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公共科学图书馆一号。2012; 7（2）：e30852。
2012年2月8日在线发布。 doi（操作界面）：10.1371/日记本.0030852
预防性维修识别码：项目经理3275569
PMID：22347406

抑制性受体在人CD8 T细胞中的扩展共表达依赖于分化、抗原特异性和解剖定位

卢卡斯·拜奇,#1 阿曼丁·莱加特,#1 莱蒂西娅·巴巴,1 西尔维娅·富尔特斯·马拉科,1 Jean-Paul竞争对手,2 佩特拉·鲍姆盖特纳,1 塞琳·克里斯蒂安森·朱赫特,1 哈尼法·布佐伦,2 多纳塔·里莫尔迪,1 汉斯彼得·皮尔彻,三 纳塔莉·鲁弗,1,2 莫里斯·马特,2 奥利维尔·米奇林,1,2和丹尼尔·E·斯派塞1,4,*
Hossam M.Ashour，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

抑制性受体介导CD8 T细胞对癌症和传染病的低反应性。PD-1和CTLA-4已被广泛研究，阻断抗体已显示出对癌症患者的临床益处。关于抑制性受体及其配体的广泛共表达，我们知之甚少。在这里，我们分析了肿瘤抗原特异性CD8 T细胞的八种抑制受体的表达。我们发现，大多数效应T细胞同时表达四种或四种以上的抑制性受体BTLA、TIM-3、LAG-3、KRLG-1、2B4、CD160、PD-1和CTLA-4。主要差异取决于T细胞的抗原特异性、分化和解剖定位。另一方面，原始T细胞仅对BTLA和TIM-3呈单或双阳性。扩展的共表达可能与效应T细胞有关，因为我们发现多个配体在黑色素瘤患者的转移性病变中的表达。总之，我们的数据表明，原始T细胞主要由BTLA和TIM-3调节，而效应细胞通过大量抑制性受体相互作用。同时或依次阻断多个抑制性受体可能会改善基于T细胞的治疗，但还需要进一步研究来阐明每个受体-受体对的作用。

介绍

激活后，T细胞上调数百个基因，这些基因是效应和记忆T细胞正常增殖、分化和功能所必需的[1],[2],[3]与激活受体和途径平行，T细胞也表达几种抑制受体[4],[5]这些受体介导T细胞低反应性，因此在防止T细胞过度激活、免疫病理学和自身免疫，以及对癌细胞的破坏方面发挥着中心作用[6],[7],[8]一般来说，这些受体随着进行性T细胞分化而上调，但BTLA除外，BTLA在幼稚细胞中含量高，但在记忆和效应细胞中下调[9],[10]治疗性阻断抑制性受体（例如通过使用抗体）可以增强T细胞功能[11]当两个抑制性受体同时被阻断时，这种现象更加明显[8],[12],[13],[14],[15],[16]阻断单个抑制性受体现已成为治疗癌症患者的一种新方法。2011年3月，FDA批准了用于黑色素瘤患者的单克隆抗CTLA-4抗体Ipilimumab[17],[18],[19]另一种抗CTLA-4抗体（Tremilimumab）[20]抗PD-1抗体正在临床开发中[21].

已分别研究了几种进一步的抑制受体（CD160、KLRG-1、TIM-3、2B4、BTLA和LAG-3[9],[22],[23],[24],[25],[26]相反，他们在癌症患者中的共同表达尚未得到更详细的研究。多种抑制性受体参与了T细胞衰竭的诱导，这是一种慢性病毒感染中常见的T细胞低反应状态[5],[8],[11],[27]。我们最近发现黑色素瘤转移中功能性T细胞缺乏与衰竭T细胞的基因表达特征有关[1]与慢性/持久性病毒感染非常相似[4]据此，癌症患者的抑制受体表达增强[28],[29].

在这里，我们通过分析肿瘤抗原特异性CD8 T细胞上的八个抑制受体来确定表达模式。我们发现，除了BTLA和TIM-3外，这些受体大多在原始T细胞上检测不到，但在启动和分化后上调。此外，我们发现从黑色素瘤转移瘤中分离出来后直接分析的CD8 T细胞中的抑制性受体表达模式发生了改变。同时，我们研究了这些抑制受体的配体，发现其中许多配体由黑色素瘤细胞和/或肿瘤基质表达。数据表明，肿瘤特异性CD8 T细胞的抑制是由多种抑制受体介导的，并取决于T细胞的抗原特异性、分化和解剖定位。

材料和方法

道德声明

临床研究是根据相关监管标准设计和进行的，并得到洛桑大学伦理委员会和瑞士医学会的批准。在患者书面知情同意的情况下获取血液和组织。

临床试验

疫苗接种是在路德维希癌症研究所连续三次临床试验的背景下进行的[30],[31],[32]采用相似的研究设计，采用相同的治疗方案和主要终点，即诱导肿瘤特异性T细胞反应。HLA-A*0201型+III/IV期转移性黑色素瘤患者每月接受多次低剂量皮下接种，接种100µg Melan-A/MART-1肽，并添加或不添加CpG-ODN（500µg寡核苷酸PF-3512676/7909；由美国辉瑞/科利制药集团提供），在300–600µl IFA（不完全弗氏佐剂，即。Montanide ISA-51由法国Seppic提供），如前所述[30],[32]或在含有或不含CpG-ODN的IFA中乳化的3倍500µg肽（NY-ESO-1、MAGE-A10和Melan-A）[31].

血液和淋巴结细胞

外周血取自患者和A2+瑞士洛桑大学输血中心的健康献血者。黑色素瘤患者在接种7±2次疫苗后获得转移淋巴结，最后一次平均接种时间为手术前79天。将手术标本切碎后，制备肿瘤浸润淋巴结（TILN）的T细胞。使用Lymphoprep（Axis Shieldy）通过密度梯度纯化单核细胞，并立即在补充有40%FCS和10%DMSO的RPMI 1640中冷冻保存。

流式细胞术

直接体外分析细胞，即无需事先培养。使用A2/EBV BMLF1对细胞进行染色280–288（GLCTLVAML）四聚体，A2/CMV pp65495–503（NLVPMVATV）四聚体，A2/Melan-A/MART-126–35A27L（ELAGIGILTV）四聚体，A2/NY-ESO-1157–165（SLLMWIITQA）四聚体和A2/MAGE-A10254–262（GLYDGMEHL）四聚体。Melan-A特异性四聚体用APC-eFluor®780（eBioscience）标记，EBV-和NY-ESO-1特异性四分体用PE-TexasRed（BD Pharmingen）标记，CMV-和MAGE-A10特异性四聚体用APC-eFluoro®780和PE-Texas Red标记，以便对单个样本中三个表位的T细胞特异性进行单独分析。如前所述对抑制受体进行染色[1]简单地说，用CD8-PacificBlue、CCR7-PC7、CD45RA-APC-A700特异性抗体和“染色1”的四个抑制受体，即KLRG-1-A488（由H.Pircher提供）、TIM-3-PE（R&D Systems）、PD-1-PerCP-eFl710（eBioscience），对磁性富集的CD8 T细胞（Invitrogen，纯度>95%）进行表面染色和CD160-A647（eBioscience），或用于“染色2”的三种抑制受体，即LAG-3-FITC（Alexis Biochemicals）、BTLA-PE（BD）和2B4-PE-Cy5（BioLegend）。细胞在室温（1%甲醛缓冲液）下固定30分钟后，用CTLA-4-APC（BD）在含有0.1%皂苷的FACS缓冲液中完成染色2。使用LIVE/DEAD-Fixable-Aqua（Invitrogen）作为死亡细胞排除标记，并使用适当的同型对照来定义阴性人群。由于可用细胞数量的限制，并不是所有样品都可以通过染色1和染色2进行分析。选通策略如所示图S1ACD8的磁性富集+此外，在CD8上仔细设置门控+这些细胞可以将NK和NKT细胞等其他细胞群的污染降至最低。

黑色素瘤细胞系如所述生成[33]在添加10%FCS的RPMI 1640培养基中生长。使用CD48-FITC（BioLegend）、CD80-PE-Cy7（BD）、CD86-APC-Alexa700（BD。此外，使用PE偶联的半乳糖凝集素-9特异性抗体（BioLegend）进行细胞内染色。

数据通过Gallios流式细胞仪（Beckman Coulter）获得，并使用FlowJo 9.1（TreeStar）进行分析。利用5.2版SPICE软件对抑制性受体的共表达进行分析[34].

免疫组织化学

切割连续的石蜡切片（4µM厚），并将其安装在静电预充电的载玻片（Superfrost Plus，Menzel Gläser）上。切片在二甲苯中脱蜡，并通过分级醇进行再水化。内源性过氧化物酶淬火后（0.3%H2O（运行）2在蒸馏水中煮5分钟），通过将切片在1 mM EDTA溶液（pH 9.0）中的高压锅中煮3分钟来回收抗原。组织切片在RT下与HLA-class II（Novus Biologicals）、CD80（Novus Biologicales）、CD86（Novus-Biologicals），CD273（Atlas Antibodies）、CD48（Abnova）、galectin-9（R&D Systems）或HVEM（Alexis Biochemicals）特异性抗体孵育1小时。清洗后，组织切片在RT下与辣根过氧化物酶结合的抗鼠、抗鼠或抗羊IgG（Dako）和二氨基联苯胺（达科）孵育30分钟。最后，用苏木精对切片进行复染，并通过分级醇和二甲苯脱水。HVEM的免疫组织学数据已发表在参考文献中。[9]并在此处显示以完成。

统计计算

使用该程序进行了层次聚类和主成分分析（PCA）R（右）版本2.13.0。对于定量比较，除非另有说明，否则使用Prism 5.0进行Student’s t检验（双样本双尾比较）或使用Tukey后验进行单向方差分析（多样本比较）。使用SPICE 5.2软件计算的10000个排列对共表达饼图进行了比较。p<0.05被认为是显著的（*=p<0.05** = p＜0.01*** = p<0.001；ns=不显著）。

结果

抑制性受体随着CD8 T细胞分化而上调

通过流式细胞术，我们根据T细胞分化状态分析了八种抑制性受体CD160、KLRG-1、PD-1、TIM-3（“染色1”）和2B4、BTLA、CTLA-4和LAG-3（“着色2”）的共同表达。用这些抑制受体以及CD8、CD45RA和CCR7特异性抗体对外周血单个核细胞（PBMC）进行染色。我们选通了CD8原始（N）、中央记忆（CM）、效应记忆（EM）和效应记忆CD45RA+CCR7和CD45RA表达定义的（EMRA）细胞( 图1A ). 幼稚细胞通常BTLA阳性，其中许多也表达TIM-3( 图1B 和S1B级). 所有其他抑制性受体随着分化进行而上调。虽然EMRA细胞经常对2B4、KLRG-1和CD160呈阳性，但它们表达的PD-1和BTLA少于EM细胞。在CD8 T细胞的所有亚群中，LAG-3和CTLA-4的表达水平都很低。对抑制性受体共表达模式的分析表明，不仅抑制性受体的总表达频率随着分化而增加，而且多种抑制性受体共同表达的变异性也增加( 图1C ). 虽然只有极少数量的N细胞和CM细胞共同表达2到4个抑制性受体CD160、KLRG-1、PD-1和TIM-3（染色1），但大约一半的EM细胞和四分之三的EMRA细胞都表达了抑制性受体( 图1C ，上部面板). PD-1和TIM-3的共表达仅在一小部分EM细胞中观察到，而TIM-3和CD160的共表达只在EMRA细胞中存在。染色2（2B4、BTLA、CTLA-4和LAG-3）的图片略有不同( 图1C ，下部面板). 在EM细胞中观察到这些抑制受体的共同表达百分比最高，约50%的细胞对2B4和BTLA呈阳性。虽然在原始细胞中BTLA经常单独表达，但它在EM和EMRA细胞中几乎只与2B4一起表达。

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分化抑制受体的表达谱。

（A） CD8 T细胞亚群的定义取决于CCR7和CD45RA的表达，即朴素（N）、中央记忆（CM）、效应记忆（EM）和效应记忆RA+（EMRA）细胞。用于抑制受体分析的门显示在四个象限中。（B） 与分化状态相关的抑制性受体表达的平均值。单个值如所示图S1B对于“染色1”（KLRG-1、TIM-3、PD-1和CD160），n=31；n=21，用于“染色2”（LAG-3、BTLA、2B4和CTLA-4）；染色1的四个样本来自健康献血者，其余样本来自黑色素瘤患者。（C） KLRG-1、TIM-3、PD-1和CD160（染色1）以及LAG-3、BTLA、2B4和CTLA-4（染色2）的共同表达。饼图弧线的颜色表示单个抑制受体的表达，而饼图中的颜色表示共同表达的抑制受体的数量。排列测试的p值显示在相应饼图旁边的表中。用SPICE 5.2分析共表达。

总的来说，这些数据表明抑制性受体随着分化而逐渐上调，BTLA和TIM-3除外。这种表达模式与最近一份研究2B4、KLRG-1、CD160和PD-1以及CD127和CD27在HCV特异性CD8 T细胞上的表达的报告一致[5].

肿瘤特异性T细胞抑制受体的共表达受疫苗接种的影响

尽管它们处于幼稚状态，但使用健康供体PBMC中的四聚体可以在体外检测到Melan-A特异性T细胞[35]在黑色素瘤患者中，这些T细胞的频率偶尔随着疾病进展和/或在没有CpG-ODN的情况下接种疫苗后增加。与此形成鲜明对比的是，当CpG-ODN用作疫苗佐剂时，几乎所有患者的T细胞频率都显著增加[32]我们之前已经证明疫苗接种类型会影响BTLA的表达[9]接种疫苗后肿瘤特异性T细胞表达多种抑制受体[1]为了研究特异性抑制受体的表达模式，我们首先将来自健康供体的未分化黑色素A特异性细胞与未分化T细胞总数进行了比较( 图1C 和 2安培 ). 除BTLA和TIM-3外，来自健康供体的大多数黑色素A特异性T细胞不表达抑制性受体。因此，它们与总的原始T细胞非常相似( 图1C 和 2安培 ). 此外，接种前黑色素瘤患者的黑色素A特异性T细胞也与健康献血者的总原始T细胞和黑色素A特异性T细胞非常相似( 图2A ). 这可能是因为在黑色素瘤患者中，自发激活的细胞通常很少，并且只有微弱的激活[30].

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通过Melan-A特异性CD8 T细胞抑制受体表达取决于疫苗接种。

（A） Melan-A特异性CD8 T细胞共表达KLRG-1、TIM-3、PD-1和CD160，以及LAG-3、BTLA、2B4和CTLA-4。使用磁珠富集来自健康献血者（HD）或患者的血液样本，以检测CD8 T细胞。通过CD8特异性抗体和四聚体染色鉴定黑色素A特异性CD8 T细胞。抑制性受体的阳性率分别定义为同型对照。对于HD，n=4；n=3表示真空前。；n=9表示接种后不含CpG-ODN，n=11表示接种后含CpG-ODN。饼图弧线的颜色表示单个抑制受体的表达，而饼图中的颜色表示共同表达的抑制受体的数量。用SPICE 5.2分析共表达。排列测试的p值显示在相应饼图旁边的表格中。（B） 基于A中显示的八个抑制性受体的共表达数据的层次聚类，包括CD8 T细胞总数的四个分化亚群（N、CM、EM、EMRA）。（C） 接种疫苗后，黑色素A特异性T细胞上四种抑制性受体的平均表达和SD上调。未接种疫苗（无疫苗接种）组的HD和患者接种前的数据汇总。n=7（无真空）。；n=9，用于接种CpG-ODN。

随后，我们将抑制性受体分析扩展到接种Melan-A肽后的患者，在疫苗配方中添加或不添加CpG-ODN 7909( 图2A 和S2系列)，并将数据与其他两种情况进行比较，即接种疫苗前的健康献血者和黑色素瘤患者。有趣的是，接种疫苗后，尤其是接种CpG-ODN后，Melan-A特异性T细胞上的四种受体KLRG-1、TIM-3、PD-1和2B4均显著上调。相反，如前所述，BTLA表达显著下调[9]最后，CD160、LAG-3和CTLA-4以非常低的水平表达，在四种条件之间没有显著差异。关于同时共表达，当CpG-ODN用于疫苗接种时，与“不使用CpG-ODN”相比，Melan-A特异性细胞对两个或更多抑制性受体的阳性率更高。尤其是接种CpG-ODN后，KLRG-1、PD-1和TIM-3的三重阳性人群占所有Melan-A特异性T细胞的30%以上。尽管技术问题使我们无法调查一侧KLRG-1、PD-1和TIM-3（染色1），另一侧2B4和BTLA（染色2。

为了证实这些观察结果，基于八种抑制性受体共同表达的层次聚类表明，来自健康献血者或接种疫苗前患者的Melan-A特异性T细胞与原始CD8 T细胞（N）总库密切相关，接种后，Melan-A特异性T细胞与EM和EMRA细胞相似( 图2B ). KLRG-1、TIM-3、PD-1和2B4的强烈上调( 图2C )和伴随的BTLA下调(图S2)在接种后观察到，特别是当CpG-ODN用作佐剂时，强调接种可能对抑制性受体表达产生深远影响。

Melan-A特异性T细胞的抑制性受体表达模式与其他自身特异性T淋巴细胞相似，但与病毒特异性T-细胞不同

我们最近报道了[1]与病毒特异性T细胞相比，黑色素A特异性T淋巴细胞表达不同形式的抑制受体。在这里，我们通过包括BTLA扩展了这一分析(图S3A)以及研究Melan-A-、CMV-和EBV-特异性T细胞的共同表达模式。我们观察到，所有三个抗原特异性T细胞群与EM和EMRA细胞的相似性大于N和CM细胞。然而，肿瘤特异性T细胞与EM和EMRA细胞相比，在层次聚类中与病毒特异性细胞的差异更大(图S3B)在主成分分析中(图S3C). 黑色素A特异性细胞的这种中间位置主要是由于其TIM-3的表达和CD160的实际缺失(图S3A和参考[1]). 接下来，我们研究了Melan-A特异性T细胞的特性是否是自身/肿瘤特异性T淋巴细胞的一般特征。在我们的黑色素瘤项目框架内，一些患者同时接种了来自Melan-A、NY-ESO-1和MAGE-A10的三种不同短肽[31]。我们可以分析四名患者对所有三种肽具有体外可检测的CD8 T细胞反应。与Melan-A和病毒特异性T细胞之间观察到的不同模式相反(图S3A)NY-ESO-1-和MAGE-A10特异性T细胞的模式与黑色素A特异性T淋巴细胞相似，八种抑制性受体中的任何一种都没有显著差异( 图3 和S4系列). 此外，这四名患者的黑色素A特异性T细胞与第一组分析的黑色素A-特异性T淋巴细胞高度相似(图S3A和S4系列). 这一观察表明，在肿瘤特异性T细胞中观察到的特殊表达模式要么是自身/肿瘤特异性细胞的一般特性，要么是疫苗诱导的。

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自身/肿瘤特异性T细胞上抑制受体的表达。

来自代表性患者的黑色素-A、NY-ESO-1和MAGE-A10特异性T细胞的抑制性受体的表达（LAU 1169）。使用磁珠分选富集CD8 T细胞。通过四聚体染色鉴定黑色素-A-（黑色）、NY-ESO-1-（绿色）和MAGE-A10-（蓝色）特异性CD8 T细胞，如材料和方法第节。同型控制（灰色）显示为参考。

微环境对抑制性受体表达的影响

肿瘤微环境可能强烈影响蛋白质表达，包括抑制受体[1]因此，我们比较了PBMC和肿瘤浸润淋巴结（TILN）的T细胞。与血液相比，我们观察到从TILN获得的CD8总T细胞中LAG-3、CTLA-4和TIM-3上调，KLRG-1和CD160下调( 图4A ). 由于TILN中的许多CD8总T细胞可能是肿瘤特异性的，我们的数据表明它们经常表达抑制性受体，如CTLA-4、LAG-3、PD-1、TIM-3、BTLA和2B4。

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来自血液和肿瘤浸润淋巴结（TILN）的CD8 T细胞的抑制性受体表达。

（A） CD8总T细胞的共表达分析。饼图弧线的颜色表示单个抑制受体的表达，而饼图中的颜色表示共同表达的抑制受体的数量。用SPICE 5.2分析共表达。染色1和染色2的n=9/8（TILN）和31/17（血液）。（B） 黑色素A-（红色）和EBV-（黑色）特异性CD8 T细胞。抑制受体的阳性率分别定义为同型对照。血样来自接种CpG-ODN或不接种CpG-ODN的患者。n=20/21（血液；黑色素-A/EBV）和n=9/6（TILN；黑色素A/EBV），用于染色1；除BTLA外，染色2的n=23/24（血液；Melan-A/EBV）和n=8/5（TILN；Melan-A/EBV。

肿瘤细胞的存在可能会对TILN中肿瘤特异性和非肿瘤特异性T细胞产生不同的影响。与血液中的对应物相比，TILN中的黑色素A特异性T细胞表达较少的KLRG-1，但更多的TIM-3、LAG-3和CTLA-4( 图4B 、红色和图S5A). 尽管TILN衍生的CD8 T细胞表达的PD-1比循环细胞中的PD-1多，但我们在CD160、BTLA、2B4和PD-1的表达方面没有观察到显著差异[36]总的来说，TILN中的黑色素A特异性细胞的抑制受体表达高于血液中的细胞。这一观察结果与我们最近的发现相符，即TILN中的黑色素A特异性T细胞显示耗竭特征，即与耗竭的T细胞相匹配的基因表达特征，与细胞因子生成受损和抑制受体表达增强有关[1].

为了研究淋巴结微环境对非肿瘤特异性T细胞的影响，我们分析了来自TILN的EBV特异性T淋巴细胞( 图4B ，黑色和图S5B). 这些细胞不应（或更少）受到转移淋巴结中肿瘤细胞的影响，因为它们不是肿瘤特异性的，而可能与正常淋巴结细胞相互作用。有趣的是，与血液相比，我们发现TILN中EBV特异性T细胞表面的抑制受体受到调节( 图4B )，部分类似于Melan-A特异性T细胞。特别是，我们发现TILN中KLRG-1和CD160下调。同样对于2B4，我们观察到TILN的表达较低–绝对差异很小，但仍然显著。相反，LAG-3和CTLA-4均上调，反映了Melan-A特异性T细胞。值得注意的是，与Melan-A特异性T细胞相比，TIL-3在来自TILN的EBV-特异性T-细胞上的表达没有变化。

总的来说，这些结果表明微环境对总CD8和抗原特异性T细胞上几种抑制性受体的表达有重大影响。与血液相比，KLRG-1的下调与TILN中LAG-3和CTLA-4的上调密切相关。表面表达的其他变化，例如黑色素-A特异性T细胞中TIM-3的上调或EBV-特异性T-细胞中CD160的下调可能是抗原特异性效应。

几种抑制性受体配体在黑色素瘤病变中表达

抑制受体与各自配体的结合(表S1)可能是抑制T细胞功能所必需的。为了确定这些配体是否在黑色素瘤转移中表达，我们对16至18个石蜡包埋肿瘤切片进行了免疫组化分析( 图5A ). 除了一个例外，所有肿瘤都被CD8 T细胞浸润（3/18强，14/18中）。大多数肿瘤表达细胞内CD80（100%）、HVEM（93%）和CD86（88%），9/17至少表达三种配体MHC II类、PD-L2和半乳糖凝集素-9中的一种( 图5B ). 相反，只有2/17的肿瘤切片显示E-cadherin的表达。8个肿瘤可用于分析所有7种配体的表达。所有这些病变均表达至少三种，3/8表达至少四种受试配体。肿瘤浸润淋巴细胞不仅与肿瘤细胞本身相互作用，还与肿瘤周围的基质相互作用。因此，在肿瘤基质中表达的抑制性受体的配体也可能对淋巴细胞功能产生负面影响。在肿瘤微环境中，我们发现大多数病例中表达MHCⅡ类和分泌半乳糖凝集素-9的细胞，在一些病例中表达CD80和PD-L2的细胞( 图5B 和数据未显示）。同时，我们通过流式细胞术分析了15个黑色素瘤患者转移组织产生的黑色素瘤细胞系。大多数细胞表面表达PD-L1、PD-L2、MHC II和HVEM，但不表达CD48( 图5C ). 证实了我们在石蜡切片上的结果，E-钙粘蛋白在黑色素瘤细胞系上很少表达，这与转移瘤细胞已知的E-钙黏蛋白下调一致[37]并且对应于TILN中发现的CD8 T细胞对KLRG-1的表达减少( 图4 ). 7个细胞系也进行了细胞内表达分析。与石蜡切片相比，所有黑色素瘤细胞株均表达胞内半乳糖凝集素-9。7／7株系表达细胞内CD86，但无一株表达CD80。尽管在肿瘤切片和黑色素瘤细胞系中观察到抑制性受体配体的表达存在很大的异质性，但所有样本至少表达了其中的一些配体，这表明T细胞功能的这种负调控通常与肿瘤微环境有关。

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黑色素瘤转移瘤和黑色素瘤细胞系中抑制受体配体的表达。

（A，B）用免疫组织化学方法对16～18个肿瘤石蜡包埋切片进行7种抑制性受体和CD8的染色。（A） 研究的每个配体的代表性染色（放大×200）。（B） 免疫组织化学染色总结以阳性样本的百分比表示。低表达（<10%）、中等表达（int；10-50%）和高表达（>50%）用色阶表示。infit：肿瘤细胞巢内CD8 T细胞浸润；sec：分泌，即galectin-9的胞内和胞外存在。（C） 黑色素瘤细胞系在表面或细胞内（ic）的表达总结，以阳性细胞系的百分比表示。

讨论

抑制性受体的过度上调在控制活化的T细胞和防止细胞毒性T细胞对组织的损伤中发挥着许多作用。尽管抑制受体下游的信号级联可能重叠，但它们的功能并不一定冗余。它们的表达受T细胞激活状态的不同调节，这一事实证明了不同抑制受体的不同功能。

有趣的是，T细胞分化对个体抑制性受体的表达有不同的影响。在研究的八种抑制性受体中，只有两种，即BTLA和TIM-3，在幼稚阶段已被明确检测到( 图6 ). BTLA在原始细胞中最高，在EMRA细胞中最低，TIM-3在原始细胞和EMRA细胞上居中，在中枢和效应记忆细胞上较低。许多基因是沿着T细胞分化进行调节的[3],[38]显然，抑制性受体根据分化状态发挥不同的作用，也可能影响记忆与效应细胞分化[4],[5],[39]根据此处描述的表达模式，BTLA和TIM-3对原始T细胞已经很重要，不排除在分化细胞中的重要功能，而PD-1、CTLA-4、KLRG-1、2B4、LAG-3和CD160主要调节分化T细胞的功能。

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根据分化状态和物理位置的抑制性受体共同表达示意图。

幼稚细胞表达BTLA和TIM-3。肽疫苗接种后，Melan-A特异性T细胞上调KLRG-1、2B4、TIM-3和PD-1，同时下调BTLA。总CD8 T细胞上调类似的抑制受体，但PD-1和TIM-3较少。他们还表达CD160，而肿瘤特异性T细胞不表达CD160。在TILN中，总CD8 T细胞（在很大程度上是肿瘤特异性的）和黑色素a特异性T细胞下调KLRG-1（以及总CD8 T-细胞CD160），同时表达更多PD-1、LAG-3、TIM-3和CTLA-4。

与CD8总T细胞相比，肿瘤抗原Melan-A特异性的非原始细胞表现出不同的表达模式，主要是TIM-3和PD-1较多，CD160较少( 图6 ). 启动后，黑色素A特异性T细胞上的抑制性受体共同表达的特殊性被诱导，因为来自健康供体的黑色素A特异性T细胞表达的抑制受体与总的原始T细胞非常相似。强效启动，如CpG ODN 7909诱导KLRG-1和TIM-3的上调，以及伴随的BTLA的下调[9]与缺乏TLR-9激动剂CpG时的低效启动相比。

确认我们之前的报告[1]与肿瘤抗原特异性细胞相比，病毒抗原BMLF1（EBV）和pp65（CMV）特异性CD8 T细胞显示出不同的抑制受体模式。除了它们的特异性外，病毒特异性T细胞和肿瘤特异性T淋巴细胞之间的差异也可能是由于它们的不同起源。与EBV-和CMV-特异性T细胞不同，所研究的Melan-A特异性T-细胞是通过接种诱导的，疫苗成分可以直接影响抑制性受体的表达，正如我们使用CpG-ODN所证明的那样。由于我们无法测试其他佐剂或疫苗制剂的影响，目前尚不清楚CpG-ODN的作用是否特别强烈，考虑到CpG-ODN促进的异常强烈的T细胞激活，情况很可能就是这样[32]为了进一步表征疫苗介导的效果，研究疫苗诱导的抗病毒免疫反应将很有意义。这可以通过接种黄热病或天花疫苗来实现，众所周知，这些疫苗可以诱导强大的CD8 T细胞反应[40],[41]由于这些疫苗使用的是减毒活病毒，而不是我们研究中使用的肽疫苗，因此可能会发现不同的模式。然而，抑制性受体的高表达可能主要取决于疫苗生成效应细胞的能力，这对于CpG-ODN佐剂疫苗和活疫苗来说是很高的。

基于其高前兆频率[35]有人认为，黑色素A特异性T细胞是不寻常的，不代表其他肿瘤抗原特异性T淋巴细胞。然而，NY-ESO-1和MAGE-A10（另外两个前体频率较低的肿瘤抗原特异性T细胞群）的特异性细胞在抑制受体的表达方面与Melan-A特异性T淋巴细胞相当，认为较高的TIM-3和PD-1表达和较低的CD160表达是自身/肿瘤特异性T细胞的一般特征。

除了抗原特异性和T细胞刺激类型外，还发现微环境强烈影响CD8 T细胞上抑制性受体的表达。与血液中具有相同特异性的细胞相比，来自TILN的肿瘤特异性T细胞KLRG-1表达较低，而TIM-3、LAG-3和CTLA-4表达较高( 图6 ). 对TILN中EBV特异性T细胞的分析表明，LAG-3和CTLA-4（而不是TIM-3）的上调和KLRG-1的下调至少部分归因于淋巴结的微环境。为了进一步研究这种调节在多大程度上是由存在的肿瘤细胞所诱导的，以及有多大程度是由淋巴结中正常存在的微环境所引起的，需要利用正常淋巴结和非淋巴结转移或原发肿瘤样本进行实验。

抑制T细胞功能取决于抑制受体与其配体的相互作用。因此，我们分析了肿瘤微环境中是否存在相应的配体。在大多数患者中，我们发现了多种配体，如PD-L2、galectin-9、HVEM、MHC II类、CD86和CD80，但没有发现E-cadherin。这些配体在转移病灶中的存在，以及肿瘤特异性CD8 T细胞上抑制受体的上调，很好地符合前面描述的功能缺陷[42]转移病灶中肿瘤特异性T细胞的耗竭特征[1]然而，一些配体的表达主要是细胞内的，这就为最终的低水平表面表达和功能影响留下了疑问。有必要进行进一步研究，以详细说明每种受体与相互作用的确切贡献[43].

总之，我们发现抗原特异性T细胞上的抑制性受体共同表达强烈依赖于其分化状态、抗原特异性和肿瘤微环境。这些数据支持对多种抑制性受体进行治疗性阻断的合理性，其目的是增加抗原特异性T细胞的潜力，从而赋予癌症和感染免疫力。

支持信息

图S1

总CD8 T细胞中的门控策略和抑制受体表达。（A） 选通策略。分析了抑制性受体在总CD8+T细胞、初始、中枢记忆、效应记忆和效应记忆RA+细胞（基于CCR7和CD45RA表达）以及四聚体阳性细胞上的表达。染色1和染色2均含有四种针对四种不同抑制受体的抗体（上部直方图）。同型对照用作阴性对照（低直方图）。（B） 使用磁珠对PBMC进行CD8富集。天真（N）、中央记忆（CM）、效应记忆（EM）和效应记忆RA+（EMRA）细胞由CCR7和CD45RA的表达定义。抑制受体的阳性率分别定义为同型对照。p值表示单向方差分析测试的结果。

（畅通节能法）

图S2

引发对抑制性受体表达的影响。使用磁珠对健康献血者（HD）或患者在接种疫苗之前（接种疫苗之前）或肽+IFA疫苗之后（有或没有CpG-ODN）的样本进行CD8富集。使用CD8特异性抗体和四聚体鉴定黑色素A特异性T细胞，如材料和方法第节。抑制受体的阳性率分别定义为同型对照。p值表示单向方差分析测试的结果。

（畅通节能法）

图S3

肿瘤和病毒特异性CD8 T细胞上抑制性受体的表达。使用磁珠富集患者血液样本中的CD8 T细胞。通过CD8-特异性抗体和四聚体染色来鉴定黑色素-A-、CMV-和EBV-特异性CD8 T细胞，如材料和方法第节。抑制受体的阳性率分别定义为同型对照。Melan-A-的n=11/14/9，CMV-的n=7/8/3，EBV-特异性T细胞的n=15/18/8（染色1/LAG3、2B4/BTLA、CTLA-4）。（B） 基于A中显示的八种抑制性受体共同表达的层次聚类，包括CD8总T细胞的四个分化亚群（N、CM、EM、EMRA）。（C） 基于（B）中相同数据的主成分分析。椭圆代表80%的人口水平，而交叉表示每个人口的平均水平。黑色素A特异性细胞表示为没有椭圆的黑点。

（畅通节能法）

图S4

自身/肿瘤特异性CD8 T细胞上抑制受体的表达。使用磁珠富集四名患者的PBMC中的CD8 T细胞。通过CD8-特异性抗体和四聚体染色，鉴定了Melan-A-、NY-ESO-1-和MAGE-A10特异性CD8 T细胞，如材料和方法第节。抑制受体的阳性率分别定义为同型对照。

（畅通节能法）

图S5

微环境对抑制性受体表达的影响。使用磁珠对接种（红色）或不接种（黑色）CpG-ODN的患者的样本进行CD8富集。使用CD8特异性抗体和四聚体鉴定黑色素A特异性T细胞，如材料和方法第节。抑制受体的阳性率分别定义为同型对照。

（畅通节能法）

表S1

抑制受体和确定的配体。对于所研究的八种抑制受体中的每一种，列出了已知配体。

（PDF格式）

致谢

我们感谢患者和献血者的专注合作。我们衷心感谢L.J.Old、J.O'Donnell-Tormey、G.Berthod、E.Romano、R.-O.Mirimanoff、O.Matzinger、H.Bouchaab、K.Homicsko、T.Zingg、B.Chevaux、A.Zyska-Cherix、B.Meirer、N.Lang、N.Gay、I.Dischl-Antonionionio和V.Cristina的贡献，以及H.R.MacDonald、D.Zehn、P.Ohashi、P.Romero、J.Skipper、H.F.Oettgen和A。Krieg表示支持，P.Schneider、L.De Leval、I.Letovanec、P.Yan、L.Cagnon、C.Geldhof、M.van Overlop、E.Devevre、H.A.Lehr、M.Braun、L.Delre、M.Iancu、T.Lövgren、K.Servis、L.Pan和R.Venhaus表示合作。我们感谢P.Guillaume和I.Luescher的四聚体，J.-M.Tiercy和V.Aubert的HLA分型。

脚注

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

基金：这项工作得到了美国路德维希癌症研究所、癌症研究所和癌症疫苗合作组织、瑞士OPO-Stiftung（2010/11-0039）、瑞士癌症联盟（02279-08-2008）、瑞士国家科学基金会（3200B0-118123）、，以及瑞士国家研究能力中心（NCCR）分子肿瘤学。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

工具书类

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