细胞间的信号传递相互作用协调了驱动侧线形态发生的多种细胞行为

摘要

介绍

理解形态发生的机制基础是发育生物学的一个主要重点。在发育过程中，细胞群自组织成遗传指定的三维几何形状，对组织、器官和生物体的功能至关重要。¹虽然在机械水平上理解这些过程是现代发育生物学的一个极其重要的目标，但由于许多生物结构的复杂几何形状以及所涉及的分子调控机制的冗余和相互依赖性，解释这些机制往往是一个挑战。

在过去十年中，斑马鱼初级后侧线系统已成为一个强有力的模型，用于阐明形态发生的分子机制。这是由于侧线的相对简单的形态和可达性，以及斑马鱼模型对详细遗传实验的适应性。驱动形态发生的细胞行为可以在活体胚胎中直接观察到，并与斑马鱼生物学可用的丰富工具所提供的特定分子扰动相关。

侧线是水生脊椎动物中发现的一种机械传感系统，能够检测水的运动。侧线由玫瑰花状的感觉器官组成，称为神经桅杆，分布在动物的表面。^2，三每一个神经基质都含有一组毛细胞，这些毛细胞与陆地脊椎动物听觉和平衡的毛细胞同源，功能相似。⁴这些毛细胞被包裹在一群支持细胞中。斑马鱼的侧线可以细分为两个主要分支：前侧线和后侧线。前侧线的神经桅覆盖动物头部，后侧线的神经桅分布在躯干上。^三，5，6初级后侧线是沿水平肌间隔发育的第一组神经肥大。在胚胎后发育期间，神经肥大形成的重复波出现在躯干上，使神经肥大均匀分布在成熟动物的表面。^7–9这里回顾的工作与主要后侧线有关，这将被简单地称为“侧线”前侧线的发育仍有待详细研究。

侧线起源于一个由大约100个细胞组成的迁移原基，这些细胞形成于耳泡的正后方，并沿着水平肌隔向后迁移至尾尖(图1A和B).⁷当它迁移时，感觉器官前体，称为原神经节，在原基的尾部形成(图1C). 在迁移过程中，前神经节从迁移原基的尾部（前部）沉积下来，形成一系列五或六个沿着前后轴分布的前神经节(图1D). 此外，原基在前神经桅杆之间沉积一个细胞系，称为中间神经桅杆细胞。在发育后期，这些神经间质肥大细胞会增殖产生额外的神经肥大细胞。⁸

在单独的窗口中打开

图1

侧线胚胎学可视化Tg（-8.0cldnb:lyneGFP）胚胎。（A） 在24 hpf时，原基（星号）已从靠近耳泡（OV）的起源处完全迁移到体节上。（B） 原基最近沉积了第一个前神经节。（C） （A）中的原基放大倍率较高。注意在尾部区域形成玫瑰花结状的前神经节，而在前部区域则没有玫瑰花状的前神经节。（D） 胚胎后侧线由4-6个沿着水平肌间隔排列的前神经节组成。

接近尾端时，原基转向并向腹鳍褶皱迁移，在那里迁移停止，原基分裂成一系列2–3个末端前神经节。⁷发育后期，沉积的前神经肥大成熟为机械感觉神经肥大。斑马鱼后侧线的详细胚胎学已在参考文献中广泛综述^10–12.

最近，侧线形态发生的机制知识迅速扩展。尽管100多年来，侧线的胚胎学一直吸引着生物学家，^13–15直到最近十年，才获得了详细的机械知识。这篇综述将集中于通过细胞间信号传导相互作用的原基模式如何协调驱动侧线形态发生的基本细胞行为。将详细讨论每个单元的行为。我们将描述细胞行为以及它们是如何被基于细胞信号的模式化机制调节的，并讨论未来研究的潜在途径。

原基图案

迁移的原基分为一个前导区，该前导区具有紊乱的“假间充质”外观，后导区包含两个或三个玫瑰花状前神经节(图1C).¹⁶研究表明，这些不同的区域是由涉及Wnt/β-catenin和Fgf信号通路的信号反馈系统形成的。¹⁷Wnt/β-catenin信号在诱导分泌型Fgf配体和膜结合Fgf抑制剂表达的主导区域活跃安全系数(il17号机组^第个).¹⁷Fgf配体可以自由扩散出抑制性先导区，在那里它们可以刺激尾部的信号转导。同时，尾部区域的Fgf信号传导导致dkk1型，Wnt/β-catenin阻遏物。¹⁷这种信号机制的结果是将原基分为两个不同的基因表达域，这里称为先导区和拖尾区。在包含约1/3原基前导区的前导区，Wnt/β-catenin信号传导活跃，Fgf信号传导受到很大抑制。在尾部区域，Fgf信号传导活跃，Wnt/β-catenin信号传导受到很大抑制。¹⁷值得注意的是，尽管基因表达区域化，但在原基中部的这些信号传导活动之间可能存在显著重叠。这个信号反馈系统对协调细胞行为具有重要影响，这些行为驱动侧线的形态发生，如下所述。

最近的一项研究左1突变体得出结论，Wnt/β-catenin信号传导不影响原基模式，基于对左1与吗啉基共同注射的突变体靶向多余作用的tcf7型.⁴⁶然而，这些操作很可能导致Wnt/β-catenin亚形态状态。由于Wnt/β-catenin信号靶基因表达在左1变体和突变体，^37，46，47而Wnt/β-catenin阻遏物诱导后，这些基因在原基中丢失dkk1型或主要阻遏物Δ-变速箱系数.¹⁷因此，吗啉对共表达的Tcf/Lef因子的敲除tcf7型在里面左1通过诱导Wnt/β-catenin信号的完全丢失，突变体导致的表型比报道的要温和dkk1型和Δ-变速箱系数.可能注射的特定tcf7吗啡啉不能废除tcf7型完全翻译，因为研究中没有提供证据。^46，47分析tcf7/lef1双突变体可以帮助澄清这个问题。由于这两种基因的突变现在都可以获得，这项实验触手可及。

原基模式的另一个重要方面涉及Fgf和Delta配体在位于尾部形成前神经节中心的小细胞群中的表达(图2B).^19，20这些“中央细胞”是由一种经典的侧向抑制机制形成的，该机制涉及到Delta配体的表达日益受限。¹⁹ 三角洲中枢细胞的表达对诱导和限制Fgf配体的表达和atoh1a型依赖于前神经节中心细胞的毛细胞规格。^20–22在另一种Fgf配体缺乏的原基中，利用Fgf配基产生细胞的小克隆进行的镶嵌实验表明，来自中央细胞的短程Fgf信号足以诱导毛细胞分化，这意味着来自这些细胞的短距Fgf信号是毛细胞发育中的一个关键事件。²¹

在单独的窗口中打开

图2

（A） 通过Wnt/β-catenin信号维持原基极性。前区表达Wnt/β-catenin靶基因（红色），后区表达Fgf靶基因（绿色）。这两条信号通路在原基的中央部分（黄色）都是活跃的。Wnt/β-catenin信号依赖性sef表达抑制主导区Fgf信号和Fgf依赖性dkk1型表达抑制尾部Wnt/β-catenin信号传导。实线表示遗传相互作用。虚线表示分泌因子的扩散。（B） 原基内玫瑰花结状前神经节中心的细胞表达三角洲和功能梯度滤波器配体（蓝色）。除前缘外，原基的其余部分表示缺口受体（橙色）。的表达式三角洲和功能梯度滤波器通过Delta-Notch介导的侧向抑制，配体仅限于中枢细胞。构成前沿祖细胞池的细胞轮廓为绿色。形成前神经节的细胞轮廓为粉红色。

因此，除了上述Wnt/β-catenin-Fgf信号系统外，中央细胞中Delta和Fgf的表达构成了原基中信号配体的第二个关键来源。这两个信号中心相互作用，作为Fgf信号和Fgf依赖dkk1型在Delta-Notch缺陷的原基中丢失表达，允许Wnt/β-catenin靶基因表达的扩展。²⁰因此，中枢细胞中的Delta-Notch信号对于dkk1型Wnt/β-catenin信号传导至主导区域的表达和限制，可能通过中枢细胞的短程Fgf信号传导。²⁰有趣的是，Wnt/β-catenin靶基因axin2（轴2）也表达于前神经肥大中枢细胞，¹⁷然而，这个表达式的结果仍然未知。很容易推测，Wnt/β-catenin和Fgf信号在发育中的前神经节中以与原基相似的方式相互作用，并且中心细胞中的Fgf配体表达需要这些细胞中的Wnt/？-catenin-信号。为了支持这一假设，当Wnt/β-catenin信号传导被抑制时，Fgf配体的中心细胞表达似乎从原基内最新形成的前神经桅杆中丢失。¹⁷然而，Fgf配体的中心细胞表达维持在即将从原基后缘沉积下来的更成熟的前神经节中，这表明Fgf和Wnt/β-catenin之间的不同相互作用可能存在于成熟的前神经节中（Aman A和Piotrowski T，未发表的观察结果）。这两个重要的原基信号中心，即主导区和前神经肥大中枢细胞之间的详细联系是未来研究的一个重要问题。

通过对原基中存在的细胞-细胞信号模式机制的草图，我们现在将注意力转向该模式如何协调驱动侧线形态发生的基本细胞行为。

集体迁移

也许侧线形态发生背后最显著的细胞行为是细胞的集体迁移。在这个过程中，侧线原基的大约100个细胞沿着水平肌隔一致迁移。由于这种行为，侧线原基已经成为研究脊椎动物系统中集体细胞迁移的分子调控的一个极好的模型。尽管参考文献中对该过程及其法规进行了广泛审查^10，23和²⁴，为完整起见，我们将在此处进行简要讨论。

研究表明，侧线原基的迁移主要取决于趋化因子受体的表达cxcr4b型在原基及其配体的主导区域cxcl12a公司（以前称为sdf1a型)沿着假定的迁移路径。²⁵任何一种分子表达中断的胚胎在细胞集体迁移中表现出严重缺陷。^25，26此外，同源趋化因子配体的异位表达，cxcl12b公司，英寸cxcl12a公司-缺陷胚胎能够引导原基沿着异位迁移路径。²⁶

一秒钟cxcl12a公司受体，cxcr7b型在迁移原基的尾部区域表达。喜欢cxcr4b、cxcr7b是正常的集体迁移所必需的。cxcr7b型吗啉注射导致功能丧失导致原基迁移失败，类似于失去cxcr4b型.^27，28损失cxcr7b型与其他条件下的迁移失败相关，例如Wnt/β-catenin信号在原基中扩张时，^17，21，22在其他细胞迁移的例子中，如原始生殖细胞迁移。²⁹

趋化因子受体在原基中的不对称表达受上述Wnt/β-catenin-Fgf信号系统的调节。具体地说，Wnt/β-catenin信号传导的原基扩展到尾部区域，显示可检测的完全缺失cxcr7b型表达和迁移失败。¹⁷相反，Wnt/β-catenin信号传导的缺失导致cxcr7b型将表达式转换为前导区域。¹⁷有趣的是，虽然Wnt/β-catenin信号通路的缺失会导致cxcr7b型，此扩展尚未完成。极端前缘的几个单元格不表达cxcr7b型在Wnt/β-catenin损失的条件下。

最近有人提出，涉及斑马鱼雌激素受体的第二个信号系统电子自旋共振1调节趋化因子受体在原基中的表达分布。中断电子自旋共振1表达导致cxcl12a公司-的依赖扩展cxcr4b型和下调cxcr7b型表达式。¹⁸这些基因表达的变化与Wnt/β-catenin信号在原基中扩展时趋化因子受体的表达模式非常相似。具体来说，即使cxcr7b型向前缘扩展电子自旋共振1变形体，这个扩展是不完整的。尽管作者排除了电子自旋共振1抑制Wnt/β-catenin信号传导，¹⁸该信号系统是否独立并与Wnt/β-catenin信号系统并行运行，或者Esr1通路是否参与Wnt/α-catenin和Fgf信号系统更复杂的调控网络，还有待测试。在同一胚胎中操纵Esr1信号和Wnt/β-catenin信号将有助于澄清这个问题。

虽然损失了cxcr7b型与集体迁移的失败相关，对于如何cxcr7b型控制细胞在侧线的迁移。有人提出cxcr4b型和cxcr7b型使原基具有内在极性，从而允许跨Cxcl12a蛋白的同质条带迁移。²⁷在这个模型中，后缘的Cxcr7b从细胞外间隙中去除Cxcl12a蛋白的速度比前缘的Cxcr4b更快，从而在原基长度上形成Cxcl12 a的移动梯度。这与Cxcr7b对Cxcl12a具有10倍更高亲和力的分子性质一致。⁴⁸此外，Cxcr7b功能的这种机制最近在迁移的原始生殖细胞（PGCs）中得到证实，其中Cxcr7 b-Cxcl12a结合导致Cxcl12 a蛋白的内化和蛋白质体降解，并建立指导性的Cxcl 12a梯度，引导PGCs朝向假定的性腺。²⁹

然而，镶嵌实验表明，只有原基前缘的少数细胞必须表达cxcr4b型以确定整个组织的迁移方向。¹⁶这一结果表明，前缘细胞和原基其余部分之间可能存在额外的信号。这些信号可能以分泌信号配体或机械转导信号的形式出现。³⁰发现只有少数领导细胞需要表达cxcr4b型因为适当的迁移似乎使人们对以下模型产生了怀疑：趋化因子受体的内在极性是原基定向迁移的基础，因为这种镶嵌原基中央部分的细胞不表达趋化因子感受器，因此不能作为Cxcl12a汇发挥作用。在这种情况下，Cxcl12a蛋白在花叶病原基上不会形成指导性梯度。

最近的一项数学模型研究表明，原基中Cxcr4b受体对Cxcl12a的吸附能够在原基前后产生不同的配体浓度。具体而言，原基的前向迁移，再加上Cxcr4b结合和内化对Cxcl12a的吸附，导致原基后面的Cxcl12 a水平低于原基前面的水平，从而能够维持定向迁移。因此，原基在迁移时会留下较低Cxcl12a浓度的尾流。³¹然而，该模型的前提是趋化因子受体Cxcr4b在原基中均匀表达，因此很难与镶嵌原基正常迁移的能力相一致。在花叶病原基中，只有少数野生型先导细胞表达cxcr4b型，Cxcl12a只会被前缘的少数细胞吸收，从而使配体在原基中央部分附近聚集。目前尚不清楚如此少量的细胞是否能够产生有益的Cxcl12a梯度。此外，该模型目前的形式过于简单，因为它假定在原基中只有一个趋化因子受体起作用。自cxcr7b型拖尾细胞中的表达对原基迁移也至关重要，这个数学模型需要修改。

未来的原基集体细胞迁移实验应旨在了解Cxcr4b和Cxcr7b的分子功能。例如，有人提出Cxcr7b是一种非信号清道夫受体，因此充当Cxcl12a汇。^23，27，29然而，对于原基迁移，这一假设仍有待实验验证。此外，确定是否存在Lecaudey和Gilmour提出的从迁移原基的前缘细胞发出的机械力信号将是非常有趣的。³⁰这些信号可能解释了少量cxcr4b型-阳性细胞可以拯救其他细胞的迁移cxcr4b型缺乏原基。

单元格形状更改

迁移原基的中心作用是沿着动物的躯干形成和分布前神经节。这些原神经节在迁移的原基内产生，并从其后缘沉积下来(图1C). 神经前肥大形成的特征是细胞排列成放射状组织的细胞玫瑰花结。玫瑰花结是由围绕一小群中央细胞的细胞环顶端收缩形成的。^21，22，32这个过程的结果是梨形细胞环，中心细胞从基底移位(图3).^21，22，32中央细胞表达δ和fgf配体，并代表假定的毛细胞祖细胞。^20–22，32

在单独的窗口中打开

图3

根尖收缩形成前神经肥大的假设机制。从前导区发出的Fgf信号刺激功能梯度滤波器和三角洲配体。通过Delta-Notch介导的侧向抑制，这种表达仅限于位于中央的毛细胞祖细胞（HC，蓝色）。来自中央毛细胞祖细胞的Fgf信号可能与支持细胞祖细胞（SC，绿色）中的Fgf受体相互作用，导致皮质肌动蛋白丝（紫色）耗竭和放射状心尖收缩。顶端粘附连接蛋白，如ZO-1和β-连环蛋白（红色）积聚在形成前神经节的中心。形成的前神经肥大细胞被位于中央细胞范围之外的神经肥大间细胞前体细胞（INMC，白色）包围功能梯度滤波器配体，因此不会在顶部收缩（经Hava et al。³²).

前神经肥大细胞的顶端收缩过程与顶端标记物如ZO-1、，^22，32β-连环蛋白^20，32和蛋白激酶c蛋白（PKRC）。³²在玫瑰花结形成期间，这些顶端标记与F-actin一起强烈积聚在收缩的细胞顶端。³²这种顶端收缩需要细胞极性调节器的作用lgl1号机组和lgl2级.³²由于细胞玫瑰花结的形成需要Wnt/β-catenin依赖的Fgf信号，^17，21，22Fgf信号可能直接调节lgl1/lgl2和/或prkci公司.³²然而，这种联系尚待实验验证。重要的是，Wnt/β-catenin-Fgf信号之间的反馈回路将心尖收缩和玫瑰花结形成限制在尾部区域，使得前导区域基本上没有Fgf的信号和前神经节的形成。有趣的是，一项涉及Kaede蛋白光转换的谱系追踪分析实验表明，位于原基前缘的第一排细胞能够在沉积的前神经节中产生细胞，以及新的前导区细胞，表明前导区是持续形成前神经元肥大的祖细胞池。²¹因此，将原基分为拖尾的器官形成区和前导的祖细胞区，对于确保能够产生足够的细胞以沿前后轴产生足够数量的前神经节非常重要。

Matsuda和Chitnis的研究表明，原基中Delta-Notch信号的强烈丢失也会导致前神经元肥大细胞的顶端收缩失败和原基断裂。²⁰这一发现与早期的工作形成对比，早期的工作提出这种形态发生过程独立于Delta-Notch信号传导。^21，22然而，在这些早期的研究中，Delta-Notch信号的减少并不完整。²⁰Matsuda和Chitnis中描述的玫瑰花结形成失败被解释为由于中央细胞Fgf信号的减少，这与其他报告一致，这些报告将Fgf的信号丢失与心尖收缩和玫瑰花团形态发生的失败联系起来。^17，20–22

最近对分离的鸡耳外胚层的研究揭示了Fgf依赖的形态发生信号机制。³³这项研究发现，在鸡耳上皮中，Fgf配体与位于细胞基底面的受体结合。这种Fgf信号机制发生在缺乏Mek1/2磷酸化和蛋白质翻译的情况下；因此，它不涉及导致基因表达的典型Fgf信号。相反，这种信号机制通过肌球蛋白依赖机制导致PKCalpha的膜蓄积和肌动蛋白的基础耗竭，从而将耳蜗外胚层的顶端收缩推进耳廓杯中。³³

探索是否有类似的机制将Fgf信号传导与前神经桅杆的顶端收缩联系起来将是非常有趣的。值得注意的是，Nechiporuk和Raible在马赛克实验中发现，只有少数位于中心位置的Fgf阳性细胞能够挽救原始基中缺乏Fgf配体表达的马赛克动物的心尖收缩和前神经节形成。²¹可以合理地假设，来自中枢细胞的短程Fgf信号能够驱动前神经肥大细胞的形状改变。根据这个假设，中央细胞产生的Fgf作用于位于原基内假定支持细胞中的基底Fgf受体。值得注意的是，发育中的前神经桅杆中产生Fgf配体的中心细胞在基底移位，将其定位为向周围支持细胞的基底发出信号。这些细胞基底部的Fgf受体激活可能导致基底侧肌动蛋白的耗竭，其机制与鸡耳上皮的类似。³³这可能导致假定支持细胞的放射状顶端收缩，从而产生前神经节的玫瑰花结形态(图3). 当然，这只是Fgf信号转导与玫瑰花结形态发生之间联系的众多机制假说之一，可能是前神经肥大中Fgf依赖性心尖收缩是通过与耳上皮不同的机制实现的。

如果上述假设是正确的，由于缺乏极化肌动蛋白耗竭导致心尖收缩失败，Fgf缺乏的原基可能无法形成玫瑰花结。利用操纵的Fgf和Delta-Notch信号对野生型原基和原基中的F-actin、Fgf受体和上皮顶-基底极性机制成分的分布进行详细成像，将有助于评估这一假设。

有趣的是，Fgf信号独立调节毛细胞规格和顶端收缩/玫瑰花结形成。而Fgf信号对神经原基因的表达是必要的原子序数1和感觉毛细胞的规格原子序数1功能不能阻止Fgf依赖性细胞玫瑰花结的形成。^20–22，32因此，Fgf信号通过平行通路控制前神经肥大形态发生和神经发生，类似于Fgf在耳发育过程中的作用。

细胞增殖

细胞增殖对正常的侧线形态发生至关重要。迁移的原基在任何时候都由大约100个细胞组成，而最后的后侧线则由大约300个细胞组成。³⁴通过时间推移分析观察到，在原基中测量的增殖速度能够产生足够的细胞来构成侧线的所有细胞。³⁴这意味着在原基中细胞的生成与原基迁移和沉积前神经节的速度之间必然存在耦合。

2005年，根据一系列BrdU掺入分析，首次对侧线增殖进行了系统分析。³⁵作者描述说，在迁移的原基中，增殖在时间和空间上并不是均匀分布的。相反，BrdU掺入偏向于原基的主导部分。该偏差随沉积循环的阶段而波动。正在沉积前神经节的原基显示，在尾部1/3组织中BrdU掺入频率降低。刚沉积了前神经节的原基没有表现出这种偏见。³⁵然而，作者没有考虑到原基的长度随沉积周期而波动。

最近的工作揭示了原基内增殖的时空模式的机制基础。操纵Wnt/β-catenin和Fgf信号通路表明，这些信号活动是原基增殖的关键调节器。³⁶由于这些信号通路之间存在反馈，因此设计了实验来测试各个信号通路的作用。结果表明，Wnt/β-catenin和Fgf信号通路对原基正常增殖率是必要的。³⁶这一发现为之前报道的扩散中的空间和时间偏差提供了解释。这些通路在原基的前导和中央部分重叠的区域大小保持不变，尽管原基的大小随着前神经节的沉积而波动。³⁶因此，之前观察到的即将沉积的尾部前神经元肥大细胞增殖减少与Wnt/β-catenin和Fgf信号共表达域外的细胞相关。

对原基细胞增殖的分析表明，有一个模型可以解释前神经节肥大沉积的速率。³⁶该模型的关键在于上述发现，由于增殖，原基不断伸长，原基中央的细胞逐渐向后缘移位。最终，细胞将被完全移出Wnt/β-catenin和Fgf重合的区域，并进入静止状态。由于转移到尾部区域的细胞不再接收Wnt/β-catenin信号，因此它们表现出与原基中其余细胞不同的基因表达谱。例如，这些细胞表达趋化因子受体cxcr7b型并下调cxcr4b型占据该区域的细胞速度减慢，并从原基沉积下来。^17，27，28沉积后，原基变短，所有细胞都位于增殖区内，Wnt/β-catenin和Fgf信号传导活跃，直到有足够数量的细胞积累以重复周期(图4). 为了支持这个想法，cxcr7b型无论沉积周期的阶段和原基的长度如何，表达开始于距原基前缘一定距离处。因此，cxcr7b型是原基末端沉积域的标记。³⁶

在单独的窗口中打开

图4

周期性前神经节沉积的增殖依赖性原基延长模型。领先区（绿色）的增殖将细胞转移到沉积区（蓝色），在那里细胞开始减速并从原基沉积。当整个前神经桅杆移位到沉积区时，它就会沉积。这导致原基缩短（中部）。增殖继续，另一个前神经节细胞移位到沉积区，循环重复（经Aman等人许可复制）。³⁶).

“伸长依赖性沉积模型”预测Wnt/β-catenin-free拖尾区域内的细胞将表达前神经节细胞沉积所必需的基因。这些基因可能会抑制拖尾细胞的迁移能力，增加拖尾细胞与局部底物之间的粘附，或减少拖尾细胞和原基剩余部分之间的粘附。当然，这些并非相互排斥的可能性，这些细胞活动的某些组合可能代表了前神经节沉积的细胞机制。

增殖率决定前神经节细胞沉积率的最初证据来自两类实验。首先，用增殖抑制药物处理胚胎直接降低了增殖率。这种处理导致沉积数量减少、间距更大的前神经节，而不影响迁移速度或沉积的前神经节炎的大小。³⁶在第二行实验中，分析了凋亡率升高的胚胎。与抑制增殖的胚胎类似，这些原基产生了间距更大的前神经节。³⁶综上所述，这些结果表明神经肥大沉积频率与细胞在原基内的添加速率紧密耦合。

对凋亡增加的胚胎侧线发育的分析也提出了一个关于未来侧线研究的关键警告。注射吗啉反义核苷酸来破坏基因功能经常会提高细胞凋亡水平。⁴⁰由于细胞凋亡水平的增加导致前神经节沉积减少，因此，为了评估侧线发育的分子机制，必须很好地控制吗啉注射实验，以了解其对细胞凋亡和细胞周期的影响。一些报告依赖吗啉注射实验来阐明调节前神经肥大沉积的分子机制，而没有测试对细胞死亡的可能影响。^41–43根据这些最近的发现，这些功能研究应该重新检查。

增殖依赖性前神经肥大沉积模型随后通过数学模型研究得到了加强。在本研究中，原基被建模为在Cxcl12a蛋白的均质条带上移动的弹性杆。随着杆状体的生长，由于原基前部和中部的细胞吸收Cxcl12a，后缘的细胞接触到的Cxcl12α越来越少。最终，原基达到一个临界长度，即后缘的细胞不再暴露在足够的Cxcl12a中，无法迁移，它们从原基沉积下来。³¹

Wnt/β-catenin信号传导的有丝分裂作用的其他实验证据最近通过对左1变体和突变体。^37，46，47 左1是一种TCF/LEF类转录因子，在Wnt/β-catenin信号下游发挥作用。^38，39在左1变体和突变体，BrdU掺入频率相对于对照胚胎降低。^37，46，47分析左1突变胚胎导致了一种微妙而独特的前神经节细胞沉积模式。⁴⁷该模型假设增殖决定了迁移原基内形成新的前神经节所需的时间长度。当前神经节细胞积累足够数量的细胞时，它会从原基的后缘沉积下来。可以进行一些实验来区分这两种可能性。首先，如果前神经节成熟/生长而非前神经节移位是由细胞增殖介导的，那么抑制正常的增殖速度将有望产生含有较少前神经节的原基。相反，如果增殖对于原神经节的形成并不是必需的，而是为了原基的伸长，那么每个原基的平均原神经节数量将与未处理的原基相同。因此，应分析增殖率降低的原基的前神经节细胞数。第二，细胞增殖驱动前神经节形成速率的假设可以通过时间扫描显微镜观察原基中前神经节花环的形成来验证。前神经节形成模型预测，在增殖不足的胚胎中，形成前神经节花环的平均时间将更长，而长度依赖性沉积模型预测，前神经节将以正常速度形成，然后平均需要更长的时间通过原基并沉积。

对含有三个前神经肥大的野生型原基中细胞数量的分析提出了前神经肥大沉积的神经基质成熟/生长模型的问题（未发表的数据）。该分析是通过计算DAPI标记的单个前神经元肥大玫瑰花结中的细胞核进行的Tg（-8.0cldnb；lynEGFP）胚胎中，用膜定位GFP荧光标记原基细胞，从而识别单个前神经节玫瑰花结。该分析表明，即将沉积的尾部前神经节与紧邻其后的前神经节之间的细胞数量没有显著差异。这些前神经节在细胞数量上没有显著差异，但只有尾部前神经节炎会沉积。这反驳了一种模型，即前神经节肥大的增加会触发前神经节的沉积。

的比较左1突变体和全球增殖不足原基揭示了一些有趣的差异。在使用一般增殖抑制剂治疗的胚胎中，前神经节细胞沉积速度较慢，并且由此产生的前神经节在彼此之间的距离大于wt。^36，47相反，在左1突变的原基，原神经节沉积发生得更快，尽管原基迁移速度相似，因此原神经节比wt更靠近。^46，47这种差异的一个原因是左1突变原基在原基的前导区有特异性的增殖减少，而在原基中部没有。这导致先导区祖细胞的早期耗竭。^46，47此外左1突变体胚胎无法维持祖细胞的特性，被招募到原神经节的比率高于wt原基。⁴⁶伸长率依赖性沉积模型预测，前神经元肥大沉积区和原基前缘之间的距离对Wnt/β-catenin信号强度的降低很敏感。这与发现一致cxcr7b型Wnt/β-catenin单一化抑制了沉积带的标志。³⁶因此，通过去除单个的标准立方英尺/平方英尺由于失去抑制作用，该因素将导致沉积区向原基前缘扩展。尽管沉积带标记cxcr7b型仍然局限于拖尾组织左1突变体，^46，47需要进行详细测量，以确定该区域是否延伸到更靠近前缘的位置左1突变体。Wnt/β-catenin结构域缩短和沉积结构域移位的结果是，将前神经节置换到该区域所需的细胞分裂更少，因此前神经节将沉积得更紧密。同时，未能更新左1突变体导致细胞耗竭、原基早期阻滞和断裂。^46，47

这与Valdivia等人得出的结论一致左1前缘减小，在前缘区产生的“假设因子”的强度减小。有趣的是，可以推测，假设的“假设因子”是Wnt配体，负责驱动原基中Wnt/β-catenin单链信号传导。在这种情况下，减少前导区将导致Wnt配体浓度降低，从而减少Wnt配子进入尾随区的范围。反过来，这将加剧沉积带向领先区域的扩张。通过分析Wnt/β-catenin靶基因的表达模式，进一步证明了起始区域是原基中Wnt配体的来源，例如左1，轴2和成纤维细胞生长因子3这些基因在前沿表现出最强的分级表达模式，与Wnt配体的前沿来源一致。^17，46，47建立Wnt配体的特性和表达模式将非常有趣。

差异细胞粘附

虽然原基在迁移过程中保持着显著的内聚性，但前神经肥大细胞周期性沉积，而神经肥大间细胞则从后缘持续沉积。因此，原基细胞间细胞粘附的动态调节对侧线形态发生至关重要。侧线形态发生过程中的差异粘附是一个很大程度上尚未探索的研究领域。尚待解释的机制联系是：原核内原神经肥大玫瑰花结细胞之间的差异粘附，以及与持续沉积的神经间肥大细胞之间缺乏粘附。^8，32此外，为了全面了解周期性前神经节细胞沉积，我们需要描述黏附分子在原基前导区和沉积区的差异调节。

到目前为止，在发展中的侧线中，只有很少的粘附分子被描述出来。n-钙粘蛋白(cdh-2型)在原基中表达，但对原基迁移或原神经节的形成和沉积似乎没有必要。⁴³有趣的是，原位杂交n-钙粘蛋白显示原基外围细胞和位于前神经节之间的细胞中的表达减少。^20，43由于这些细胞可能代表假定的神经间肥大细胞，³²这个表达表明n-钙粘蛋白在这些细胞中，可能有助于神经间质肥大细胞的持续沉积。

While期间n-钙粘蛋白吗啉注射实验的破坏不会导致迁移失败或前神经肥大细胞沉积，也没有研究中间神经肥大细胞沉积。⁴³虽然这项研究检测到沉积的前神经节细胞数量减少，但这种减少在吗啉啉毒性预期的正常范围内，因此应重新检查。³⁶详细的时间推移分析n-钙粘蛋白缺陷胚胎有助于评估神经间质肥大细胞沉积的可能缺陷。

e-钙粘蛋白(cdh1型)，在整个原基中表达，但在外围细胞中表达更强烈。^20，44 e-钙粘蛋白原位杂交显示Delta-Notch缺陷胚胎的表达下调。损失e-钙粘蛋白这种情况下的表达与原基和前神经桅杆的断裂有关，这表明e-钙粘蛋白在原始凝聚力中。²⁰有趣的是，e-钙粘蛋白Delta-Notch缺陷胚胎中的表达通过原子序数1击倒反过来又可以拯救原基内原神经节的凝聚力，但不能拯救沉积的原神经节。²⁰这一发现表明原子序数1-依赖性粘附分子是沉积的前神经节凝聚力所必需的。²⁰的作用e-钙粘蛋白在侧线期间，形态发生仍需进行功能测试。

人们很容易猜测，中枢细胞Fgf信号可能参与调节原发性神经炎与周围细胞之间的差异粘附。例如，可能存在一组由中央细胞发出的Fgf信号调节的特异粘附分子，负责前神经肥大细胞的凝聚力。假定的神经间肥大细胞可能不受这些配体的影响，因此表达一组不同的粘附分子，并且不能很好地粘附到前神经肥大细胞上。^20，32从公布的数据中可以得出的最简单的假设是n-钙粘蛋白-积极的，e-钙粘蛋白-阴性的中间神经肥大细胞彼此紧密结合，而与e-钙粘蛋白-阴性，n-钙粘蛋白-阳性前神经肥大细胞(图5). 由于前中间神经肥大细胞位于原基的外围以及原基内的前神经肥大之间，因此随着原基的迁移，这些细胞可以自由地持续沉积。评估这一假设需要对原基中的钙粘蛋白进行功能性操作。附加的粘附分子可能在原基中发挥着重要作用，这些作用尚未被发现。总的来说，对原基内细胞粘附的研究是一个相对未被探索的途径，它很可能在未来对侧线形态发生产生重大的见解。

在单独的窗口中打开

图5

经典钙粘蛋白在原基中的分布。e-钙粘蛋白（蓝色）在原基中广泛表达，但在前导区和前神经元肥大中心细胞中下调。n-钙粘蛋白（橙色）在顶部收缩的前神经肥大细胞和前神经肥厚中央细胞中表达。原基周边和原基内原神经节之间的细胞表达e-钙粘蛋白但不是n-钙粘蛋白并代表推定的中间肥大细胞（经Matsuda和Chitnis许可改编²⁰).

在周期性前神经节沉积过程中，前神经节与其余原基之间的差异粘附起着至关重要的作用。与神经间肥大细胞不同，只有当整个前神经肥大细胞移位到沉积区时，前神经肥厚细胞才会沉积，从而导致周期性沉积。此外，只有最后一个前神经节与其余的原基失去联系，可能是因为在Wnt/β-catenin自由沉积区，粘附受到不同的调节。Wnt/β-catenin游离拖尾区中粘附分子的差异表达可能会导致该区域的细胞与潜在细胞外基质的粘附性增加，这可能是由于整合素受体的表达或活性增加所致。值得研究的是，这种细胞外基质粘附分子是否在原基中表达，并通过Wnt/β-catenin信号传导在主导区域受到抑制。如果前神经节与前导区和沉积区原基细胞的差异粘附确实受到Wnt/β-catenin信号的调节，这将进一步证明Wnt/α-catenin信号在调节侧线形态发生的多个方面中起着中心作用。在这种情况下，Wnt/β-catenin信号转导将调节趋化因子依赖性细胞迁移、Fgf依赖性心尖收缩/玫瑰花结形成、细胞增殖以及细胞间粘附。

见解

尽管在理解侧线形态发生方面取得了很大进展，但仍有许多工作要做。既然我们已经了解了基于细胞吞噬的原基模式和驱动侧线形态发生的基本细胞行为之间的基本联系，那么我们就可以在更深入、更机械的层面上理解这些联系。例如，已有研究表明，Wnt/β-catenin和Fgf信号一起需要来驱动原基内的增殖。³⁶然而，对于这种共同需求背后的下游分子效应知之甚少。

由于Wnt/β-catenin和Fgf信号调节迁移、原神经节的形成和原基内的细胞增殖，这些信号相互作用提供了协调这些关键形态发生细胞行为的优雅机制。用一个共同的上游模式系统调节所有这些细胞行为是在侧线形态发生期间协调这些活动的一种优雅方式，以确保机械感觉器官的正确数量和间距。通过多效性模式机制对细胞行为进行的这种协调很可能代表了形态发生的一个共同方面，其中共同的上游信号系统在空间和时间上影响许多细胞行为。然而，具有比侧线更复杂形态的结构可能需要更复杂的图案机制，以便对更广泛的细胞行为进行更精细的控制和协调。

上述的这种耦合细胞行为机制也为推测胚胎侧线的进化变化提供了新的途径。不同种类的水生脊椎动物的初级前神经节数量差异很大。⁴⁵上述模型可用于推导有关这些差异的一些机械预测。例如，有人可以假设，初级前神经节数量多于斑马鱼的动物可能在原基内有更高的增殖率和/或更慢的迁移率。相反，与斑马鱼相比，前神经节较少的动物可能具有较少增殖和/或更快迁移的原基。一个复杂的因素可能是，不同物种的前神经节大小也可能不同。原基内调节前神经节大小的机制尚不清楚。

尽管横向系系统的使用已被证明对于研究集体细胞迁移是非常有效的，^7，25侧线也成为研究上皮形态发生的一个非常有效的模型。^20–22，32侧线系统用于此类研究的优点是，在活体胚胎中，上皮细胞形状变化的分子调控很容易受到干扰和分析。^{17，20–22，32}为了进一步研究这一领域，必须克服的一个挑战是许多基本上皮形态发生蛋白的早期需求。然而，随着分子遗传学工具的日益成熟和镶嵌斑马鱼胚胎的容易产生，这些挑战远非不可逾越。

总的来说，我们正进入一个激动人心的时刻，届时将有可能进行越来越详细的分析。现在，原基模式的一般规则和侧线形态发生的细胞基础已经成为焦点，我们将能够解决形态发生的越来越详细的方面。从这些研究中获得的一些经验教训有望阐明生物学的其他不同领域，因为协调基本细胞行为，如增殖、迁移和细胞形态，是大多数发育事件的共同特征。

工具书类