成人β细胞复制的调节性和可逆性诱导

摘要

人体β细胞的体内或体外扩增是糖尿病研究的一个重要但尚未实现的目标。这一概念推动了在人胚胎干细胞和诱导多能干细胞分化、异种胰岛移植来源、尸体β细胞的扩增和存活以及高通量小分子筛选方面的积极研究计划，希望找到能够实现β细胞替代治疗的方法。不幸的是，成人β细胞已被证明难以通过生长因子、营养信号通路和诸如部分胰腺切除、诱导胰岛素抵抗、妊娠和高脂肪喂养等操作诱导增殖(1–7)均能诱导啮齿动物β细胞显著增殖。因此，研究人员将复制型顽固性成人尸体胰岛作为研究β细胞替代的主要起始材料。

我们已经证明，通过传递细胞周期分子，如细胞周期依赖性激酶6（cdk6）和细胞周期蛋白D，可以使用体外和体内模型，驱动成人β细胞强劲复制₁(8–11). 这样可以保留分化功能，如葡萄糖刺激的胰岛素分泌，并且对生存没有明显的不利影响(8–11). 这些研究的一个缺点是，它们是使用cdk6和cyclin D的持续过度表达来进行的₁由腺病毒载体中的组成性巨细胞病毒（CMV）启动子驱动，引起了对长期致癌转化的关注。

有趣的是，一些研究小组已经表明，尽管复制速度相对较慢，但在胚胎和新生儿胰腺中的围产期复制会持续数月(12–14). 这些观察结果表明，试图模拟正常的围产期人β细胞增殖和扩增的策略可能具有治疗应用价值。因此，在当前的研究中，我们询问是否可以诱导方式激活成人β细胞增殖，一旦达到所需的β细胞质量，是否也可以恢复细胞周期阻滞（即降低致癌风险），所有这些都使用类似于人类胰腺发育事件的时间曲线。虽然cdk6和cyclin D都是₁能够在体外单独驱动人类β细胞复制(9,10)，我们选择了cdk6和cyclin D₁在本研究中，在几个cdk-cyclin对选项中进行组合，因为这种组合比单独使用任何一种都能产生更大的增殖，并且因为我们已经在链脲佐菌素-糖尿病NOD-严重联合免疫缺陷模型中对这种组合进行了体内试验(9,10).

研究设计和方法

人类胰岛由美国国立卫生研究院（NIH）和青少年糖尿病研究基金会（JDRF）支持的综合胰岛分布计划（IIDP）以及Tatsuya Kin博士（加拿大艾伯塔省埃德蒙顿阿尔伯塔大学临床胰岛实验室）获得。如前所述，进行了腺病毒制备、免疫印迹、葡萄糖刺激胰岛素分泌、cdk和cyclin表达研究以及增殖和存活研究(8–11,15,16)以及图中的图例。结果以平均值±SEM表示。统计差异由双尾、未配对的学生确定t吨测试或通过ANOVA进行重复测量，并进行事后分析，如图图例所示。

结果

Cdk6和细胞周期蛋白D₁可以在用tet诱导型腺病毒转导的人β细胞中以剂量依赖性的方式过表达。

人类胰岛用一种腺病毒转导tet反式激活子（Ad.TTA）和一种表达绿色荧光蛋白（Ad.GFP）的对照腺病毒或表达cdk6或cyclin D的腺病毒₁在tet响应元件（Ad.TRE-cdk6或Ad.TRE-cyclin D）的控制下₁). 向培养基中添加越来越多的强力霉素（Dox）（0-1μg/mL），以确定cdk-6和细胞周期蛋白D的剂量反应性₁表达式。图1显示cyclin D₁或cdk6，或两者都随着Dox浓度的增加而显著增加，稳定在0.1μg/mL Dox。仔细检查表明cdk6和cyclin D₁在没有Dox的情况下以低水平表达。例如，对照组（Ad.GFP-转导）胰岛表达了Ad.TRE-cdk6表达的最大cdk6量的12.2%（含0.1μg/mL Dox），而未接触Dox的Ad.TRE-cdk6则表达了最大cdk量的23%；类似地，Ad.GFP转导的胰岛和Ad.TRE-cyclin D₁无Dox组表达2.7%和13.9%的最大细胞周期蛋白D₁级别。这表明TRE启动子有一些“泄漏”，但低于与增殖激活相关的水平（见下文）。

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图1。

剂量相关、Dox诱导的cdk6或cyclin D表达₁来自人类胰岛Ad.TRE。一和B类：诱导的cdk6或cyclin D的免疫印迹₁如图所示，用腺病毒转导72小时后，在完整的人类胰岛中分别表达，并用或不加剂量的Dox治疗。cdk6和cyclin D的交付₁使用HA表位标签确认。C类和D类：密度定量一和B类(n个= 5). 数值表示为Dox 0.1组的百分比。P（P）值是指与未配对学生确定的Ad.GFP-Ad.TTA控制相比，所示条的重要性t吨测试。误差条显示SEM。人类胰岛供体信息如下：平均年龄43.7±2.1岁；性别16男17女；体重指数27.5±0.9；纯度68.7±3.5%。除非另有说明，否则将胰岛保存在含有5.5 mmol/L葡萄糖、10%无tet-free FBS（Clontech，Mountain View，CA）和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。在这个tet-on系统中使用了两种类型的腺病毒。在第一种情况下，TTA由CMV启动子驱动。在第二种情况下，编码人类细胞周期蛋白D的cDNA₁或人类cdk6由TRE控制。cdk6和cyclin D₁构建物包含HA表位标签。腺病毒是用pJM17产生的(8,9)和改良的pAC-CMVpLpA(8,9). 在Ad.TRE-cdk6和Ad.TRE-cyclin D中₁病毒，pAC CMVpLpA质粒中的CMV启动子被MfeI取代-生态来自Tet-On系统（Clontech）的pTRE-Shuttle2的RI启动子片段，现在称为pAC-TRE，以及cdk6-HA和HA-cyclin D₁cDNA连接到pAC-TRE。类似地，将来自pTet-On Advanced（Clontech）的反向TTA的cDNA亚克隆到pACCMVpLpA中以产生TTA腺病毒。在RPMI 1640培养基中用腺病毒转导完整的胰岛，共感染250次（MOI）（150次Ad.TRE/100次Ad.TTA MOI），转导时间为1小时。在一些实验中，胰岛在37°C下通过胰蛋白酶溶解10分钟。添加完整培养基以停止消化。这些单个分散的人类胰岛细胞被镀在24孔板中的12 mm玻璃盖玻片上，并在完整培养基中以150 MOI（每种病毒50 MOI）转导2 h。转导后立即向培养基中添加Dox，并每隔一天更换一次，如图所示。（该图的高质量彩色表示可在在线期刊上找到。）

为了确定诱导的最佳时间进程，将人胰岛转导，置于含有1μg/mL Dox的培养基中，然后在24、48或72小时后收获。补充图1表明这两种细胞周期蛋白在72小时内迅速增加。72小时后没有进一步增加（未显示）。

Dox诱导人β细胞增殖。

在盖玻片上分离的分散胰岛上使用激光共焦显微镜，我们检测了BrdU掺入胰岛素⁺细胞。在图2一，阴性对照（Ad.TRE-cdk6和Ad.RE-cyclin D₁没有Dox，或Ad.GFP和Dox）没有显示腺病毒衍生的cdk6或cyclin D表达₁（无白色血凝素[HA]表位标记染色）。另一方面，cdk6/cyclin D₁Dox在右侧面板中明显诱导了染色（白色HA标签）。重要的是，很明显腺病毒在β细胞中表达，因为白色HA标签在许多绿色胰岛素中共定位⁺细胞。最重要的是，BrdU染色在表达cdk6/cyclin D的人β细胞中显著可见₁在右下面板中，HA染色已从合并图像中分离出来，以更清楚地显示胰岛素中的BrdU染色⁺细胞。

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图2。

转导cdk6和cyclin D的人胰岛增殖₁腺病毒。一：将分散的人类胰岛用所示的腺病毒（与Ad.TTA结合）进行电镀并转导，培养基中无Dox（白色边界）或1μg/mL Dox（粉红色边界）。培养3天后，将BrdU加入培养基中，18小时后固定细胞。用激光共聚焦显微镜对分散的胰岛进行免疫染色并观察胰岛素、BrdU和HA（这表明腺病毒衍生的cdk6或cyclin D₁，两者都包含HA表位标签）。右下面板中的箭头表示BrdU-阳性β-细胞。放大倍数为40倍。B类：免疫组织化学定量一(n个= 13). 每个条形图下的数字是指每个条件下计数的β细胞数。P（P）值是指与使用Student unpaired的Ad.GFP/Ad.TTA控件相比，所示条的重要性t吨测试。误差条显示SEM。BrdU（1:1000稀释）（GE Healthcare，Pittsburgh，PA）在室温下在磷酸盐缓冲盐水中的4%多聚甲醛中固定10分钟之前18小时加入到胰岛培养基中。用抗BrdU抗体1:500（Abcam，Cambridge，MA）、抗胰岛素抗体1:1000（DAKO，Carpindia，CA）、抗cdk6抗体1:100（Santa Cruz，Santa Cruz，CA）和抗细胞周期蛋白D对细胞进行免疫染色₁抗体1:100，抗HA抗体1:50。使用Alexa Fluor二级抗体（Invitrogen，Carlsbad，CA）在Olympus Fluoview 1000共聚焦显微镜上观察染色。根据制造商的说明，使用DeadEnd荧光测量TUNEL系统（加利福尼亚州圣路易斯奥比斯波市Promega）评估细胞死亡。对于阳性对照组，细胞在室温下暴露于27单位的DNAse-I中10分钟，或在细胞因子治疗的情况下，在无血清培养基中暴露于200单位/mL IL-1β、1000单位/mL TNF-α和1000单位/mL IFN-γ中24小时(三). 只有细胞核完全被胰岛素染色包围的BrdU染色的细胞才被视为BrdU阳性β细胞。（该图的高质量数字表示可在在线期刊上获得。）

使用13种不同的人类胰岛制剂重复这些实验，并进行量化，如图2B类可以看出，尽管胰岛素很少⁺细胞增殖（BrdU⁺)当用Ad.GFP或Ad.TTA+Ad.TRE-cyclin D转导时₁/cdk6在没有Dox的情况下，用Ad.TRE-cdk6/cyclin D转导β细胞₁在Dox剂量增加的情况下，β-细胞BrdU掺入量显著增加，从2.5%到10%不等。因此，可以通过剂量依赖性方式引入Dox来激活成人β细胞增殖。重要的是，葡萄糖刺激的胰岛素分泌不会受到增殖诱导的不利影响，胰岛素和pdx1 mRNA的表达也不会减少(补充图2).

去除Dox导致cdk6/cyclin D正常化₁人类胰岛增殖的表达和停止。

为了模拟正常的发育事件，并避免致癌问题，我们探讨了诱导的cdk6/细胞周期蛋白D是否以及诱导的速度₁可能会在Dox退出后下降。用腺病毒转导六种不同的人类胰岛制剂，并在含有1μg/mL Dox的完整培养基中培养3天，然后用磷酸盐缓冲盐水清洗，并添加无创培养基。然后立即（称为“第0天”）或在第7天收获岛屿。图3说明了这一点1)在6个人类胰岛标本中，cdk6和cyclin D₁在对照转染的人类胰岛中观察到的恢复到基线水平；和2)联合给药时（以及单独表达时，如补充图4)，他们都在停药后7天内恢复到基线水平。补充图4进一步表明，使用另外六种人类胰岛制剂1)人类胰岛的下降在一周内是渐进的，分别下降了82%和94%；和2)cdk6和cyclin D的下降₁无论是联合用药（如图3)或单独（如补充图4).

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图3。

cdk6和cyclin D的时间依赖性逆转₁表达式。一和B类：cdk6和cyclin D的逆转₁如cdk6和cyclin D所示，到第7天，在对照人类胰岛中观察到过度表达，并恢复到内源性水平₁免疫印迹以及HA表位标签的免疫印迹。C类和D类：对人类胰岛的六个单独实验的量化结果表明，在停药后，cdk6和cyclin D₁这种表达与正常人胰岛中的表达无明显区别。此外，请注意，在这些实验中，与补充图4其中cdk6和cyclin D₁腺病毒分别给药，两种病毒同时给药于每个人胰岛制剂。条形图表示平均值±SEM。cdk6和cyclin D的下降₁经单因素方差分析显著(P（P）对于cdk6和P（P）细胞周期蛋白D<0.001₁).P（P）条形图上显示的数值表示Dox治疗组第7天与第0天的差异。在第7天，各组之间没有统计学上的显著差异。（该图的高质量彩色表示可在在线期刊上找到。）

接下来，我们询问是否可以通过撤回Dox来逆转人类β细胞的增殖效应。图4一独立确认结果图2表明表达cdk6和cyclin D₁在β细胞中持续3天导致BrdU掺入增加（顶行）。它进一步证明，这种增殖在Dox存在的情况下持续至少10天（第二排）。值得注意的是，3天的Dox暴露和7天的洗脱完全消除了β细胞（第三排）的增殖（BrdU免疫染色）。当Dox再次引入时，β细胞的增殖迅速恢复（最下面一行）。在图4B类、BrdU数量⁺和胰岛素⁺对细胞随时间的变化进行量化，确认3天的Dox诱导了强劲的增殖，在Dox停药后7天内消失，并且可以通过再次暴露于Dox 3天重新诱导到之前的完全程度。

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图4。

转cdk6和cyclin D的人胰岛细胞增殖的可逆性₁去除Dox后的腺病毒。一：人胰岛（九种不同的制剂）的共聚焦显微镜观察，分散到单个细胞中，在盖玻片上铺板，并用指示的腺病毒转导3天（顶行）、10天（第二行和第三行）或13天（底行），在培养基中不含Dox（白色方框）或含1μg/mL Dox（粉色方框）。胰岛细胞与Dox孵育3天，然后进行7天的洗脱期（第三排），然后再与Dox再暴露3天（最后一排）。固定前18 h将BrdU加入培养基中。对分散的胰岛进行胰岛素（绿色）、BrdU（红色）和腺病毒传递的cdk6或cyclin D的免疫染色₁（由白色HA表位标签指示）。放大40倍。B类：免疫组织化学定量一.每个条形图下的数字是指每个条件下计数的β细胞数。使用未配对学生进行比较t吨测试(*P（P）<0.05）或通过Tukey事后分析的单向方差分析(**P（P）< 0.05). 误差条表示SEM。（该图的高质量数字表示可在在线期刊上获得。）

讨论

这些研究集中于两个主要目标。首先，他们试图确定是否有可能可逆地激活、灭活和重新激活人类β细胞复制。其次，他们试图以一种模仿人类胎儿β细胞复制的时间序列的方式来完成这项工作，在数周或数月内激活增殖，然后让β细胞恢复静止。研究结果提出了新的观点，即确实有可能诱导并暂时激活成人β细胞复制，暂时模拟人类胎儿β细胞的正常增殖事件，并以一种可能避开致癌问题的方式这样做，同时保持β细胞的功能和存活。

我们已经证明了G1/S分子家族的几个成员，如cdk6和cyclin D₁，能够有效推动成人β细胞周期进展(8–11). 值得注意的是，我们还发现当移植到免疫缺陷糖尿病小鼠体内时，cdk6-和cyclin D₁–过度表达的人类β细胞继续增殖6–8周，并以实际改善β细胞功能/血糖控制的方式增殖(9,10). 尽管这些先前的研究很有希望，但也令人担忧，因为他们使用组成型CMV启动子进行腺病毒转导，从而实现持续表达。这引发了一个现实的担忧，即cdks和cyclin的持续过度表达，其中许多在其他情况下是公认的致癌基因，可能导致暴露于这些药物的移植胰岛中形成肿瘤。

目前的第一个目标是开发一种可逆诱导、逆转、然后重新激活活跃的人类β细胞复制的方法。这些发现表明，确实有可能可逆激活并阻止人类β细胞复制，这些事件为缓解与持续细胞周期激活相关的致癌问题提供了希望。

第二个目标，模仿人类正常发育过程中发生的短暂增殖，也实现了。Dox能够激活，其退出失活，其重新引入可重新激活成人β细胞复制。我们使用的时间跨度（3天、7天和10天）比正常发育时的时间跨度短（几周到几个月），但随着多克斯暴露时间的延长，进一步延长增殖显然是可能的，因为我们已经证明，使用这些方法可以延长（2个月）诱导人类β细胞复制(9,10,15). 本文中的增殖率与先前研究中组成型CMV启动子腺病毒的增殖率相当(9,10). 值得注意的是，我们还能够实现与人类胰腺发育过程中所观察到的增殖速度相当或超过的增殖速度(12–14). 这些观察结果支持这样的观点，即在5%范围内诱导人类β细胞复制2至3个月可能足以扩大人类β细胞的内源性和体外来源。

这些研究也有局限性。一是他们使用基因治疗技术，因此不太可能直接用于人类糖尿病治疗。因此，它们作为基本研究的证据，证明了治疗性、可逆的人类β细胞扩增是可能的，并为寻找小分子、生长因子、营养素和信号通路提供了额外的动力和目标，这些途径将驱动成人β细胞的扩增，无论是来自尸体还是干细胞来源。另一个限制是没有进行体内移植研究。然而，因为这些实验既昂贵又耗时，而且我们在之前的两项研究中已经表明，移植表达cdk6和cyclin D的人类胰岛₁与对照人胰岛相比功能优越(9,10)，通过这些实验获得的增量知识将是微乎其微的。

总之，这些研究表明，以调节的方式诱导成人β细胞的强劲复制并逆转这种复制，减轻致癌问题并模拟发育中人类胰腺中正常发生的短暂β细胞增殖，在技术上是可行的。这些研究表明，随着β细胞周期靶点清单的扩大，以及小分子筛选的进展，调节成人β细胞的增殖是一个可行的目标。

致谢

脚注

参考文献