介绍
驱动新形式和功能的遗传变异通常归因于遗传密码的突变。我们之前提出了一种完全不同的创造可遗传表型多样性的途径1通过这种方式，新性状的遗传可以先于最终将其固定下来的遗传变化。这种看似自相矛盾的信息流的机制存在于表观遗传开关中，这些开关完全由蛋白质结构的自我永存变化（称为朊病毒）编码。
研究得最好的朊病毒是酵母翻译终止因子Sup35。与其他朊病毒一样，Sup35携带一个朊病毒决定域（PrD），这对蛋白质的正常功能来说是不必要的。该PrD偶尔采用淀粉样构象。当它这样做时，淀粉样蛋白通过模板化与其他Sup35分子的PrD相同的构象而使其自身永存。这将大多数Sup35隔离成不溶性纤维2翻译终止活性的降低增加了终止密码子的读入，产生了多种依赖于先前隐性遗传变异的新性状。
正如有丝分裂器确保染色体决定性状的遗传一样，Hsp104提供的朊蛋白分配功能三,4确保朊病毒表型的遗传。Hsp104是一种切断朊病毒纤维的分子机器，允许复制的朊病毒模板被子细胞忠实地遗传。由Sup35形成的朊病毒被称为[磅/平方英寸+]，括号表示其细胞质遗传，大写字母表示其显性表型。
非rion中表达Sup35的细胞[磅/平方英寸−]状态自动切换到[磅/平方英寸+]频率约为1/106（参考文献#5,6). 我们建议[磅/平方英寸+]提供了一种有益的“bet-hedgeng”机制，以提高在波动环境中的存活率：当酵母菌落达到可观的大小时[磅/平方英寸+]细胞会出现，表达可遗传的新特性。如果这种特性是有害的，那么在大量的种群中只有少数个体会丢失。然而，如果这是有利的，那么这些少数细胞可以确保在种群否则会死亡的条件下存活。[磅/平方英寸+]偶尔也会丢失。这保证了[磅/平方英寸−]单元格将出现在[磅/平方英寸+]殖民地，提供了互补的生存优势。
这种机制的一个特别吸引人的特点是，它可以立即获得遗传复杂性状1,7.终止密码子下游区域经常积累遗传变异。[磅/平方英寸+]-介导的通读允许这种先前隐秘的变异同时在多个位点上产生生物学后果。如果在发生突变时必须选择单独贡献的突变，那么这种朊病毒产生的复杂性状就不太可能进化。从长远来看，翻译保真度的降低应该是有害的。然而，有利的表型最初依赖于[磅/平方英寸+]可能通过各种方式被同化7使朊病毒丢失并保持特性。
有几条证据支持这一假设。首先，从数学上讲，即使是对[磅/平方英寸+]足以维持Sup35的朊病毒转换能力8,9第二，Sup35的PrD序列高度分化，但至少5亿年来保留了两个不寻常的特征，这两个特征调节朊病毒和非朊病毒表型的双稳态遗传。一个片段中的极端氨基酸偏倚使PrD变成自模板朊蛋白淀粉样蛋白，而紧邻的带电片段使其稳定在可溶性非朊蛋白状态。第三，当细胞不适合其环境并且新的表型有更好的机会受益时，细胞进入和退出朊病毒状态的速度增加10转换增加是不同环境压力对蛋白质折叠和体内平衡影响的直接结果11,12并实现了对这种演化函数的关键理论预测6,13.
除Sup35外，至少两盎司的其他蛋白质可以形成朊病毒，通过Hsp104的朊病毒分配活性传递14,15实验室酵母。这些朊病毒在转录因子和RNA处理蛋白中显著富集，这些转录因子和RNA处理蛋白能够很好地将遗传变异转化为表型效应。因此，它们也可能使多样的生物特征得以遗传，从而提高在波动环境中的生存能力。然而，尽管这些想法可能很有吸引力16和酵母朊病毒一样，它们的适应性价值仍然备受争议17–19事实上，朊病毒通常被归类为罕见的酵母“疾病”或实验室培养的人工制品。一个关键的论点是[磅/平方英寸+]在野生菌株中还没有发现其他具有表型结果的朊病毒，尽管人们试图找到它们。在这里，我们通过对数百种野生菌株的生物化学和生物学分析，确定了朊病毒的自然生物学重要性。
[磅/平方英寸+]发生在野生菌株中
要搜索[磅/平方英寸+]在野生菌株中，我们利用了离子洗涤剂中朊蛋白-淀粉样蛋白组合的异常稳定性，这使得通过半变性洗涤剂-淀粉凝胶电泳（SDD-AGE）对其进行鉴定成为可能4。我们修改了该技术以实现高通量检测。最终，我们分析了来自不同生态位的690株酵母菌株(补充表1). Sup35的淀粉样聚合物存在于10个(,补充表1,补充图1).
野生酵母中朊病毒的鉴定和验证。一，一个代表性的野生酵母分离物SDD-AGE杂交，用Sup35和Rnq1抗体进行检测。淀粉样聚合物会产生特征性的涂抹。SDD-AGE不能可靠地检测单体蛋白。b条GdHCl对Hsp104的瞬间失活或Hsp104显性阴性突变体的表达消除了这些淀粉样蛋白，表明它们是[磅/平方英寸+]和[注册护士资格+]朊病毒。
为了确保这些菌株不只是从最近的、含有朊病毒的共同祖先那里获得的，我们对其中两个菌株的基因组进行了测序。超过25000个单核苷酸多态性确定了它们的独立起源(补充图2). 我们还对第35页一些菌株中的基因，确定了它们也有独立的起源(补充表2).
野生菌株的Sup35淀粉样蛋白遗传依赖于Hsp104朊蛋白分配因子
这些菌株中的Sup35淀粉样蛋白是否代表真正的朊病毒？由于其在朊病毒模板遗传中的核心作用，即使是对Hsp104蛋白重塑活性的短暂抑制，也可以遗传性地“治愈”细胞的朊病毒元素。我们通过在含有低浓度盐酸胍（GdHCl）的培养基上生长来抑制Hsp104功能，该培养基选择性地抑制其ATP酶活性，然后将细胞放回不含GdHCl的培养基。在所有情况下，这都消除了淀粉样蛋白（黑色箭头，和补充图1B). 为了确保治愈不是由于GdHCl的非靶向效应，我们采用了一种遗传方法——瞬时表达显性阴性Hsp104变异体三，Hsp104DN（公称直径）在标记有抗生素耐药性的质粒上。（野生菌株不含营养缺陷。）这也治愈了淀粉样细胞，证实了其基于朊病毒的遗传（黑色箭头，和补充图1B–C).
实验室培养不负责任
这些朊病毒可能只是作为实验室培养条件的产物出现的吗？在归档野生菌株时，要特别注意保持其野生特性（个人通信，Linda Bisson）。为了直接确定使用的条件是否可能无意中选择了从头开始的外观[磅/平方英寸+]，我们比较了存档菌株及其固化衍生物在所有相关培养基上的生长情况。找不到的增长优势[磅/平方英寸+]在这些菌株的任何培养基上（YPD、酵母马铃薯葡萄糖、YM肉汤、FM肉汤、麦芽汁琼脂或沃勒斯坦营养琼脂），有时是有害的(补充表3). 然而，在应变#5672中[磅/平方英寸+]在合成葡萄must培养基上产生了极强的选择性优势，这种培养基概括了早期葡萄酒发酵的条件20这表明朊病毒在该菌株的自然生态位中具有优势(补充图3). 无论如何，这个实验和其他几个实验(补充信息)表明野生菌株所携带的朊病毒几乎肯定起源于酵母的自然环境。
野生[磅/平方英寸+]与关联[注册护士资格+]
在实验室中，Sup35向朊病毒状态的转换强烈依赖于朊病毒激活因子[无线电频率+]21. [注册护士资格+]本身是由Rnq1蛋白形成的朊病毒22. [注册护士资格+]是已知的野生毒株中唯一存在的朊病毒18,23,24.我们筛选了我们的系列[注册护士资格+]淀粉样蛋白，在43个菌株中发现(). 这些也取决于朊病毒分配因子Hsp104（箭头，和补充图1). 之间的相关性[注册护士资格+]和[磅/平方英寸+] (P（P）<0.0001，Fisher精确测试）令人震惊：[磅/平方英寸+]所含菌株[注册护士资格
+]. 这强烈表明[注册护士资格+]作为朊病毒诱导因子[磅/平方英寸+]在自然界中。
[磅/平方英寸+]改变自然遗传变异
野生朊病毒是否从其他加密的自然变异中产生表型多样性？我们比较了野生植物的生长[磅/平方英寸+]菌株及其固化衍生物在四个碳源中，在渗透、氧化、pH或乙醇胁迫下，以及在抗真菌药物或DNA损伤剂的存在下。我们还评估了它们侵入生长基质的能力。
朊病毒治疗产生了许多随遗传背景变化的表型变化(). 例如，从白葡萄酒中分离出的菌株UCD#824对酸性条件和氟康唑具有抗性(). 从兰布鲁斯科葡萄中分离出的UCD#939对DNA损伤剂4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）具有抗性(). 这些有益的表型因朊病毒的固化而大大降低。从博若莱葡萄酒中分离的UCD#978对氧化应激源tBOOH敏感()并且变得对固化更具抵抗力。同一菌株通常能穿透琼脂表面，但在朊病毒固化后，这种能力就丧失了(). 因此，在UCD#978中，朊病毒产生了一种权衡，根据情况创造出潜在有害或有益的特性。
朊病毒相关表型[磅/平方英寸+]分离物。一，野生[磅/平方英寸+]菌株表现出不同的表型，这些表型被短暂的Hsp104抑制所消除。在指定的选择性条件下，野生菌株和固化衍生物的生长曲线分别为封闭的蓝色圆圈和开放的红色圆圈。每个野生菌株（封闭灰圈）及其固化衍生物（开放灰圈）的YPD生长作为对照。OD600，在600 nm处测量的光密度。b条，野生表型[磅/平方英寸+]菌株也通过表达Sup35ΔPrD而被消除。在指定的选择性条件下，表达Sup35或Sup35ΔPrD的野生菌株的生长曲线分别为封闭的蓝色圆圈和开放的红色圆圈。表达Sup35（封闭灰圈）或Sup35ΔPrD（开放灰圈）的指示野生菌株的YPD生长作为对照。误差条出现在所有点上，代表四个独立生物复制品的标准偏差。
遗传同化[磅/平方英寸+]-UCD978减数分裂后代中的依赖性粘附表型。一, [磅/平方英寸+]允许葡萄酒酵母UCD#978粘附在琼脂表面。GdHCl或b条，Sup35的非聚合版本的表达式，Sup35ΔPrD。c（c），菌株UCD#978的减数分裂后代显示出表型的多样性。在一些孢子中，粘附表型被同化，甚至在[磅/平方英寸+]朊病毒被治愈了。在其他情况下，粘附表型保持不变[磅/平方英寸+]依赖性。最后，一些人完全失去了表型，而不管[磅/平方英寸+]状态。
GdHCl和Hsp104DN（公称直径）治疗其他依赖Hsp104的朊病毒的细胞[磅/平方英寸+]14,15.确定这种可治愈的表型是否来源于[磅/平方英寸+]我们用表达缺乏PrD的Sup35变异体（Sup35ΔPrD）的质粒转化了10株菌株。这种蛋白质对[磅/平方英寸+]-中介隔离和恢复正常翻译终止[磅/平方英寸+]不改变其他朊病毒的细胞14在大多数情况下，Sup35ΔPrD产生的变化与GdHCl和Hsp104固化的变化相同DN（公称直径）(,，请参阅SI以获取讨论）。因此，大多数原始性状是由于[磅/平方英寸+].
固定[磅/平方英寸+]-依赖性表型
当不同背景的实验室菌株杂交并产孢时，它们所包含的遗传变异的减数分裂重组可以导致朊病毒特性的固定1,7也就是说，虽然该特性最初依赖于朊病毒，但它可以成为非朊病毒依赖性的。这种机制可能会使野生菌株驱动朊病毒依赖性性状固定吗？野生酵母通常具有相当大的杂合性，测序表明[磅/平方英寸+]菌株UCD#978具有高度多态性。我们问这些多态性的简单重新分类是否可以修复[磅/平方英寸+]-依赖性状。
对UCD#978的30个随机单倍体后代在固化前后的琼脂粘附性进行了测试。5个保留[磅/平方英寸+]-依赖性粘附；二十个不再粘着，有或没有[磅/平方英寸+]; 五种粘合剂即使在[磅/平方英寸+]固化(). 考虑到固定的频率，可能需要重新分类一些不同的多态性。但很明显，仅此菌株中自然发生的遗传变异就足以修复此特性。
[交通运输部3+]发生在野生菌株中
最近在酵母中发现了近两种具有朊蛋白形成能力的蛋白质（综述于15). 巧合的是，其中一个内源性六istidine基序，即转录抑制因子Mot3，允许在SDD-AGE免疫印迹上检测1416种酵母蛋白含有六istidine基序，但只有Mot3具有类似朊病毒的序列14。我们发现[交通运输部3+]我们测试的96种不同菌株中的6种淀粉样蛋白(补充表1).
确定是否为野生[交通运输部3+]朊病毒产生了潜在的适应性表型，我们首先利用了Mot3作为细胞壁生成相关基因的转录阻遏物的已知功能。我们进行了野外测试[交通运输部3+]菌株对细胞壁毒素钙氟白色的耐药性。从冬青浆果中分离出的Y-35菌株对钙氟具有高度抗性。GdHCl治疗可遗传性降低耐药性，该治疗也可消除耐药性[交通运输部3+]淀粉样蛋白().
细胞壁重塑转录因子Mot3的朊蛋白在野生菌株中具有不同的表型结果。一，菌株Y-35对细胞壁靶向药物钙氟白色具有耐药性，但通过传代GdHCl，耐药性大大降低。对Mot3内源性六istidine基序的探索表明，Mot3淀粉样蛋白保留在未固化的菌株中，而不是固化的菌株。表观单体信号来自与其他酵母蛋白的交叉反应。b条、[交通运输部3+]菌株NCYC#3311和Y-1537（均显示为蓝色圆圈）分别对酸性生长条件和氟康唑具有抗性。通过GdHCl传代（开放的红色圆圈）对朊病毒进行治疗，可以逆转每个表型。c（c），这些表型也通过表达非聚集型Mot3，Mot3ΔPrD（开红圈）而逆转。Mot3本身的表达（封闭的蓝色圆圈）不影响任何菌株的表型。误差条表示四个独立生物复制品的标准偏差。
作为一种转录阻遏物，当Mot3转入或转出其朊蛋白形式时，它具有广泛转换信息流的潜力。我们接下来筛选野生[交通运输部3+]在与野生植物相同的生长条件下生长的菌株及其固化衍生物[磅/平方英寸+]菌株。朊病毒治疗改变了许多表型[交通运输部3+]NCYC#3311是一种芬兰土壤分离物，对酸性条件具有抵抗力。[交通运输部3+]从葡萄中分离得到的Y-1537对氟康唑具有抗性。通过使用GdHCl固化，这两个性状实际上都被消除了().
为了确定这些特征是否[电动机3+]-依赖性，我们表达了一种缺乏PrD的Mot3蛋白（Mot3ΔPrD），该蛋白对朊病毒隔离免疫，但保留正常的转录功能（Halfmann等人正在准备中）。类似于Sup35ΔPrD，这消除了[交通运输部3+]表型不影响其他朊病毒。NCYC#3311失去了耐酸性，Y-1537失去了对氟康唑的抗性，但没有表达全长蛋白的质粒(). 因此，这些表型[交通运输部3+]-依赖。更广泛地说，这种朊病毒在不同菌株中产生的不同结果表明[磅/平方英寸+], [交通运输部3+]通过改变自然遗传变异的表现形式提供表型多样性。
野生菌株含有额外的朊病毒
野生菌株携带朊病毒的频率有多高，能够创造这种可遗传的表型多样性？由于缺乏通过SDD-AGE检测它们的方法，我们采用了一种表型方法：我们测量了GdHCl固化前后野生菌株的生长，在相同的条件下用于[磅/平方英寸+]和[交通运输部3+] (补充图4). 确保任何此类表型不会因从头开始突变，我们将每个野生菌株的四个菌落与四个治愈的衍生物进行了比较（共测试了12种条件下的5520个菌株）。
值得注意的是，超过三分之一的原始野生菌株（255）的表型在所有四个亲本野生菌株和所有四个治愈的衍生物之间存在相同的差异。此外，这些GdHCl可治愈的遗传元素所赋予的近一半的生长特性是有益的(补充表1). 野生菌株收集偏向于来自自然发酵的葡萄酒分离物。但它也含有许多来自啤酒、土壤、水果、感染者和商业菌株的样品，这些样品最近受到人为选择压力，以提高烘焙和酿造的性能。所有这些生态位的酵母菌都存在有益和有害的可治愈表型。即使在这里测试的有限数量的条件中，朊病毒治疗在15%的菌株中也有混合的表型结果。因此，就像[磅/平方英寸+]和[交通运输部3+]，这些朊病毒产生了不同的权衡——根据情况，这些权衡是有益的还是有害的。
为了测试改变的表型是由朊病毒介导的蛋白质模板还是由暂时接触GdHCl的某些未知（但不知怎么遗传和可复制）效应引起的，我们对25个随机选择的菌株进行了更严格的调查。Hsp104的瞬时表达DN（公称直径）25株菌株中22株的盐酸胍治疗效果(补充表1)建立了它们对这个朊病毒分配因子的依赖性。
朊病毒的另一个特征是通过细胞质转移（细胞诱导）传递给其他细胞。野生酵母的可治愈表型元素是否具有这种特性？由于野生酵母工作的复杂性，我们使用W303的衍生物，W303是一种常见的实验室菌株，作为细胞质转移的通用“受体”。由于朊病毒依赖性性状可能因遗传背景而异，我们选择了具有多种可治愈性状的野生菌株作为这些未知朊病毒的供体，以增加转移被表型评分的可能性。南非葡萄酒菌株WE372有两个因朊病毒固化而遗传丢失的性状(，箭头）：在富培养基上生长异常强劲，而在pH值为9时生长较差。临床分离株YJM428具有三个这样的特征(，箭头）：在氯化钠和4-NQO中生长旺盛，但在麦芽糖中生长较差。
野生酵母中可治愈的Hsp104依赖的表观遗传元件可以进行细胞质转移。一野生菌株WE372、YJM428及其固化衍生物在选择性条件下的生长。每个菌株的原始分离物以灰色条显示，其固化衍生物（用黑色箭头表示）以开放条显示。误差线是六个生物复制的一个标准偏差。b条，细胞诱导实验和控制示意图，以确保表型是由朊病毒引起的，而不是线粒体DNA的转移。c（c）、实验室受体的生长测量（蓝色条）、细胞导管（灰色条；红色箭头表示表型的细胞质转移）以及这些细胞导管的固化衍生物（开放条；黑色箭头表示表型可固化）。误差线是12种细胞导管、这些细胞导管的12种固化衍生物或受体菌株的6种生物复制品的生长测量标准偏差。d日，从原始野生菌株（哈希棒）的固化衍生物中获得细胞质的细胞质导管在表型上没有表现出同等的变化。误差条表示生长测量值与受体菌株的12个细胞导管或6个生物复制品的标准偏差。
在杂交供体和受体菌株以产生异核体后，我们选择了只具有W303受体细胞核但从野生供体获得细胞质的芽(顶部；有关详细信息，请参见方法）。我们测试了每一次交配中的12个这样的细胞导管，以确定它们是否从细胞质转移中遗传了稳定的新性状。
pH值为9时的生长不良未被转移，但在富培养基上的强劲生长从WE372供体转移到所有12个W303受体（红色箭头，). NaCl抗性没有转移，但4-NQO上的增强生长和YP-麦芽糖上的不良生长都从YJM428供体转移到所有12个W303受体（红色箭头，). 转移性状的保真度表明，它们并非由于这种杂交中可能发生的罕见染色体转移。一些性状缺乏转移表明[磅/平方英寸+]和[交通运输部3+]，这些未知遗传细胞质因子产生的性状取决于遗传背景。通过GdHCl（黑色箭头，)强烈表明它们是由朊病毒引起的。排除这些特征是由于线粒体DNA转移的可能性，我们对异核体形成前已治愈朊病毒的WE372和YJM428供体重复了整个实验(，底部）。没有人获得新的表型().
朊病毒改变野生菌株的基因型和表型之间的关系
野生酵母的朊病毒在多大程度上改变了遗传多样性的表型表现？我们在我们收集的21株基因组已完全测序的菌株中检测了基因型和表型之间的关系。如前所述25,26对于野生酵母，基因型和表型之间的Spearman相关性（rho）通常在0.3到0.4之间（在我们的菌株和条件下，rho=0.39；P（P）= 3.5 × 10−15). 朊蛋白缺失使基因型和表型之间的相关性减弱（Spearman的rho=0.27；P（P）= 1.5 × 10−7). 这一发现对数据的随机排列是可靠的(P（P）=0.0001），并且即使在[磅/平方英寸+]和[交通运输部3+]从分析中删除菌株。因此，这些野生菌株的朊病毒广泛与基因组中的多态性结合，从而影响基因型和表型之间的关系。
讨论
朊病毒产生的稳定遗传和复杂表型源于蛋白质构象的变化，而不是核酸的变化。这种非规范的遗传模式引发了相当大的兴奋，并引发了激烈的机械研究（有关综述，请参阅27). 但怀疑是否[磅/平方英寸+]自然界中存在的其他朊病毒引发了对其相关性的深刻争议11,28我们发现朊病毒和依赖朊病毒的表型在自然界广泛存在，从而确立了它们的生物学重要性。
酿酒酵母也许是实验科学中最具特征的有机体。那么，这种对生物性状遗传的普遍影响怎么会被忽视这么久呢？频率[磅/平方英寸+]野生菌株的研究表明，之前的研究工作并没有检测到足够的菌株（有关进一步的讨论，请参阅SI）。但我们怀疑酵母遗传学的标准实践提供了一个更普遍的解释。新性状的表型分析通常从测试杂交组合中的2:2分离开始，并丢弃不遵循孟德尔模式的变体。丢弃被证明仅限于单个菌株的变体也是常见的。因此，基于朊病毒的表型可能在很大程度上被忽视，因为研究受到已知核酸遗传规则和忽视菌株特异性变异的生物学意义的实用主义的强烈偏见。
我们发现，在野生菌株中，朊病毒依赖性性状可以通过内生遗传变异的减数分裂重分类很容易固定。（它们也可能被新的突变所修复，这是一种尚未探索的现象。）因此，朊病毒提供了一种强大的机制，通过这种机制，酵母可以表观遗传地增加其表型多样性，从而使这种多样性在下一代中变得坚韧。最近，癌症细胞中出现了一种奇怪的相似转变的证据，即从表观遗传性状到遗传硬连线性状的转变29,30在这种情况下，潜在的表观遗传机制是基于染色质而不是基于蛋白质。但是，这些观察结果共同表明了表观遗传学在进化过程中重要性的新观点。
在压力条件下，细胞会增加其进出[磅/平方英寸+]状态10遗传表型多样性和环境偶然性之间的这种联系是应激诱导的蛋白质稳态破坏的自然结果31–34这种应激调节因子与蛋白质体内平衡相互作用，以多种方式驱动朊病毒转换增加（参见补充信息供讨论）。除了这些更一般的稳态机制外，单个朊病毒蛋白中的构象转换很可能会被额外的蛋白特异性相互作用和翻译后蛋白修饰所调节。
令人惊讶的是，在我们测试的12种条件下，我们观察到的野生朊病毒产生的40%的性状有利于生长。这与突变变异体的后果形成对比，其中绝大多数是沉默的或有害的。因此，在野生酵母中产生朊病毒特征的潜在的、神秘的变异，以及朊病毒本身，似乎都受到了以前的选择性事件的影响35无论如何，朊病毒的获得和丢失似乎构成了一种复杂的边缘机制，允许细胞在不适合其环境的情况下更频繁地探索可遗传的新表型。
迄今为止发现的25种朊病毒中，大多数是RNA结合蛋白、DNA结合蛋白和信号转导蛋白，这些蛋白在控制细胞网络中的信息流中起着关键作用。朊病毒介导的这些功能的改变允许在一个步骤中获得复杂的性状。总之，朊病毒之间的界面、环境压力、隐性遗传变异和固定提供了一种从拉马克人过渡的手段36达尔文突变和自然选择框架的遗传模式。对于Hsp9026朊病毒为环境诱导性状的遗传提供了一条强有力的途径，而环境诱导性状已经从单纯的似是而非转变为可以证明的。
方法
野生菌株的测序
我们测序了两个野生[磅/平方英寸+]菌株（UCD#978和#5672）、临床分离株（YJM653）、葡萄酒菌株（I14）和两个实验室分离株（W303和YDJ25，一个菌株几乎与实验室参考S288C菌株完全同源）。使用Illumina HiSeq平台，我们获得了两条76个碱基对配对读取的通道和一条101个碱基配对读取的路径，平均覆盖率为100倍（所有读取将在NCBI上以注册号PRJNA81619提供）。经过质量控制过滤后，每个基因组与酿酒酵母参考序列（sacCer22008年6月汇编，2011年4月1日从UCSC下载：http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/sacCer2/染色体/)使用BWA对准器39然后使用samtools中的“mpileup”调用引用的SNP和indel40包裹。
然后，我们使用自定义代码和基因组分析工具包（GATK）的组合来估计每对独特基因组之间的遗传距离41对于每个基因组对，我们考虑了两个基因组中SNP的超集：如果一个SNP只存在于一个基因组中，而不存在于另一个基因组中，那么它就会被保留。这两个基因组中存在的SNP被丢弃。我们使用APE R包构造了邻接树42通过使用mpileup所称的质量分数至少为150的保留SNP计数的遗传距离矩阵。中的水平比例尺补充图2代表10000个SNP的遗传距离。为了确保该树对SNP质量截止值的选择不敏感，我们在不同的质量阈值下进行了分析，得到了基本相同的结果。
我们还分别对第35页。只有一个在PrD中有非同义的变化，这个变化不太可能影响Sup35固有的朊病毒倾向。SUP35中横跨核苷酸−338至1102区域的所有多态性如图所示补充表2.
分子克隆
使用了标准的克隆程序14.网关®目的向量的构造如下。这个URA3公司pAG416-GPD-ccdB、pAG416-TEF-ccdB和pAG416-SUP35-ccdB中的ORF14,43用分别从质粒pUG6和pAG32获得G418或潮霉素B抗性的盒替换，以产生pAG41NEO-GPD-ccdB、pAG41NEO-SUP35-ccdB和pAG41HPH-TEF-ccdB。这些质粒含有GPD1、SUP35、，和TEF2型启动子，分别用于驱动外源基因的表达。网关®带有编码序列的条目克隆SUP35、SUP35ΔPrD，HSP104、HSP104KTKT公司,和交通运输部3按照说明建造14使用S288C基因组DNA和质粒热休克蛋白104K218T K620T三作为PCR模板。使用定点突变从交通运输部3条目克隆（Halfmann等人正在准备中）。入口克隆和目的载体在Gateway中重组®反应生成pAG41NEO-GPD-HSP104、pAG41NEO-GPD-HSP104KTKT公司，pAG41NEO-SUP35-SUP35，pAG41NEO-SUP35-SUP35ΔPrD，pAG41HPH-TEF-MOT3和pAG41HPH-TEF-MOT3ΔPrD。
酵母技术
酵母菌株(表S1)从库存中心获得或由指定来源慷慨提供。所有菌株在−80°C条件下以甘油库存的形式储存，并在测试前在YPD上复苏。曾是[磅/平方英寸+]在最初的屏幕中，分别从葡萄栽培和酿酒学系（加州大学戴维斯分校）重新订购，并在第二个SDD-AGE上验证朊病毒状态。除非另有说明，否则酵母在YPD中30°C下生长。在相关情况下，包括以下培养基补充剂：3mM GdHCl、200μg/ml G418或250μg/ml潮霉素B。酵母用标准乙酸锂方案转化，如所述44.
为了化学消除朊病毒，菌株在含有3 mM GdHCl的富培养基上传代四次。为了通过过度表达Hsp104来消除朊病毒，用表达来自强组成启动子（GPD）的Hsp104质粒（WT或K218T，K620T）转化细胞。将转化子在选择性培养基上传代三次，然后在YPD上传代四次，以允许质粒丢失，这可以通过选择性培养基没有生长来证实。最后，由于已知GdHCl会增加小颗粒的频率，所有GdHCl-和Hsp104DN（公称直径）-用于表型试验的固化菌株[磅/平方英寸+], [交通运输部3+]，并对25株含有未知朊病毒的菌株进行分析，以检测其对甘油的呼吸能力。固化和预固化菌株在甘油上生长得相当好。
基于PCR的删除策略45用于替换URA3公司菌株UCD978中含有pAG32中的hphMX4模块。然后对产生的菌株进行孢子化。在含有Hygromycin B的YPD上回收的随机孢子，然后再次产孢。通过在含有5-FOA的培养基上生长，在缺乏尿嘧啶的培养基中不能生长，以及与单倍体测试菌株交配的能力，对来自第二轮产孢的抗Hygromycin孢子虫进行倍性测试。交配类型稳定，表明UCD978为异宗配合。基因组DNA含量由SYTOX测定®所述的绿色染色46，使用BD LSR II流式细胞仪。BY4741和BY4743分别用作单倍体和二倍体参考。
在细胞诱导实验中，我们使用普通实验室菌株W303的衍生物作为细胞质转移的受体(). 该菌株占优势KAR1-15系列等位基因，在交配期间阻止核融合，但允许细胞质转移。该菌株还携带多种营养缺陷标记和线粒体DNA缺陷。这使得在缺乏营养缺陷标记物转移的情况下，通过恢复线粒体呼吸来对细胞质转移进行评分。野生“供体”菌株的单倍体、交配竞争性衍生物是使用抗生素抗性标记来敲除总公司轨迹38（HO会通过导致单倍体细胞自交来阻止交配）。受体和供体菌株在富培养基上拼接在一起，然后在含有甘油作为碳源的脱落培养基上选择异核体。
[注册护士资格+]菌株UCD#664经验证为紫外酵母菌使用寡核苷酸ITS1和ITS4对rDNA内转录间隔区进行集落PCR扩增和测序47.另一个未注释为的含朊病毒菌株酿酒酵母，UCD#587，最初有注释“酿酒酵母比赛巴亚纳斯”。我们从库存中心独立订购了两次这种菌株，发现它是酿酒酵母基于信息技术服务1序列和生长特征。
表型分析
对于琼脂粘附和侵袭分析，允许菌落在30°C下生长5-7天。然后在流水下轻轻冲洗平板，以去除非粘附细胞；然后拍照。然后用戴手套的手指在流水下轻轻摩擦琼脂表面，以去除所有剩余的非侵入性细胞。
为了进行生长测量，将野生酵母菌株一式四份接种到384孔板中，每个孔含有40μL YPD，并在30°C（通常为48小时）的加湿室中培养至饱和。在完全重新悬浮后，使用QRep聚丙烯384孔针复制子（Genetix）将细胞（200-500 nL）复制到两个新的384孔板上。这些新平板每孔含有40μL选择性培养基：使用最终浓度为2%的替代碳源（YP-麦芽糖、YP-半乳糖、YP甘油或YP-仿射糖），溶解在YPD中的化合物（0.5 M NaCl、5%乙醇、0.4 mg/mL 4-NQO、1 mM tBOOH、32 mg/mL氟康唑或50 mM羟基脲），酸性和碱性条件（YPD在pH 4或pH 9下），最后单独在YPD中（作为对照）。在分子生物学级二甲基亚砜（DMSO）中制备4-NQO浓缩储备液（4 mg/mL），在乙醇中制备氟康唑储备液（64 mg/mL）。所有培养板在30°C下培养，盖上盖子并置于加湿室中。大约每20小时通过OD测量一次生长600使用帝肯蓝宝石2读片器（通过轻轻搅拌完全重新悬浮后）。如果所有四个重复都显示出显著的生长变化，则选择点击(P（P）<0.01，通过t检验确定）。
的增长率[磅/平方英寸+]-在用于实验室繁殖的条件下（YPD、酵母马铃薯葡萄糖、YM肉汤、FM肉汤、麦芽汁琼脂或沃勒斯坦营养琼脂），将含有野生菌株（及其固化衍生物）的菌株分成四份，稀释105在含有150μL培养基的湿化96-well板中，每个菌株的指数增长细胞。外径600在平板阅读器（Multiskan Go，Thermo Scientific）中通过搅拌（15 s）再次悬浮后每15分钟测量一次每个孔的厚度。培养板在30°C下培养。四天后，在平板的外孔中没有观察到明显的体积损失，确保我们测量的生长速度不是蒸发的产物。OD曲线的指数相位600与时间的关系可以用来确定生长速度。
基因型相似性和表型相似性之间的相关性在R统计计算软件包中使用已发布的测序菌株之间的基因型相关性和在不同条件下的线性回归进行计算表S1通过表型数据的随机扰动确定显著性。一万个数据的排列并没有显示出基因型-表型相关性偶然发生的同样大的变化。
SDD-AGE公司
除以下所示情况外，SDD-AGE按如下方式进行。将酵母接种到96个圆底块（Nunc P8241）中的1mL YPD中，每个孔包含一个3mm的玻璃珠。用220 rpm搅拌，在30°C下培养18-24小时。细胞在3000 rcf下离心2分钟，再悬浮在200μL水中，然后再次离心。然后向每个孔中添加大约100μl酸洗玻璃珠，然后添加80μl裂解缓冲液（100 mM Tris pH 8，1%Triton X-100，50 mMβ-巯基乙醇，3%HALT蛋白酶抑制剂混合物，30 mM N-乙基马来酰亚胺和12.5 U/mL苯甲酸酶核酸酶）。然后用橡胶垫（编号276002）密封砌块，并在Qiagen Tissuelyzer 2上以最大速度摇晃两次，持续3分钟。然后向每个孔中添加35μL 4X样品缓冲液（2X TAE、20%甘油、8%十二烷基硫酸钠、0.01%溴酚蓝）。然后短暂旋转这些块，让其在室温下孵育3分钟，然后在3000 rcf下离心2分钟，以去除细胞碎片。如所述，对Hybond ECL硝化纤维素进行电泳和毛细管印迹37.
Sup35和Rnq1是使用表征良好的抗体检测的14。通过在探测之前用Re-Blot Plus剥离溶液（Millipore）处理印迹，使用Sup35抗体检测淀粉样蛋白的方法得到了显著改进。可用的酵母朊蛋白Ure2、Swi1和Cyc8抗体不能令人满意地区分含有这些蛋白的淀粉样蛋白和不含这些蛋白的实验室菌株。因此，我们没有尝试在野生菌株中鉴定这些朊病毒。用Lumigen TMA-6化学发光底物（GE）检测HRP结合二级抗体。
为了检测Mot3淀粉样蛋白，如所述制备细胞和裂解物37用六组氨酸抗体（GE Biosciences）检测印迹，该抗体识别Mot3中的内源性六组氨酸基序。通过多次实验[交通运输部3+]S288C遗传背景中的分离物（参考14和R.H.，个人通讯），我们估计在这里使用的条件下，这种抗体的假阴性和假阳性率分别约为40%和5%。我们偶尔观察到[电机3−]菌落（根据SDD-AGE和表型确定）[交通运输部3+]分离物。中的多态性交通运输部325野生菌株生长和成球效率的差异可能会影响SDD-AGE评估Mot3朊病毒状态的有效性。然而，表型差异验证了我们对[交通运输部3+]SDD-AGE鉴定的6株菌株中的3株。
