。在这里，我们证明PKM2的表达有助于内源性丝氨酸合成，并在缺乏外源丝氨酸的情况下维持哺乳动物雷帕霉素复合物1（mTORC1）的活性。为了支持这些作用，我们发现丝氨酸合成途径中的所有三种酶都在非必需氨基酸饥饿时上调，这是由于激活了一般控制的非去抑制2激酶激活转录因子4（GCN2-ATF4）途径。
结果
丝氨酸增加PKM2活性和糖酵解速率。
虽然丝氨酸以前被证明是体外纯化PKM2的激活剂(24)PKM2的另一变构激活物FBP如何影响丝氨酸活化，以及丝氨酸水平的改变是否影响细胞内的糖酵解速率，目前尚不清楚。为了检测丝氨酸对与FBP相关的PKM2酶活性的影响，我们使用重组人PKM2蛋白进行了体外丙酮酸激酶活性测定，该蛋白在无FBP或有FBP的情况下与丝氨酸浓度增加的蛋白孵育。在不存在FBP的情况下，丝氨酸以剂量依赖的方式导致PKM2活性增加10-40%，而在存在10μM FBP的情况下，随着丝氨酸的增加，仅观察到PKM2活性的轻微增加(). 这些数据表明，尽管FBP是PKM2的主要激活剂，但当FBP浓度较低时，丝氨酸可能变得重要。为了研究丝氨酸对细胞糖酵解的调节作用，我们用不同浓度的丝氨酸培养H1299细胞（人肺癌细胞系）16小时，然后测量细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成。16小时以上丝氨酸水平的变化对细胞增殖没有显著影响(). 有趣的是，当丝氨酸浓度降至50μM以下时，H1299细胞的乳酸生成开始减少。然而，直到丝氨酸浓度降低到12.5μM以下，葡萄糖消耗才减少(). 因此，当丝氨酸水平从50μM降低到12.5μM时，乳酸生成/葡萄糖消耗的比率从1.69下降到1.13(). 这一比例的降低表明，这些肿瘤细胞能够根据丝氨酸浓度将糖酵解流量调节为乳酸，从而在丝氨酸水平较低时为其他需求节省糖酵解中间体。总之，这些数据表明丝氨酸是这些肿瘤细胞糖酵解的关键调节剂。
丝氨酸增加PKM2活性和糖酵解速率。(A类)丝氨酸存在时，体外PKM2活性增加。使用一系列丝氨酸浓度进行分析，如有和无10μM FBP所示（数据代表平均值±SEM，n个= 3). (B类)等量的H1299细胞与不同浓度的丝氨酸孵育16 h，对细胞进行胰蛋白酶化，用台盼蓝染色，并计数（数据表示平均值±SEM，n个= 3). (C类)年的葡萄糖消耗和乳酸生成B类按照中所述进行测量材料和方法并归一化为细胞数（数据表示平均值±SEM，n个= 3). (D类)乳酸产生/葡萄糖消耗比率随丝氨酸浓度增加而增加（数据表示平均值±SEM，n个= 3).
PKM2承认在丝氨酸饥饿状态下对防扩散的抵抗。
为了区分PKM2和PKM1在肿瘤细胞代谢中的作用，我们使用与前面描述的相似的策略开发了表达PKM1或PKM2的匹配肿瘤细胞(11). 首先，我们生成了稳定的H1299细胞系，表达Flag/HA-taged小鼠PKM1（Flag/HA-mPKM1）或PKM2（Flage/HA-mPKM2）。然后使用靶向人类PKM而非小鼠PKM的siRNA来敲低内源性PKM表达，包括M1和M2亚型，因为它们共享相同的mRNA前体。因此，这些细胞主要以可比水平表达mPKM1或mPKM2（以下称为M1或M2细胞）().
表达PKM2的细胞比表达PKM1的细胞更能抵抗丝氨酸饥饿。(A类)为了产生表达PKM1或PKM2的细胞系，H1299细胞表达Flag-tagged(左侧)或HA-tagged(赖特)用20nM非靶向siRNA（NT）或PKM siRNA瞬时转染小鼠PKM1或PKM2，48h后用免疫印迹法检测PKM1/2的表达。(B类)[U的级别-13C] 政治公众人物[U-13C] 3-PG和[U-13C] 使用LC-MS测定Flag-M1/M2细胞中的丝氨酸。Flag-M1/1M2细胞在无丝氨酸培养基中培养24小时，然后用[U标记-13C类6]葡萄糖3小时。这个过程导致PEP和3-PG基本上完全标记；因此，这些代谢物的数据反映了细胞总浓度。对于丝氨酸，标记不完整，增强标记反映了通量增加（数据表示平均值±SEM，n个= 3). *P（P）<0.05，双尾学生吨测试。(C类)PKM2赋予丝氨酸饥饿抵抗力。标志M1/M2(左侧)或HA-M1/M2(赖特)细胞在有丝氨酸或无丝氨酸的情况下孵育24或48小时，并使用MTT法测量细胞增殖。计算并绘制（−）丝氨酸和（+）丝氨酸培养基之间的增殖比率（数据表示平均值±SEM，n个= 3).
随后将M1和M2细胞的细胞裂解液用于PKM活性测定，如前所述，M2细胞与M1细胞相比丙酮酸激酶活性显著降低(图S1) (26). 为了测试M2细胞中丙酮酸激酶活性的降低是否促进与糖酵解途径相关的代谢物的积累并将糖酵解中间体转移到丝氨酸合成中，将Flag-M1/M2细胞在无丝氨酸培养基中饥饿24小时，然后用[U-13C类6]随后使用液相色谱-质谱（LC-MS）测定细胞代谢物。与我们的假设一致，我们发现13与M1细胞相比，M2细胞中C-标记的PEP（丙酮酸激酶底物）、3-PG（丝氨酸合成前体）和丝氨酸(). 这些数据表明，PKM2确实有助于下游糖酵解中间产物的积累，并将糖酵化转变为丝氨酸合成。
有报道称，M1和M2细胞在常规体外培养条件下具有相同的增殖率，但体内M2细胞形成的异种移植瘤比M1细胞大得多(11). 与之前的发现类似，我们没有观察到M1和M2细胞在完全培养基中的细胞增殖有显著差异(图S2). 基于可能有助于从头合成的糖酵解中间产物的积累，我们接下来测试了M2细胞在丝氨酸饥饿时是否表现出增殖优势。事实上，M1细胞在丝氨酸退出后的增殖下降幅度大于M2细胞，这表明M2细胞对外源丝氨酸的依赖性较小().
PKM2有助于在丝氨酸耗尽时保持mTORC1活性。
缺乏丝氨酸时M1细胞的生长受损表明，细胞生长信号受丝氨酸可用性的调节。mTOR是营养物质有效性的关键分子传感器，也是细胞生长和增殖的调节因子。mTORC1的激活需要谷氨酰胺和亮氨酸等必需氨基酸(27,28)但丝氨酸等其他非必需氨基酸是否参与mTORC1激活尚不清楚。为了测试M1细胞中的低丝氨酸水平是否会导致mTORC1失活和增殖减少，对M1和M2细胞进行有丝氨酸和无丝氨酸培养，并对mTORCl下游效应物进行免疫印迹，即磷酸-S6激酶和磷酸-S6。在缺乏外源丝氨酸的情况下，M1细胞而非M2细胞的mTORC1活性降低(). 为了排除PKM2可能直接影响mTORC1活性的可能性，我们在缺乏必需氨基酸亮氨酸的培养基中培养M1和M2细胞，这是激活mTORC2所必需的。正如预期的那样，亮氨酸缺失消除了M1和M2细胞中的mTORC1活性()表明PKM2不太可能直接调节mTORC1活性。综上所述，这些数据表明，PKM2表达细胞能够维持丝氨酸合成，直接或间接促进丝氨酸剥夺后mTORC1激活。
PKM2在丝氨酸缺失时维持mTORC1活性。(A类)丝氨酸剥夺后，M2细胞而非M1细胞保持mTORC1活性。标志M1/M2(左侧)或HA-M1/M2(赖特)细胞与丝氨酸孵育16小时，通过免疫印迹法测定p-S6K和p-S6的mTOR活性。数据是三个独立实验的代表。(B类)亮氨酸戒断降低M1和M2细胞中的mTORC1活性。标记M1/M2细胞与亮氨酸孵育16小时。
脱丝氨酸条件下M2细胞的增殖优势取决于丝氨酸合成途径。
如果丝氨酸缺乏导致M2细胞的增殖优势是丝氨酸合成增强的结果，那么我们应该能够通过阻断丝氨酸合成途径来消除这种优势。有三种酶，3-磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）、磷酸丝氨酸氨基转移酶1（PSAT1）和磷酸丝氨酸磷酸酶（PSPH），它们是糖酵解中间体3-PG三步转化为丝氨酸所必需的。这三种酶以前都被发现在肿瘤组织中过度表达或活性增加(29–34)提示丝氨酸合成途径可能在肿瘤发生中起重要作用。为了验证这个想法，我们通过RNAi抑制PSAT1来阻断这条通路。PSAT1敲除后，DLD1（人结肠癌细胞系）和H1299细胞的细胞增殖在丝氨酸剥夺下显著降低(). 此外，与对照siRNA相比，靶向PSAT1的siRNA在丝氨酸退出时对mTORC1活性的抑制作用更强(). 此外，在丝氨酸饥饿的情况下，敲低PSAT1会显著降低M2细胞的增殖，但不会进一步降低M1细胞的增生(). 这些数据提供了额外的证据，证明M2细胞在丝氨酸饥饿下的增殖优势取决于内源性丝氨酸合成的增加。
通过敲低PSAT1阻断内源性丝氨酸合成途径。(A类)敲除肿瘤细胞中的PSAT1。用50 nM非靶向siRNA或PSAT1 siRNA转染DLD1和H1299细胞。48 h后，用免疫印迹法检测PSAT1的表达。(B类)敲低PSAT1可降低丝氨酸饥饿状态下的肿瘤细胞增殖。如前所述，用PSAT1 siRNA转染细胞。48小时后，将转染细胞在含有或不含丝氨酸的培养基中培养24或48小时。使用MTT法测量细胞增殖。计算并绘制（−）丝氨酸和（+）丝氨酸培养基之间的增殖比率（数据表示平均值±SEM，n个= 3). (C类)敲低PSAT1可在丝氨酸缺失时抑制S6磷酸化。如前所述，用PSAT1 siRNA转染H1299细胞。48小时后，将转染的细胞与丝氨酸一起/不与丝氨酸一起孵育16小时(D类)敲低PSAT1显著降低M2细胞的增殖，但不影响M1细胞的生长。如前所述，用PSAT1 siRNA转染HA-M1/M2 H1299细胞。48小时后，将转染细胞与丝氨酸孵育24或48小时，并使用MTT法测量细胞增殖。计算并绘制（−）丝氨酸和（+）丝氨酸培养基之间的增殖比率（数据表示平均值±SEM，n个= 3).
GCN2-ATF4通路上调丝氨酸合成酶对氨基酸剥夺的响应。
在丝氨酸缺失培养基中增殖不仅需要PSAT1活性，而且我们观察到PSAT1表达在丝氨酸饥饿时增加(). 据报道，PHGDH、PSAT1和PSPH是ATF4的转录靶点(35,36). ATF4通过GCN2依赖性eIF2α磷酸化在氨基酸缺失时翻译上调(37)，许多ATF4转录靶点参与非必需氨基酸的合成和转运(38). 为了测试丝氨酸合成途径中的这些酶是否在氨基酸剥夺后以依赖ATF4的方式被诱导，我们将表达非靶向shRNA（shNT）或靶向ATF4（shATF4）的shRNA的DLD1细胞在无丝氨酸或无谷氨酰胺培养基中培养6小时。在与ATF4诱导相关的对照细胞中，丝氨酸或谷氨酰胺饥饿状态下，丝氨酸合成途径中所有三种酶的mRNA水平均上调，但在ATF4缺乏的细胞中，三种酶基础mRNA水平较低，在氨基酸饥饿状态下未观察到诱导()表明ATF4上调了所有三种酶的表达，以补偿氨基酸饥饿。谷氨酰胺饥饿时更强的mRNA诱导可能是因为培养的癌细胞适应高浓度的谷氨酰胺。谷氨酰胺戒断还诱导丝氨酸合成途径中的酶，这一事实表明，这种诱导是一般氨基酸反应的结果，而不是丝氨酸戒断所特有的。我们还确认诱导依赖于GCN2，因为GCN2−/−在丝氨酸或谷氨酰胺饥饿状态下，小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）无法上调酶的表达().
氨基酸饥饿下丝氨酸合成途径中酶的诱导依赖于GCN2-ATF4途径。(A类)表达非靶向shRNA或ATF4 shRNA的DLD1细胞在没有丝氨酸或谷氨酰胺的培养基中饥饿6小时，并使用实时PCR测量mRNA水平（数据表示平均值±SD，n个= 3). *P（P）PHGDH公司= 0.0011,P（P）PSAT1型= 0.0106,P（P）PSPH公司= 0.0038. (B类)野生型，GCN2−/−和ATF4−/−MEF在无丝氨酸或谷氨酰胺的培养基中饥饿6 h，并使用实时PCR测定mRNA水平（数据表示平均值±SD，n个= 3). *P（P）PHGDH公司= 0.0124,P（P）PSAT1型= 0.0001,P（P）PSPH公司= 0.0004. (C类)ATF4是丝氨酸饥饿下细胞增殖所必需的。(上部)将表达ATF4 shRNA（shATF4）或非靶向shRNA（shNT）的DLD1细胞在含有或不含有丝氨酸的培养基中孵育24、48和72小时。使用MTT法测量细胞增殖。计算并绘制（−）丝氨酸和（+）丝氨酸培养基之间的增殖比率（数据表示平均值±SEM，n个= 3). (下部)用免疫印迹法检测脱丝氨酸24h后ATF4和PSAT1蛋白水平。(D类)将Flag-M1/M2细胞与丝氨酸孵育24小时。用免疫印迹法测定ATF4和PSAT1的表达。数据是三个独立实验的代表。
上述数据表明，GCN2-ATF4途径与糖酵解代谢中PKM2依赖性改变协作，以协调丝氨酸合成。为了证实这一理论，我们测试了ATF4是否像PKM2一样在缺乏丝氨酸的情况下对细胞增殖至关重要。与shATF4细胞的PSAT1表达显著低于对照细胞的观察结果一致，shATF5细胞的增殖在丝氨酸饥饿时受到抑制，但对照细胞的增殖没有受到抑制(). 然而，ATF4单独诱导丝氨酸合成酶不足以促进丝氨酸依赖性增殖，因为缺乏外源丝氨酸时M1细胞的增殖受损与ATF4水平显著升高和丝氨酸合成酶类的高表达有关，但在丝氨酸缺失的M2细胞中，ATF4和ATF4靶基因的诱导较少(和图S3).
讨论
尽管几十年来人们已经知道PKM2在肿瘤细胞中的优先表达，但PKM2如何促进肿瘤发生仍不完全清楚。这里我们报道PKM1到PKM2的转换有助于糖酵解前体分流到丝氨酸合成途径(图S4). 与FBP类似，丝氨酸正向调节PKM2酶的活性。细胞内丝氨酸水平低会导致有氧糖酵解减少，PKM2的丙酮酸激酶活性低会促进作为内源性丝氨酸合成底物的糖酵化中间产物的积累。反过来，低水平的丝氨酸会激活GCN2并增强ATF4的翻译。ATF4诱导增加了PKM2上游积累的糖酵解中间产物中丝氨酸生物合成所需基因的转录。GCN2-ATF4和PKM2的联合功能对于细胞在缺乏胞外丝氨酸时维持细胞增殖是必要的。
必需氨基酸和谷氨酰胺是mTORC1的良好激活剂，在蛋白质翻译、细胞生长和增殖中发挥重要作用(27,28). 然而，目前尚不清楚除谷氨酰胺外的其他非必需氨基酸是否有助于mTORC1活性。这里我们确定丝氨酸也有助于mTORC1的调节。在丝氨酸缺乏的培养基中，表达PKM1的细胞表现出mTORC1活性降低和增殖受损。相反，PKM2表达细胞在丝氨酸缺乏的培养基中保持mTORC1活性和细胞增殖。mTORC1活性的维持依赖于完整的丝氨酸合成途径，因为当PKM2表达细胞在丝氨酸缺乏的培养基中转染PSAT1 siRNA时，mTORC2活性会丧失。
GCN2是一种由不带电tRNA激活的激酶，因此它是氨基酸耗竭的直接传感器。GCN2-ATF4通路在维持细胞内氨基酸稳态中起着关键作用(38,39). 在这里，我们发现丝氨酸和谷氨酰胺缺乏激活GCN2-ATF4途径，以上调丝氨酸合成所需的三种酶。再加上PKM2表达增加了底物的利用率，当外源性丝氨酸不足以支持增殖时，丝氨酸合成途径的上调为肿瘤细胞提供了生成丝氨酸的增强能力。最近的两份报告表明，含有PHGDH的基因组区域在乳腺癌和黑色素瘤中被扩增(33,34)，将糖酵解中间体转向丝氨酸合成。我们的数据表明，GCN2-ATF4信号通路的激活代表了上调PHGDH和丝氨酸合成途径中其他两种酶的生理机制，这两种酶独立于其基因组位点的变化。
根据目前的发现，可能有两种不同的方法来利用肿瘤细胞选择性表达PKM2来增强癌症治疗。一种方法是使用PKM2激活剂增加其酶活性，以恢复从PEP到丙酮酸的糖酵解通量，从而减少3-PG的积累。目前正在开发PKM2激活剂(40,41). 目前的研究还表明，另一种策略可能是开发抑制丝氨酸合成途径中一种酶的药物。
材料和方法
PKM1和PKM2 cDNA的转染及稳定细胞系的建立。
编码小鼠PKM1和PKM2基因完整编码区的cDNA从Open Biosystems购买，然后亚克隆到修改后的pIRESpuro载体（Clontech）中，该载体在多个克隆位点的N末端含有双HA或FLAG标签。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）在H1299细胞系中转染cDNA。将空的改良pIRESpuro载体用作转染对照。在嘌呤霉素处理（2.5 mg/mL；Invitrogen）后选择稳定的细胞系，然后进行限制性稀释。
RNAi。
靶向内源性人类PKM和PSAT1的siRNA是从Invitrogen中订购的。接下来，使用20 nM siRNA抑制内源性PKM1/2，50 nM用于PSAT1。使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）转染siRNA。
丙酮酸激酶活性测定。
如前所述进行丙酮酸激酶活性测定(11,20). 重组PKM2购自GenWay Biotech。
LC-MS分析。
为了测量代谢物水平，用人PKM1/2 siRNA转染标记的M1/M2细胞。在转染后48小时，细胞被切换到不含丝氨酸的培养基。24小时后，该培养基被含有25 mM[U的其他等效培养基取代-13C类6]葡萄糖。标记3小时后，通过快速抽吸培养基并立即添加−80°C 80:20甲醇：水提取溶液，代谢被抑制并提取代谢物。让提取过程在−80°C下持续15分钟，然后从平板上刮下细胞。然后在5300×克保持上清液10分钟，并用-80°C 80:20甲醇：水重新萃取碎片。再次离心产生的悬浮液，并将上清液与第一个上清液结合。然后将每个样品分成两个相同的部分，在氮气流下干燥。一部分重新悬浮在HPLC颗粒水中。另一部分重新悬浮在100μL 80:20甲醇：水中，通过添加10μL三乙胺和2μL氯甲酸苄酯进行衍生，以提高氨基酸的测量灵敏度。样品通过多个LC-MS系统进行分析（每个系统来自Thermo Scientific，并通过电喷雾电离进料），如前所述(42–44). 简单地说，一个在负离子模式下运行的独立轨道质谱仪（Exactive）与反相离子束色谱联用，用于从米/z85–1000，频率为1 Hz，分辨率为100000；以负离子模式运行的TSQ Quantum Discovery三重四极质谱仪与反相离子轰击色谱联用，用于通过多重反应监测分析选定的化合物。使用MAVEN软件套件分析数据(45). 结果根据蛋白质浓度进行标准化。
免疫印迹。
在1×RIPA缓冲液（细胞信号传导）中收获细胞。使用以下抗体：p-S6激酶、总S6K、S6、总S6、PKM2、总PKM（细胞信号）、PKM1（Abgent）、PSAT1（Abnova）和ATF4（Santa Cruz）。
逆转录和实时PCR。
按照TRIzol试剂（Invitrogen）方案提取总RNA。按照SuperScript II（Invitrogen）协议，在逆转录中使用1至3微克总RNA。在7900HT序列检测系统（Applied Biosystems）上使用Taqman基因表达分析（AppliedBiosystes）进行定量PCR。基因表达数据归一化为18S rRNA。
代谢物测量。
使用YSI 7100 MBS（YSI生命科学）测量葡萄糖摄取和乳酸生成。细胞培养16小时后，测定培养基中的葡萄糖和乳酸浓度；细胞消耗或产生的量是通过从无细胞培养液中的浓度减去样品培养液中浓度来确定的，然后将其归一化为细胞数。
