组织变形影响胚胎血管系统的发育(1)和收缩伤口(2). 目前的模型表明，来自血液的体力(三)，从单元格拖动相邻单元格(4)，以及在胞外矩阵（ECM）上(5)扭曲细胞膜受体和细胞骨架元件，调节生化信号通路以及内皮细胞和平滑肌细胞的行为(6). 然而，目前尚不清楚物理力是否能在空间上调节血管生成信号并促进血管模式。
血管生成分子调控细胞行为（生长、凋亡、迁移），其局部差异是形态发生和血管模式形成的基础。血管内皮生长因子（VEGF）是一种高度血管特异性的信号分子。VEGF分子的主要成分是VEGF-A，它与受体酪氨酸激酶VEGF受体2（VEGFR-2）结合。VEGFR-2激活多个下游信号分子，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、磷酸肌醇3-激酶、PKB（蛋白激酶B）或小GTPases(7). 因此，内皮细胞（EC）增殖、迁移、降解ECM并调节内皮通透性(7). 因此，VEGF-A/VEGFR-2系统的严密空间调控对控制血管发育至关重要。有趣的是，EC的生长和凋亡(8,9)和VEGFR-2的表达(三,10)受到物理力的调节。这种调节可能通过Rho抑制剂p190RhoGAP以及拮抗剂转录因子TFII-I（也称为GTF2I）和GATA-2之间的平衡发生(5).
血管模式由缺氧（缺氧）控制，缺氧通过缺氧诱导因子[HIF1α(11)]. VEGF梯度覆盖缺氧梯度，缺氧梯度定向、吸引并诱导新血管增殖(12). 冲洗组织后，缺氧减少，VEGF的生成也减少。这种图案化机制并不意味着组织的物理变形的作用。
微细加工平台是一种强大的工具，可以重现和系统地操作简化的组织形态发生案例，其复杂性介于2D细胞培养和模型生物之间(13). 在这份手稿中，我们展示了一个简单、经济高效、广泛适用的平台，用于组装3D独立组织。我们操纵组织变形并观察其对血管生成微环境梯度形成和血管生成的影响。
结果
自我重塑微细组织。
我们使用两种细胞类型的共培养来模拟血管生成的早期事件：人类脐静脉内皮细胞（hUVEC）是一种特征明确的EC类型(14)和人类间充质干细胞（hMSC）可以产生力量(15)，生产VEGF-A(16)从而在某些方面模拟了间质基质细胞。我们的微阵列数据以及其他数据(17)表明hMSC不显著表达VEGFR-2。事实上，在这种共培养中，VEGFR-2的免疫荧光仅限于hUVEC(图S1). 我们之前表明，这种共培养支持PECAM-1三维网络的形成+血管结构（VS）(18).
我们使用传统的软光刻和微成型来形成非粘附的琼脂糖模板(A类). 在这些模板上，我们通过依次将细胞聚集成微型集群和毫米级组织来组装组织(A类). 产生的组织是独立的，不含生物材料，可以很容易地操作(B类). 组织的初始投影面积为1 mm2高度为250μm。在五天的培养过程中，组织会自主收缩，形成定型变形，最终稳定其形状(C类,图S2). 盘状组织各向同性变形(C类，第一排），而方形组织变形不均。与侧面相比，角部位移和变形更大(C类，第二排，图S2,第页 = 0.0015,n个 = 10). 为了进行补偿，我们设计了星形组织，它逐渐变形为方形(C类，第三排）。这种各向异性变形表明内力分布不均匀。之前的模型表明，与远离这些边界的区域相比，边界和尖锐的几何形状会产生更大的力(9,19,20). 根据宏观行为和细胞密度，我们估计组织角部的局部应变比组织中心高两倍(图S3).
微结构组织会自动变形，并在高变形区域形成血管结构。(A类)三维毫米级组织阵列是通过细胞和微尺度细胞簇在非粘附微折叠孔中的顺序聚集来组装的。阵列从PDMS图章（透明阵列）复制到琼脂糖（粉红色阵列）中，并插入标准组织培养板中。(B类)生成的组织具有三维、毫米级、独立和无生物材料（比例尺，500μm）。(C类)微加工组织收缩、各向同性变形（上排）或各向异性变形（第二排/第三排），并最终稳定其形状（比例尺，500μm）。(D类–E类)PECAM-1用红色表示，F-actin用绿色表示。hUVEC和hMSC的微尺度细胞团首先自发形成PECAM-1+堆芯，堆芯[D类，星号，（比例尺，100μm）]和PECAM-1-外层。微尺度细胞团与相邻细胞融合后（24小时）产生F-actin密集界面。(E类)24小时后，PECAM-1+细胞是F-actin+然后开始发芽[E类，（比例尺，100μm）]。(F类)组织变形后，PECAM-1免疫染色显示在高变形区域[组织周边和角落，（比例尺，500μm）]优先形成VS。
内皮细胞萌发和血管结构模式的形成。
在微型集群中（第一步，A类，顶行），hUVEC和hMSC分离为PECAM-1核心+单元格（星号，D类)和PECAM-1的外层-细胞。分类可能是根据细胞亲和力（粘附分子的强度）和决定细胞结合的皮层张力的差异进行的(21). 合并时（第二步，A类，底部行），通过丝状肌动蛋白（F-actin，D类，24小时，图S4). 24小时后，PECAM-1+细胞变得F-肌动蛋白强烈，发芽成VS(E类)它分叉并形成包括少量管腔的线状结构。VS没有经历完全的小管生成，而是形成了如前所述的小而分散的管腔(18). 该模型与血管形态发生的早期阶段有关(13,18,20,22). 在无血清培养基中培养的细胞在无任何生长因子的情况下局部产生血管生成因子。组织自主收缩和变形（未施加外力）。该模型允许将内源性组织收缩和变形与VS的形成耦合。
在组织收缩和变形后（第5天），VS优先在周围区域形成(F类). 在盘状、星形和三角形组织中始终观察到VS的优先形成(F类,图S5). 在星形和三角形组织中，与侧面相比，VS在角部形成的密度更高(第页=0.0026和第页分别=0.002，图S5). 我们得出的结论是，VS优先在变形较大的区域形成。
肌动蛋白肌球蛋白调节组织变形。
我们通过阻断细胞中产生力量的元素来削弱组织的收缩性。非肌肉肌球蛋白II A、B和C（NMM II）和F-actin可能是hMSC中的主要力量来源(15). 布列比他汀阻断NMM II ATP酶的激活并损害其与F-actin的相互作用(23). Y27632抑制p160ROCK（Rho相关联线圈蛋白激酶），从而抑制肌球蛋白轻链的磷酸化和F-actin应激纤维的形成(23). 单独使用Blebistatin或Y27632培养后，组织收缩和变形与对照组相似。然而，当接触到这两种抑制剂的组合时，组织迅速从其初始面积的78%放松到84%(
A类和B类，参见黑色箭头，第页 = 0.0002,n个 = 10). 这种松弛表现为肌动蛋白-肌球蛋白复合物产生的内部张力状态。肌动蛋白和肌球蛋白受到抑制后，组织收缩功能随后受损(
A类和B类144小时，初始投影面积的70%与58%，第页 = 6.10-7,n个 = 10). 组织收缩受损但未停止，这意味着其他细胞骨架成分或机制可能起作用。根据细胞密度和宏观行为，我们估计当收缩受损时，整体应变会降低两倍(图S3).
组织变形是肌动蛋白依赖性的，并调节VEGF-A和VEGFR-2的表达。(A类,B类)24小时时非肌肉肌球蛋白II（Blebistatin）和Rho相关蛋白激酶p160ROCK（Y27632）的联合抑制（见B类)诱导内部组织张力松弛（28h）并损伤组织变形（150h）。(A类，顶行）组织变形导致高变形区域的局部压实（核，DAPI染色）和力生成元素的浓度[nm肌球蛋白II和F-actin免疫荧光，（标尺，100μm）]。(A类，底部行）变形受损时，此效果会受损。(C类)组织变形受损时，VEGF-A和VEGFR-2的表达水平较低。ECM相关基因保持相似。标准偏差，n个 = 3. (D类)当向培养基中添加VEGF清除抗体（PECAM-1免疫荧光）时，VS的形成受到强烈破坏。
组织收缩调节VEGF-A和VEGFR-2的基因表达。
为了研究组织收缩的分子变化，我们比较了正常收缩和受损收缩组织中血管生成基因的表达。ECM基因（I型胶原、层粘连蛋白α1、层粘着蛋白β5）和基质降解金属蛋白酶基因（MMP9、MMP13）的表达水平保持不变。然而，收缩组织中VEGF-A和VEGFR-2的表达水平高于收缩受损组织（第3天，C类). 我们通过向培养基中添加清除抗体来测试VEGF对VS形成的贡献。添加VEGF抗体显著减少了VS的形成，从而证明了VS对VEGF的关键依赖性(D类). 在对照试验中，我们在细胞颗粒中发现，VEGF抗体通过减少细胞增殖来阻止VS的形成(图S6). 我们的结论是VEGF对VS的形成是必要的，组织收缩并不直接诱导VS的生成。
局部组织致密化对血管模式的形成有部分贡献。
然后我们询问组织的各向异性变形是否导致细胞密度的局部变化。组织收缩变形后，细胞密度从组织中心向周围逐渐增加(B类,A类). 收缩受损时，这种梯度受损(B类,A类)与NMM II和F-actin的增加相关(B类).
局部组织致密化在一定程度上促进了血管结构的局部形成。(A类,B类)VS在高变形区域以较高密度形成(A类,B类左，从中心到外围：VS/细胞核增加2.5倍）。当组织收缩和变形受损时，VS在整个组织中均匀生长(A类,B类右侧）。(B类,C类)组织变形导致局部组织致密化(B类，细胞核数量，顶行）和薄VS的形成，包括一些管腔（星号，C类左）。VS优先垂直于组织位移伸长(A类,C类，箭头表示位移方向）。当收缩和变形受损时，这种表型和方向性受损[A类,C类，右，（比例尺为100μm）]。(D类)局部组织致密化部分有助于VS的局部形成。细胞密度的局部增加占VS局部增加的48%(D类左，正常收缩）。当收缩受损时，这一贡献增加到73%(D类，右侧）。
然后，我们评估了局部组织致密化对VS局部形成的影响。组织中心的细胞密度均匀，但外围区域的细胞密度逐渐增加(
A类和B类). 同时，VS密度增加了4.8倍，VS/核密度增加了2.5倍(
A类和B类). 当组织收缩性受损时，细胞密度梯度受损，VS在整个组织中均匀生长(
A类和B类). 较高的局部细胞密度直接导致VS密度增加48%(D类). 该测量评估了局部组织致密化诱导的VS浓度超过直接浓度，并表明内源性收缩力的作用更为复杂。事实上，组织收缩受损后，细胞密度的贡献增加到73%(D类).
组织收缩导致血管结构表型的改变。
VS的表型在整个组织中发生了变化。在高变形区域，VS较薄，形状和长度垂直于组织位移(C类，左，白色箭头表示从拐角到中心的方向）。VS的这个方向与之前的报告有关，这些报告描述了EC垂直于外部施加的机械应力的延伸率(24). 当内源性收缩力受损时，VS均匀增长，变宽、曲折且随机定向(C类右侧）。
血管形态发生可由局部组织缺氧驱动，该缺氧调节多种血管生成因子的产生(11). 组织被设计成具有减轻缺氧环境形成的尺寸。然而，我们通过观察HIF1α的分布来测试局部缺氧环境的可能形成，HIF1α转移到缺氧细胞的细胞核以激活血管生成基因(11). 在这里，HIF1α是细胞质的，在组织中均匀表达。HIF1a的细胞质表达表明组织中缺氧水平低且均匀(图S7).
组织收缩性局部调节VEGFR-2的表达。
EC是机械敏感性细胞(10,20)可根据微环境的机械特性转录调节VEGFR-2受体的表达(5,10). VEGFR-2介导VEGF-A的主要生长和渗透作用(5). 基于VEGFR-2基因表达水平的差异(C类)，我们测试了EC通过空间调节VEGFR-2的表达对组织变形作出反应的可能性。VEGFR-2的表达仅限于PECAM-1+单元格(图S1)，一种细胞间粘附分子，被认为传递机械力，但其表达不受机械力调节(三). 组织收缩后，PECAM-1+高变形区域的细胞表达较高水平的
面积（增加8.5倍）比中央区域的细胞(第页 = 0.026,n个 = 15,
A类和C类). 当收缩受损时，VEGFR-2/PECAM-1的表达+面积减少，整个组织变得均匀(
A类和C类). VEGFR-2表达的这种局部增加与细胞膜上高荧光强度簇的形成有关(图S1). 该观察结果与之前描述VEGFR-2复合物在机械剪切应力作用下形成的报告一致(10). VEGFR-2过度表达的区域非常局限（中心到外围距离的最后20%）。我们得出结论，基于mRNA表达水平(C类)在免疫荧光强度的差异上，内源性组织收缩性诱导了VEGFR-2受体的数量和空间调节。
组织收缩性在空间上调节VEGF和VEGFR-2的表达。(A类,C类)组织收缩和变形后，VEGFR-2在高变形区域表达较高水平(A类,C类左，VEGFR-2荧光强度/PECAM-1+面积增加3.5倍，n个 = 15,第页 = 0.026). 当组织收缩性受损时，VEGFR-2的这种局部增加就会受损[A类,C类右侧，（比例尺为100μm）]。在高变形区域，VEGFR-2在EC细胞膜上形成簇(图S1). (B类,D类,E类,F类)正常收缩后，通过局部压实和分级生产形成VEGF梯度。(B类–E类)高变形区域的荧光强度高出两倍(B类–E类，左；C类是拐角区域的特写）。这一观察在mRNA水平上得到证实(图S8A类). 当组织收缩性受损时，VEGF的梯度受损(B类,E类，右侧）。(F类)对细胞核数量进行归一化后，在高变形区域，VEGF/细胞核的荧光强度较高(第页=0.034），并且在收缩组织中高于在收缩受损的组织中(第页=0.032，另见图S8B类). (G公司)在正常收缩的细胞颗粒中，VEGF的产生（ELISA测定）高于收缩受损的细胞颗粒(第页 < 0.001). (H（H）)收缩受损特别影响VEGF亚型165和189（ECM-结合亚型）的表达。亚型121和145（非ECM-结合亚型）的表达水平保持不变(第页 < 0.001).
组织收缩调节血管内皮生长因子梯度的形成。
基于VEGF-A基因表达水平的差异(C类)因为hMSC是机械敏感性细胞(15)，我们测试了组织收缩性在空间上调节VEGF-A蛋白表达的可能性。我们切下组织角，观察到角部VEGF-A mRNA的表达是中心的1.5倍(n个 = 3,第页 = 0.07,图S8A类). 免疫荧光染色（所有VEGF亚型）显示VEGF形成梯度：组织角的荧光强度是组织中心的两倍(
B类,D类和E类). 当收缩受损时，VEGF荧光强度梯度受损(E类)组织中表达的总荧光强度减少了两倍(第页 = 0.032,n个 = 3,F类). 在对细胞核数量进行归一化后，与位于中心的细胞相比，高变形区域的细胞具有更高的荧光强度(第页 = 0.034,n个 = 15,F类). 我们使用2D分析评估了荧光强度测量的有效性：去甲氧胺[DFO，一种HIF-1a诱导剂(25)]诱导VEGF免疫荧光染色强度加倍。这种增加与细胞内VEGF生成增加五倍有关（细胞裂解物上165和121亚型的ELISA检测，图S9). 我们进一步评估了细胞生成力在细胞颗粒（50万个细胞、92%的hMSC和8%的hUVEC）中产生VEGF蛋白的作用。收缩受损的颗粒产生的VEGF蛋白比正常收缩的颗粒少1.6倍(G公司，培养基上的ELISA检测，n个 = 3,第页 < 0.001). 这些观察结果表明，组织收缩调节VEGF的表达。我们的结论是，组织变形通过局部组织压实和VEGF表达的局部调节来调节VEGF梯度的形成。
细胞生成力调节ECM结合异构体VEGF的产生189和血管内皮生长因子189.
VEGF的产生是通过mRNA剪接来调节的，mRNA剪合诱导各种亚型的形成(26). VEGF亚型在肝素结合域（HBD）中不同，这影响了它们与细胞膜和ECM的结合能力。这种特性可以调节它们在细胞外空间的定位(26)适合创建分子梯度(27). 血管内皮生长因子121，是最短的同种型，缺乏HBD，呈弱酸性，在分泌时可自由扩散。血管内皮生长因子189是一种较长的亚型，有两个HBD，大部分被隔离在ECM和细胞表面。血管内皮生长因子165具有中间性质，对肝素具有中等亲和力，并且是可溶的和结合的(26). 通过异型体特异性聚合酶链反应，我们在细胞颗粒中观察到VEGF165和血管内皮生长因子189与收缩受损相比，正常收缩时的表达高2.5倍(H（H）,第页 < 0.001,n个 = 3). 相反，VEGF的表达121和血管内皮生长因子145保持不变。该观察结果表明，组织变形会影响较长的肝素结合VEGF亚型的表达。我们推测，这两种亚型的ECM和细胞结合特性通过阻止蛋白质扩散加强了VEGF梯度的形成。
组织收缩诱导内皮细胞局部增殖。
由于组织变形调节了VEGF-A和VEGFR-2的微环境浓度，并且VEGF-A是一种通过VEGFR-2发挥作用的有丝分裂原，因此我们量化了EC的局部增殖。使用脉冲暴露于EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）（5-乙酰基-2'-doxyuridine暴露超过12小时，每日时间点超过5天），我们观察到EdU+细胞仅限于PECAM-1+细胞。教育部+细胞占总细胞数的0.3至1%(图S10). 组织变形后，高变形区域的VS包括更多增殖细胞（EdU+)而不是组织中心的VS(
A类和B类28%对8%，第页 = 0.016). 变形受损时，增殖细胞密度较低（8%），且分布均匀(
A类和B类). 最后，我们量化了PECAM-1的数量+每个VS的细胞数。正常变形后，PECAM-1的数量+VS中的细胞从组织中心向角落增加(C类). 当收缩受损时，PECAM-1的数量+VS中的单元格保持不变(C类). 纸巾角落的VS包括更多PECAM-1+正常收缩与受损收缩时的细胞(C类). 我们得出结论，高变形区域的VS是通过较高的EC增殖形成的，这导致每个VS的细胞数量增加。
组织变形导致内皮细胞增殖的局部差异。(A类,B类)EdU脉冲掺入显示在高变形区域中增殖EC的百分比较高。当组织变形受损时，EC增殖的这种局部差异被消除。(C类)与变形受损的组织相比，高变形区域的VS包括变形组织中较高数量的EC。
我们认为组织变形可以在空间上调节VEGF-A和VEGFR-2的表达，并通过诱导EC增殖的局部差异而有助于VS模式的形成。
讨论
血管模式可以从血管生成信号的空间调节中产生，包括有丝分裂原的浓度和EC敏感性(5,28). 在这里，我们认为组织收缩和变形可以在空间上调节细胞密度、VEGF-A和VEGFR-2的局部表达，并诱导EC增殖的局部差异。
通过调节生产、保留、控制释放、扩散和降解形成形态梯度(12,29). 我们的数据表明，间质细胞可以通过局部组织压实和VEGF信号的局部调节形成血管生成微环境的梯度。ECM-结合VEGF亚型（VEGF）的调节165和血管内皮生长因子189)通过组织收缩可以阻止VEGF蛋白扩散并增强分子梯度(30).
VEGF对VEGFR-2的激动活性(我)通过局部梯度引导位于VS尖端的细胞萌芽（丝状足亚纲/板足亚纲沿着浓度差延伸），以及(ii（ii）)基于局部浓度（绝对浓度）诱导以下秸秆EC的增殖(12). 我们的观察结果表明，较高的局部VEGF浓度和相应受体VEGFR-2的局部表达诱导了茎细胞增殖的局部差异。先前的研究表明，EC形状和细胞骨架张力调节G1/S边界处的离散细胞周期检查点。机械因素通过cdk抑制剂p27和激活因子cyclin D部分调节对有丝分裂原的敏感性(31,32). 我们推测EC的局部增殖是由于细胞骨架张力和VEGF-A/VEGFR-2密度的适当结合所致。
该实验将组织收缩和变形与血管生成微环境梯度的形成联系起来。在进一步的研究中，这种相关性可能解释了组织内或相邻组织之间产生的收缩力如何对毛细血管的形成起到远程控制作用。这些发现可能与伤口愈合有关，据报道，血管形态发生是由收缩的伤口机械驱动的(2)-或者在癌症生物学中，肿瘤依赖于血管生成，由于内生张力升高，肿瘤比正常组织更坚硬(33).
自我组织可以从组织的收缩性和几何形状中产生。这些特性会导致异质组织变形，并使细胞的行为模式化。我们认为组织收缩和变形可以调节血管生成微环境和血管生成梯度的形成。我们推测，这种机制可能有助于血管系统的长期模式。
